全 文 ：1 ,2 ,42三氯苯胁迫对萌发大豆种子中活性氧的影响 3
刘　宛 3 3 　孙铁珩　李培军　周启星　梁文举　台培东　许华夏　张海荣
(中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110016)
【摘要】　以盆栽法研究了不同浓度 1 ,2 ,42三氯苯 ( TCB) 胁迫对萌发大豆种子中活性氧代谢的影响. 结果
表明 ,100～300μg·g - 1 TCB 胁迫初期 (1～3 天)促使萌发大豆种子呼吸强度升高及其峰值提前出现 ,超氧
阴离子自由基 (O2 -1)及过氧化氢 ( H2O2)的积累显著增加 ,同时伴随丙二醛 (MDA)含量升高 ,显示发生膜脂
质过氧化作用. TCB 胁迫 1～6 天使活性氧清除酶功能紊乱 ,其中过氧化物酶 ( POD)活性升高 ,超氧化物岐
化酶 (SOD)活性开始上升后转为下降. 在萌发大豆种子受 TCB 胁迫伤害过程中 ,活性氧代谢失衡造成的
膜脂质过氧化将起着重要作用.
关键词 　1 ,2 ,42三氯苯胁迫 　大豆种子 　活性氧 　膜脂质过氧化 　抗氧化酶
文章编号 　1001 - 9332 (2002) 12 - 1655 - 04 　中图分类号 　X173 　文献标识码 　A
Effects of 1 , 2 , 42trichlorobenzene stress on active oxygen in germinated soybean seeds. L IU Wan , SUN
Tieheng ,L I Peijun , ZHOU Qixing ,L IAN G Wenqu , TAI Peidong , XU Huaxia , ZHAN G Hairong ( Institute of
A pplied Ecology , Chinese Academy of Sciences , S henyang 110016) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2002 ,13 (12) :1655
～1658.
Pot culture experiment on the effects of 1 ,2 ,42trichlorobenzene ( TCB) stress on active oxygen metabolism of
germinated soybean seeds indicated that during the beginning (1st～3rd day) of 100～300μg·g - 1 TCB treat2
ment ,the respiratory peak appeared earlier ,and the respiratory rate ,the accumulation of superoxide radical (O2 -1)
and H2O2 ,as well as the malondialdehyde (MDA) content were all enhanced. During 1～6 days of TCB stress ,
peroxidase ( POD) activity gradually increased ,and superoxide dismutase (SOD) activity increased firstly ,and de2
creased afterward. These results suggested that the injury effects of TCB stress on germinated soybean seeds
were achieved by excessive accumulation of active oxygen resulted from the degradation of active oxygen scaveng2
ing enzyme system.
Key words 　1 ,2 ,42trichlorobenzene stress , Soybean seeds , Active oxygen , Membrane2lipid peroxidation , An2
tioxidant enzymes. 3 国家重点基础研究发展规划项目 ( G19990118) ,中国科学院知识
创新工程项目 ( KZCX22401 , KZCX22SW2416 ,SCXZD0103) 及中国科
学院陆地生态过程重点实验室和沈阳生态实验站资助项目.3 3 通讯联系人.
2002 - 01 - 24 收稿 ,2002 - 04 - 24 接受.
1 　引 　　言
氯苯、1 ,22二氯苯、1 ,4 2二氯苯和 1 ,2 ,4 2三氯
苯等氯苯类化合物在工业、农业、医药生产中用途广
泛 ,亦是重要的环境污染物和国际公认的危险化学
品. 美国国家环保局已将 25 种氯苯类化合物列入优
先控制污染物黑名单[5 ] . 我国该类化合物污染非常
严重 ,在沈阳等城市及其周边地区的土壤及地下水
检测浓度均较高[17 ] ,导致农产品中该类化合物的积
累 ,并通过食物链危害人类健康. 因此 ,研究这些污
染物对生态系统可能带来的负面影响及其机理具有
重要的理论和现实意义.
在逆境胁迫下 ,生物体内活性氧的代谢平衡被破
坏 ,造成活性氧的过量积累 ,进而引发或加剧膜脂过
氧化作用 ,使细胞膜系统的结构和功能变劣 ,新陈代
谢紊乱. 这在由 NaCl、O3、NOx、SO2 和重金属等逆境
胁迫[1～4 ,9 ,10 ,13 ,16 ,20 ,21 ]引起的植物细胞膜伤害过程中
已有较多报道.但在 TCB 胁迫下 ,有关植物细胞内活
性氧及其抗氧化酶系统的变化情况国内外未见报道.
本文研究了 TCB 对萌发大豆种子中活性氧代谢的影
响 ,以探讨 TCB 胁迫对植物的毒性机理.
2 　材料与方法
211 　试验材料与设计
大豆 ( Glycine max ) 品种为沈农 91244 号. TCB 纯度为
99. 5 % ,购自 Fluka Chemie AG公司. 所用土壤采自中国科学
院沈阳生态试验站大豆小区 (0～20cm 耕层) . 其有机质含量
为2. 21 % ,全 N 含量 0. 12 %.用 2ml 丙酮溶解的下列浓度 TCB
加水 3ml 摇匀后直接投配至 600g 土壤中 ,混匀. 大豆种子经
0. 1 %HgCl2 表面消毒 5min ,去离子水冲洗干净并用滤纸擦干
后 ,分别播种于 0、100、200 和 300μg·g - 1 (风干土壤)的塑料杯
(直径 9. 5cm ,高 10. 5cm)中发芽 ,以蒸馏水和丙酮为对照. 大
豆种子萌发试验在避光、22 ℃下进行.分别取播种后 1 ,2 ,3 ,4 ,
应 用 生 态 学 报 　2002 年 12 月 　第 13 卷 　第 12 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Dec. 2002 ,13 (12)∶1655～1658
5 和 6 天的种子 (包括胚根、胚芽、胚轴及子叶)为材料 ,去种皮
后待用.各处理重复 3 次 ,所有试验重复两次.
212 　研究方法
21211 O2 -1产生速率测定 　取 1. 0g 鲜重萌发大豆种子 ,加入
5ml、65mmol·L - 1的磷酸缓冲液 (pH 7. 8) ,于 12000 ×g、4 ℃离
心 10min.取上清液 ,参照文献[14 ]的方法测定 O2 -1产生速率.
21212 H2O2 含量测定 　1. 0g 鲜重萌发大豆种子用 5ml 冷丙
酮研磨成匀浆 ,离心 (13000 ×g) 20min. 反应液中含 0. 1ml
20 %(V/ V) TiCl4的浓盐酸 ,0. 2ml 浓氨水和 1ml 上清液. 生
成的过氧化物2Ti 复合物用丙酮洗 5 次 ,丙酮挥发后溶于
3ml 硫酸 (1mol·L - 1) 中 ,测定 OD410 . 按同样程序制备 H2O2
标准曲线[12 ] .
21213 SOD 活性测定 　取 2. 0g 鲜重萌发大豆种子 ,加入
5ml 62. 5mmol·L - 1磷酸缓冲液 (p H 7. 8) 于冰浴上研磨 ,于
13000 ×g、4 ℃离心 20min ,上清液为酶液. 测定酶活性以单
位时间内抑制光化还原 50 %的氮蓝四唑 (NB T) 为一个酶活
性单位 (U) [3 ,6 ] .
21214 POD 活性测定 　酶液制备同 SOD. 测定方法采用愈
创木酚显色法[18 ] .
21215 MDA 含量测定 　MDA 提取同 SOD. MDA 含量测定按
文献[8 ]方法稍加修改. 1ml 提取液加 4ml 含 0. 5 %(W/ V)硫代
巴比妥酸的 20 %(W/ V)三氯乙酸溶液 ,沸水浴中煮 30min ,冷
却后离心 (10000 ×g , 15min) ,测定 OD532 和非特异吸收值
OD600 .按 155nmol - 1·cm - 1消光系数计算 MDA 含量.
21216 呼吸强度测定参照文献 [19 ]的方法.
3 　结果与讨论
311 　TCB 胁迫对萌发大豆种子呼吸强度的影响
　　图 1a 表明 ,在正常条件下 ,大豆种子萌发的开
始表现为呼吸代谢的加强 ,随着萌发时间的推进 ,呼
吸强度逐渐增强 ,至第 4 天达到高峰 ,随后由于贮藏
物质消耗以及生理生化代谢的下降 ,呼吸强度略有
降低. TCB 处理对萌发大豆种子的呼吸强度有明显
影响 ,100μg·g - 1 TCB 处理对大豆种子呼吸强度具
有促进作用 ,但处理 4 天后表现出抑制作用. 200～
300μg·g - 1 TCB 处理初期 (1～3 天)亦有明显促进作
用 ,而且呼吸高峰提前 ,但处理 3 天后 ,呼吸强度降
低 (图 1a) . TCB 处理后 6 天 ,大豆种子呼吸强度与
TCB 浓度之间呈显著负相关 ( y = - 0. 001 x +
0. 373 , r2 = 0. 972) . 呼吸底物的氧化分解可形成大
量 A TP 和中间产物 ,因此呼吸作用不仅与种子中贮
藏物质的分解有关 ,也与新物质的合成相关 ,且对其
他生理生化代谢过程也有重要影响. TCB 胁迫对大
豆种子呼吸作用的抑制必然会影响种子萌发过程中
的一系列生理生化变化及幼苗生长.
312 　TCB 胁迫对萌发大豆种子中活性氧代谢及
MDA 含量的影响
　　O2 -1是 O2 的单电子还原产物 ,是生物体内最初
形成的活性氧. 由图 1b 可知 ,在萌发开始的 1～4 天
内 ,对照组大豆种子 O2 -1产生速率逐渐上升 ,在第 4
天达高峰后略有降低 ,并基本维持在一个水平上.
100～300μg·g - 1 TCB 处理 1～3 天增加大豆种子
O2 -1产生速率 ,且 200 与 300μg·g - 1 TCB 两个高浓度
处理组使 O2 -1产生速率峰值提前至第 3 天 ,其最高
值分别为对照的 2. 3 倍和 2. 6 倍 ,差异极显著 ( P <
0. 01) . 这种变化趋势与种子呼吸速率的变化规律相
似. O2 -1作为一种活性很强的自由基 ,当积累到一定
水平后 ,必然会对植物代谢过程造成严重伤害. 这也
是 TCB 处理的大豆种子在出现呼吸高峰后即迅速
下降的主要原因之一.
　　植物细胞内的 H2O2 主要是由 O2 -1歧化而形成
的. 由图 1c 可以看出 ,萌发过程中大豆种子 H2O2 含
量的变化趋势与 O2 -1产生速率、种子呼吸强度基本
一致 ,均是先上升然后略有下降 ,三者的变化趋势相
似. TCB 处理 1～3 天明显增加大豆种子 H2O2 水
平 ,说明 TCB 胁迫对萌发大豆种子内 H2O2 积累有
明显的促进作用.
　　MDA 是膜脂质过氧化作用的最终产物 ,是膜系
统受伤害的重要标志之一. 图 1d 表明 ,萌发大豆种子
内 MDA 含量在 TCB 处理 1～3 天内上升缓慢 ,其含
量变化整体上略滞后于 O2 -1产生速率 ,而 4～6 天时
急剧上升 ,而且与 TCB 浓度间分别呈显著正相关 ,并
与对照组差异显著 ( P < 0. 05)或极显著 ( P < 0. 01) .
313 　TCB 胁迫对萌发大豆种子中抗氧化酶活性影响
　　由图 1e 可见 ,在正常条件下 ,大豆种子萌发初
期的 SOD 活性逐渐增强 ,上升约 2 倍后变化趋于平
缓. 100μg·g - 1 TCB 处理 1～4 天对萌发大豆种子
SOD 活性有明显的促进作用 ,但处理 4 天后即显示
抑制作用 ,200 与 300μg·g - 1 TCB 处理 2 天后即有
明显抑制作用 ,并随着处理时间延长而加剧.
　　POD 是植物呼吸代谢的末端氧化酶之一 ,可催
化有毒物质的氧化分解 ,是一种对环境因子十分敏
感的酶. 与过氧化氢酶不同的是需要另一个底物. 在
萌发初期 ,对照组大豆种子 POD 活性迅速增加 ,至
第 2 天活性达高峰 ,之后变化趋于平缓 ,维持在一个
相对稳定的水平 (图 1f) . TCB 胁迫对大豆种子 POD
活性有一定刺激作用 ,POD 活性随着处理浓度的升
高和胁迫时间的延长而升高. 处理后 6 天 ,200 和
300μg·g - 1 TCB 处理组大豆种子的 POD 活性分别
为 对照的152 %和170 % ,差异显著 ( P < 0 . 01) . 与
6561 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷
图 1 　TCB 胁迫对萌发大豆种子呼吸强度、自由基产生速率、H2O2 含量、丙二醛含量、SOD 及 POD 活性的影响
Fig. 1 Effect of TCB stress on respiratory rate ,O2 -1 production rate ,H2O2 contents ,MDA contents ,SOD and POD activities of soybean seeds during ger2
mination.
Ⅰ. CK; Ⅱ. 100μg·g - 1 TCB ; Ⅲ. 200μg·g - 1 TCB ; Ⅳ. 300μg·g - 1 , TCB.
罗立新等[10 ,16 ]报道的小麦叶片受镉胁迫的 POD 活
性增加的变化规律相似.
　　研究表明 ,耐性较弱的大豆[16 ]种子在逆境胁迫
初期 ,其磷酸化作用 (即合成 A TP 作用) 降低 ,但其
呼吸电子传递仍保持相对较高的活性. 这种电子传
递和 A TP 形成能力的不平衡导致电子传递的电子
漏 ,从而产生大量的 O2 -1 及 H2O2 等多种活性
氧[3 ,4 ,9 ,11 ] . TCB 胁迫初期 (1～3 天) ,当萌发大豆种
子体内活性氧累积超过正常水平 , SOD、POD 等抗
氧化酶由于底物浓度增加而被诱导 ,从而加速其生
物合成. SOD 清除 O2 -1形成 H2O2 , POD 催化 H2O2
形成 H2O. 这些酶活性增加 ,生物体内保护系统被
诱导从而加强代谢活性 ,是植物对 TCB 等污染胁迫
的响应[3 ,4 ,9 ] ,加速活性氧清除 ,有效地抑制膜脂质
过氧化作用 ,从而保护了膜系统. 另一方面 ,随着
TCB 胁迫时间的延长和胁迫强度的增加 ,萌发大豆
种子 SOD 活性下降、POD 活性上升. 表明酶系统可
能被破坏 ,将不利于对活性氧的清除 ,造成机体内活
性氧增加 ,加速 O2 -1、1 O2 、H2O2 向毒性更强的·OH
转化 ,从而加速膜脂质过氧化作用形成 MDA. 后者
能与细胞内的核酸、氨基酸及蛋白质等生物大分子
发生反应 ,生成具有共轭双键的 Sciff 碱基 ( - N = C
- C = C - N - ) ,从而引起生物膜结构及其功能受到
损伤 ,并破坏细胞超微结构 (另文发表) . 这也是
TCB 胁迫 4～6 天后 ,O2 -1产生速率和 H2O2 含量下
降的主要原因. 同时 ,POD 具有吲哚乙酸 ( IAA)氧化
酶功能[9 ,13 ,20 ] ,在 TCB 胁迫下 POD 活性的剧烈增
加可导致 IAA 含量下降 ; POD 还可促进植物细胞壁
中的半纤维素、伸展素或果胶质等发生交链 ,形成木
质素 ,增加木质化程度 ,使细胞壁硬化 ,阻止细胞伸
长 ,从而抑制幼苗的生长 ,甚至死亡.
4 　结 　　论
　　在正常条件下 ,萌发大豆种子内活性氧的产生
和清除维持动态平衡. TCB 胁迫诱导了 O2 -1及 H2O2
的代谢失衡和过量积累 ,又使 SOD 活性总体水平下
降 ,POD 活性逐渐增加 ,致使活性氧清除酶系统功
能紊乱 ,不能有效地消除细胞内的活性氧. 在 TCB
756112 期 　　　　　　　　　　　刘宛等 :1 ,2 ,4 - 三氯苯胁迫对萌发大豆种子中活性氧的影响 　　　　　　　　
胁迫下 ,萌发大豆种子内 MDA 含量升高 ,表明机体
膜脂质过氧化进程加剧 ,使植物因膜脂质过氧化而
受到严重伤害.
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作者简介 　刘 　宛 ,女 ,1963 年生 ,博士 ,副研究员 ,主要从
事污染生态学研究 ,发表论文 20 余篇. E2mail : liuwan63 @
hotmail. com
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