全 文 ：环境温度条件对口蘑菌 L1纤维素酶和木
聚糖酶合成的影响*
蔡敬民* * 吴 克 张 洁 刘云峰* * * 潘仁瑞 (合肥联合大学生化系,合肥 230022)
丁佐龙 (安徽农业大学林产工业研究所, 合肥 230036)
摘要 较高的环境温度有利于口蘑菌 L1 的生长和蛋白质的合成. 当环境温度为 38! 时,纤维素酶的比活力
达最高值, 为 234Iu∀mg- 1蛋白质,该菌在此温度下培养 90h, 纤维素酶活力为 33Iu∀g- 1干培养基. 木聚糖酶的
最适合成温度为 32! , 此温度下木聚糖酶的比活力可达 92Iu∀mg- 1蛋白质,培养 67h,木聚糖酶活力可达126Iu∀
g- 1干培养基.提示环境温度对口蘑菌 L1 细胞内酶的合成具有调节作用.
关键词 温度 口蘑菌 纤维素酶 木聚糖酶
Effect of environmental temperature on formation of cellulase and xylanase in Thricholomataceae L1. Cai Jingmin,
Wu Ke, Zhang Jie, L iu Yunfeng , Pan Renrui ( Hef ei Union Univ er sity , H ef ei 230022) , Ding Zuolong ( A nhui
Agr icultural University , H ef ei 230036) . Chin . J . A pp l. Ecol . , 1999, 10(6) : 729~ 731.
Higher environmental temperature is beneficial to the growth of T richolomataceae L1 and its protein synthesis. When
temperature is 38! , the specific activ ity of cellulase is t he highest, r eaching 23. 4Iu∀mg - 1 protein. A fter cultivated
for 93 hours at this temperature, its cellulase activity is 33Iu∀ g- 1 dry medium. The opt imal temperature for the
formation of x ylanase is 32 ! . Under this temperatrue, the specific activity of x ylanase is 92Iu∀mg- 1 protein, and
after cultivated for 67 hours, it is 126Iu∀ g- 1 dry medium. It is suggested that environmental temperatur e has a
regulation effect on t he formation of intracellular enzyme of T richolomataceae L1.
Key words T emperature, T richolomataceae, Cellulase, Xylanase.
* 安徽省自然科学基金( 98241515) 和安徽省教委科研基金资助项
目( 96JL0155) .
* * 通讯联系人.
* * * 本校 95生物工程专业学生.
1998- 02- 25收稿, 1999- 03- 04接受.
1 引 言
白腐菌是一类可以同时产生分解纤维素、半纤维
素和木质素酶系的真菌, 在环境条件适宜的情况下能
迅速导致木材的腐朽和降解. 近年来,由于白腐菌在生
物制浆脱木素[ 2]、农药与染料分解[ 5, 8]等方面具有重
要作用而引起学术界的关注.白腐菌不能以木质素作
为其生长的碳源[ 7] , 主要依靠该菌水解纤维素、半纤
维素产生小分子还原糖来作为生长和产木质素酶的碳
源.本文以口蘑菌 L1为材料,研究生态环境因素对白
腐菌产纤维素酶和半纤维素酶的影响, 以揭示该菌所
产 3种酶系之间的关系, 为生产高活力的木质素酶提
供理论依据.
2 材料与方法
2. 1 试验材料
2. 1. 1 菌种和菌悬液制备 菌种从校园内白腐枯树上分离纯
化,初步鉴定为口蘑菌( T richolomataceae L1) .将纯化后菌种接
入 PDA斜面培养基, 38 ! 培养 4d 后, 按每支斜面加 10ml无菌
水,制备孢子和菌丝体悬液, 转入盛有玻璃珠 (4mm)的无菌三
角瓶中,于摇床上振荡 30min 后备用.
2. 1. 2 营养盐液 采用 Mandels 氏营养盐[ 9] ( g∀L- 1 ) : KH2PO4
30; ( NH4) 2SO4 20; 脲05; MgSO4∀H2O 0 5; CaCl2 0. 5; FeSO4
∀7H2O 7. 5# 10- 3; MnSO4 2 5 # 10- 3; ZnSO4 2 0 # 10- 3; CoCl2
30 # 10- 3; pH 5. 5~ 6.
2. 1. 3 固态发酵 在 250ml三角瓶中装入 7 5g 锯木屑, 0 5g
麸皮, 用 1 5 倍( W / V )营养盐液及适量水, 经高压灭菌后制得
固态发酵培养基, 按每瓶 4 0ml菌悬液接种, 于不同温度下发
酵,制备固体曲.
2. 1. 4 粗酶液的制备 取一瓶固体发酵曲, 加入 200ml, pH4. 6
的 0 2mol∀L- 1醋酸盐缓冲液,搅拌后, 于室温下浸提 1h, 抽滤,
滤液即为粗酶液.
2. 2 研究方法
2. 2. 2 L1 菌株比生长速率测定 在直径为 9cm 的平板中央接
入直径约 4mm 的菌块, 于不同的温度下培养,定时测定菌落直
径,计算出比生长速率的近似值.
= 1/ # ∀dx / dt ,式中 为比生长速率( h- 1 ) , x 为菌落直
径( cm) , t 为培养时间( h) .
2. 2. 2 纤维素酶活力的测定 取 0. 2ml粗酶液加入 1. 8ml 1%
羧甲基纤维素钠溶液( pH4. 6, 0. 2mol∀ L- 1醋酸缓冲液配制 ) ,
于 50 ! 水浴中反应 30min,用 DNS( 3. 5二硝基水杨酸)法测定
应 用 生 态 学 报 1999 年 12 月 第 10 卷 第 6 期
CH INESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Dec. 1999, 10( 6)∃729~ 731
还原糖.以葡萄糖为标准, 在本实验条件下, 1min 产生 1mol的
还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位. 本文酶活力单位为
Iu∀g- 1干培养基,下同.
2. 2. 3 木聚糖酶活力的测定 取 0. 1ml粗酶液加入 1ml 2% 木
聚糖悬液中( Birchw ood Xylan, Sigma 公司产品, 用 pH4. 6, 0. 2
mol∀L- 1醋酸缓冲液配制) ,于 50 ! 水浴中反应 10min, 用 DNS
法测定还原糖. 以木糖为标准, 在本实验条件下, 1min 产生
lmol还原糖所需的酶量定义为 1 个酶活力单位.
2. 2. 4 蛋白质含量的测定 采用 Bradfood 的考马斯亮蓝比色
测定法[ 4] .
3 结果与分析
3. 1 环境温度对 L1菌株生长的影响
酶的生物合成量在一定条件下与生物量的多少有
关.该菌在 25 ! 以下培养时,生长速度较慢,在 35 ! 以
上时生长速度加快. 在 20~ 38 ! 范围内, 各温度条件
下的最大比生长速率与温度间显现近似直线的关系
(图 1) , 其函数关系式为 = 6. 5 # 104T + 00265,
20 ! % T % 38 ! . 当温度从 38 ! 升至 42 ! 时, 尽管比
生长速率进一步增大, 但斜率趋缓. 当环境温度为
45 ! 时,比生长速率下降. 由此可见, 所分离的口蘑菌
L1的最适生长温度为 42 ! , 属于高温型真菌.
图 1 温度对 L1菌株比生长速率的影响
Fig. 1 Ef fect of temperature on specif ic grow th rate of st rain L1.
3. 2 温度对 L1菌株蛋白质合成的影响
较高的环境温度有利于 L1菌株的蛋白质合成,
当环境温度为 35~ 38 ! 时, L1 菌株的可溶性蛋白质
合成量最大,为 1625mg∀g- 1干培养基(图 2A) .这与
该菌在高温下生长速率快有关. 但当温度达到 42 ! 时
可溶性蛋白质的合成量略有下降.在 20~ 42 ! 不同的
环境温度条件下, L1 菌株的产蛋白质曲线也不相同,
但在其蛋白质浓度达最高值后,随着培养时间的延长,
图 2 温度对 L1菌株蛋白质( A)、纤维素酶( B)和木聚糖酶( C)合成的
影响
Fig. 2 Ef fect of temperature on synthesis of protein( A) , cellulase( B) and
xylanase( C) from st rain L1.
均显现出下降趋势, 可能与蛋白质的稳定性有关.
3. 3 温度与 L1菌株纤维素酶合成的关系
在一定的培养条件下,当曲中某一酶的比活力达
到最大时,该酶蛋白在菌体所合成的总蛋白质中的比
例也达最高值, 当 L1菌株在 38 ! 培养时,纤维素酶的
比活力均高于其他温度, 为 23. 4Iu∀mg- 1蛋白质,纤维
素酶蛋白与总蛋白质的合成及菌的生长趋势基本上一
730 应 用 生 态 学 报 10卷
致(图 2B) .在试验温度条件下, 纤维素酶的最大比活
力均出现在45h, 然而,曲中酶的活力峰却出现在90h.
在培养的开始阶段, 菌体合成的蛋白质中纤维酶蛋白
的比例较高,除该酶属于诱导型酶外,酶系中较高的纤
维素酶含量有利纤维素的水解和 L1 菌株对这类物质
的利用.在曲中纤维素酶活力达最高值后,不同环境温
度条件下的酶活力和总可溶性蛋白质的含量均下降,
但是酶的比活力即相对升高, 因此,曲中纤维素酶蛋白
的稳定性高于总可溶性蛋白质的平均稳定性.
3. 4 温度对 L1菌株木聚糖酶合成的影响
木聚糖是半纤维素物质的主要成份之一,该菌产
木聚糖酶的最适温度为 32 ! , 此时, 酶的比活力也达
最高值,为 92Iu∀mg- 1蛋白质(图 2C) .在该温度条件
下,木聚糖酶的活力为 126Iu∀g- 1干培养基, 均高于其
他环境温度条件.并且,曲中木聚糖酶的最大比活力与
最高活力均出现在 67h. 酶的比活力峰与酶活力峰出
现在同一时间, 这与纤维素酶的合成不同.我们在研究
黑曲霉A3菌株固态发酵产木聚糖酶和纤维素酶时也
观察到了类似的现象[ 3] .
3. 5 L1菌株在最适温度条件下的产纤维素酶和木聚
糖酶曲线
为了研究口蘑菌在实际生态环境下的产酶情况,
图 3 L1菌株产木聚糖酶和纤维素酶的时间曲线
Fig. 3 T ime curve of xylanase and cellulase product ion f rom strain L1.
木聚糖酶活力 Xylanase act ivity: a) 32 ! , b) 38 ! ;纤维素酶活力 Cellulase
act ivity: c) 38 ! , d) 32 ! .
本文设计了以木屑为主要成份的固体培养基.当菌悬
液接种后, 38 ! 时生长较快, 1d后就可以看见培养基
表面有纤细的菌丝体生长,而 32 ! 需 1. 5d 时间,从产
酶过程来看, 38 ! 时的木聚糖酶活力峰出现较早, 但比
32 ! 时的最大酶活力低 29% .木聚糖酶活力在达最高
值后,均呈明显的下降趋势.纤维素酶活力的上升速度
则较慢, 32 ! 与 38 ! 时, 纤维素酶活力峰均出现在
90h,但 38 ! 条件下的酶活力较 32 ! 高 33%. 从产酶
时间上来看,培养开始阶段木聚糖酶的高活力以及培
养后期纤维素酶的高活力,在底物水解上具有一定的
互补作用.
4 结 语
生态环境条件的改变,会对菌体内部的代谢机制
产生影响.环境温度除了影响口蘑菌 L1的生长、蛋白
质合成和产酶过程外,对于酶的合成也具有调节作用.
L1菌株纤维酶的最适合成温度高于木聚糖酶, 与木质
素酶的合成温度一致[ 1, 6] .
致谢 刘 斌同志参加部分研究工作.
参考文献
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9 Mandels, M . & Weber, J. 1969. T he product ion of cellulases. A dv .
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作者简介 蔡敬民,男, 1963 年生,副教授, 微生物学专业方向,
在国内外学术刊物上发表论文 28篇.
7316 期 蔡敬民等:环境温度条件对口蘑菌 L1 纤维素酶和木聚糖酶合成的影响