全 文 :西北林学院学报 2016,31(4):113~117
Journal of Northwest Forestry University
doi:10.3969/j.issn.1001-7461.2016.04.19
北京百花山不同海拔巧玲花遗传多样性分析
收稿日期:2015-10-08 修回日期:2016-03-29
基金项目:国家林木(含竹藤花卉)种质资源平台建设与运行服务(2005DKA21003);北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目
(CIT&TCD20154043)。
作者简介:王 羽,女,在读硕士,研究方向:林木种质资源与育种研究。E-mail:wangyu20126@163.com
*通信作者:郑 健,男,硕士生导师,副教授,研究方向:林木种质资源与利用研究。E-mail:zhengjian@bua.edu.cn
王 羽,窦德泉,关雪莲,郭盈添,郑 健*
(北京农学院 园林学院,北京102206)
摘 要:巧玲花是我国北方一种极具观赏价值的落叶花灌木,北京百花山具有丰富的巧玲花资源。
调查分析表明,其分布在海拔1 200~1 800m范围内。利用ISSR分子标记技术对百花山6个不同
海拔梯度(1 200~1 300、1 301~1 400、1 401~1 500、1 501~1 600、1 601~1 700、1 701~1 800m)
的巧玲花群体进行遗传多样性分析。结果表明:百花山地区不同海拔巧玲花群体的遗传多样性差
异较大,在1 500~1 600m的中海拔地区的群体表现出较高的遗传多样性水平(75.43%),而高海
拔和低海拔地区的群体遗传多样性较低(62.82%、73.08%);UPGMA聚类结果表明,遗传距离
与海拔呈一定的相关性。相邻海拔的巧玲花群体间遗传距离相对较近,而高山草甸与其他海拔的
群体间表现出较远遗传距离,根据群体间的遗传分化系数(Gst)的结果分析,变异主要存在于群体
内(89.06%)。综合以上结果认为,海拔的不同引起了生境条件的变化,进而影响巧玲花遗传多样
性,遗传多样性水平随海拔的升高呈现低-高-低的分布规律。
关键词:巧玲花;ISSR-PCR;遗传多样性;遗传结构;百花山
中图分类号:S793.9 文献标志码:A 文章编号:1001-7461(2016)04-0113-05
Genetic Diversity of Syringapubescens Populations from Different Altitudes
in Baihua Mountain in Beijing
WANG Yu,DOU De-quan,GUAN Xue-lian,GUO Ying-tian,ZHENG Jian*
(College of Landscape Architecture,Beijing Agricultural University,Beijing102206,China)
Abstract:Syringapubescens is a deciduous shrub species native to northern China with high potential for
ornamental value.There are rich resources of S.pubescens in Baihua Mountain in Beijing,with altitudinal
distribution ranging from 1 200to 1 800m.Genetic diversity and genetic structure of six different altitude
gradient S.pubescens populations(1 200-1 300,1 301-1 400,1 401-1 500,1 501-1 600,1 601-1 700,
1 701-1 800m)in Baihua Mountain were studied by ISSR technology.The results showed that the genetic
diversity of S.pubescens was higher(75.43%)in 1 501-1 600maltitudinal population,while lower ge-
netic diversity was observed in populations of higher and lower altitude(62.82%and 73.08%respective-
ly).The UPGMA cluster analysis indicated that the genetic distances among populations were certainly
correlated with their altitudinal distribution.The genetic distance was relative lower between the adjacent
altitude of population,however,the genetic distance was relative farther between the alpine meadow and
other altitudinal populations.According to the group of the coefficient of genetic differentiation(Gst)anal-
ysis,the genetic variation existed in the populations(89.06%).Comprehensively,the genetic diversity of
the S.pubescens was afected by the change of the habitat conditions caused by the altitudinal diference,and the
distribution of genetic diversity level was low-high-low with the rising of altitude in Baihua Mountain.
Key words:Syringapubescens;ISSR-PCR;genetic diversity;genetic structure;Baihua Mountain
巧玲花(Syringapubescens)为木犀科丁香属植
物,落叶灌木,生于海拔900~2 100m。圆锥花序
直立,侧芽抽生,花序轴与花梗、花萼略带紫红色花
冠,花药紫色,植株秀丽多姿,花序细密,花朵细小,
盛开时花团锦簇,淡紫色后渐近白色,香气四溢,沁
人肺腑,花期5-6月,果期6-8月。产于中国河
北、山西、陕西东部、山东西部、河南。生长在山坡丛
林、林下或林缘,或沟边、山谷灌丛中。秋天叶子会
呈现不同的颜色,群体花期很长,新枝的萌发强度
大,耐修剪,可塑性强,使得其可以修剪成各种造型,
制作成各种盆景。无论是宅院、居住区或绿地群植
都是优良的观赏绿化树种,是发展北方园林绿化的
一条重要途径。
木犀科丁香属植物约27种,其中20余种起源
于我国,我国是丁香属植物种质资源的世界分布中
心和栽培起源中心,但育种工作起步较晚,从20世
纪50年代才开始对丁香花进行引种栽培、品种选育
和开发利用工作[1]。近几年来关于木犀科丁香属植
物的研究多集中在药理、化学成分、形态特征、解剖
学等研究上,而很少有对丁香属植物种质资源和遗
传多样性方面的研究[2-5]。欧丁香系和巧玲花系是
丁香属植物中观赏价值较高的2个系[6],然而长期
以来人们对巧玲花的资源价值关注很少。北京百花
山具有丰富的巧玲花资源,长期以来处于山野,其资
源价值尚未被充分利用。随着近几年旅游业的开
发,巧玲花的生境受人类活动的影响较大,其资源也
受到一定程度的破坏,因此巧玲花种质资源的收集、
保存、评价和利用已经刻不容缓。
与其他标记技术相比,ISSR(inter-simple se-
quence repeat,简单重复序列区间扩增多态性)技术
以试验成本低、模板需求量少、快速灵敏、操作简单、
多态性丰富等优点而倍受学者的青睐[7-8]。目前该
技术已应用于品种鉴定,分类系统学比较,遗传多样
性检测、基因定位、亲缘关系分析、遗传作图、以及植
物育种等方面的研究[9-11]。本研究利用ISSR分子
标记技术对北京百花山不同海拔巧玲花的遗传多样
性及其遗传结构进行分析,初步了解其变异的来源
及其空间分布,为今后百花山巧玲花资源的遗传多
样性保护以及其资源的保存和利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
所用试验材料于2014年6月采集于北京百花
山自然保护区,在巧玲花的海拔分布范围内,从其海
拔分布下限开始,以海拔每升高100m选择1个群
体,直至其海拔分布上限,共划分为6个群体,分别
记为Pop1(1 200~1 300)、Pop2(1 301~1 400)、
Pop3(1 401~1 500)、Pop4(1 501~1 600)、Pop5
(1 601~1 700)、Pop6(1 701~1 800)。每个群体随
机选择生长正常、无病虫害的植株,采集幼嫩叶片,
置于装有硅胶的塑封袋中,带回实验室后立即放入
-80℃冰箱保存,待用。共选择了132个单株,各取
样群体的生境条件详见表1。
表1 采集样地及生境描述
Table 1 Sample colection and habitat description
居群 海拔/m 取样数 坡度/(°) 生境类型 伴生植物
Pop 1 1 200~1 300 13 10~30 以蒙古栎、椴树、桦树、油松为主的针阔混交林 以绣线菊、胡枝子为主
Pop 2 1 301~1 400 33 10~30 以落叶松、桦木为主的针阔混交林 以六道木、大花溲疏、毛榛为主
Pop 3 1 401~1 500 27 0~30 以白蜡、五角枫、落叶松为主的针阔混交林 以胡枝子、毛榛、忍冬为主
Pop 4 1 501~1 600 12 10~40 以落叶松、蒙古栎为主的针阔混交林 以北京山梅花、大果榆为主
Pop 5 1 601~1 700 20 10~40 以桦树、落叶松为主的针阔混交林 以山楂叶悬钩子、铁线莲、小檗为主
Pop 6 1 701~1 800 27 10~40 半阳坡草甸 蒲公英、紫丁香、绒毛绣线菊为主
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA的提取方法 参照陈永华[12]
等的方法,以新鲜的巧玲花嫩叶为原料,采用改良后
的2×CTAB法提取其基因组DNA。
1.2.2 ISSR-PCR引物筛选 参照杨晓霞[1]等筛
选的引物(表2),对本试验中巧玲花进行遗传多样
性分析,试验中所用的引物由北京三博远志科技有
限公司合成。
1.2.3 ISSR-PCR产物的检测 取扩增产物点样
于1.2%的琼脂糖凝胶上,100V 条件下电泳30
min,然后采用Gel Doc XR型凝胶成像分析系统进
行检验。
1.2.4 数据处理与分析 参照张翠琴[13]的方法。
按照扩增条带的有无,进行0,1标记,扩增阳性(记
为1)和扩增阴性(记为0),形成ISSR表型数据矩
阵。用POPGENE软件估算种群的多态位点百分
率(P)、Nei′s遗传多样性指数、Shannons多样性
指数(Is)、群体内的遗传变异(Hs)、群体总遗传变异
(Ht)、基因流(Nm)、及遗传分化系数(Gst),并且采
用NTSYS-pc软件进行聚类分析。
411 西北林学院学报 31卷
表2 用于ISSR标记的引物以及退火温度
Table 2 ISSR primer and annealing temperature used in this study
引物 序列(5′to 3′) 退火温度/℃
ISSR-02 GTGCGTGCGTGCGTGC 52.2
UBC-811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 48.2
UBC-823 TCTCTCTCTCTCTCTCC 49.0
UBC-825 ACACACACACACACACT 46.8
UBC-827 ACACACACACACACACG 48.2
UBC-829 TGTGTGTGTGTGTGTGC 51.2
UBC-835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 51.7
UBC-842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 52.0
2 结果与分析
2.1 ISSR结果分析
基于优化的ISSR-PCR扩增体系[1],用选定的
8条引物分别对6个不同海拔群体的巧玲花基因组
进行PCR扩增,共检测出78条多态性高、稳定性好
的条带。扩增片段的分子量大小在100~2 000bp
之间,其中多态性条带为67条,平均每个引物扩增
出8.25个位点,多态性位点百分率为85.9% (表
3)。表明百花山巧玲花不同群体间的基因位点多态
性丰富,遗传变异较高。部分引物PCR扩增结果见
图1。
表3 不同ISSR引物扩增结果
Table 3 The amplification results of different primers
引物
退火
温度/℃
扩增
带数/条
多态性带
/条
多态性
比率/%
ISSR-02 52.2 10 9 90.0
UBC-811 48.2 7 6 85.7
UBC-823 49 8 6 75.0
UBC-825 46.8 12 11 83.3
UBC-827 48.2 7 6 85.7
UBC-829 51.2 11 10 90.9
UBC-835 51.7 11 9 81.8
UBC-842 52 12 10 83.3
合计 78 67 85.9
注:M:DL2000DNA Marker;泳道1~5为供试巧玲花种质材料的扩增图谱。
图1 8条引物对巧玲花材料的部分扩增结果
Fig.1 Amplification profiles of partial S.pubescens samples based on eight ISSR primers
2.2 遗传多样性分析
北京百花山6个不同海拔巧玲花群体间存在一
定遗传变异。Nei′s遗传多样性指数及Shannons
多样性指数与多态性位点百分率的结果相一致,即
海拔1 401~1 700m群体(Pop3、Pop4、Pop5)显示
出较高的遗传变异水平,而低海拔1 200~1 400m
群体 (Pop1、Pop2)和高海拔1 701~1 800m群居
(Pop6)遗传变异水平相对较低,不同海拔间巧玲花
群体的遗传变异水平由高到低的顺序为Pop5>
Pop4>Pop3>Pop1>Pop2>Pop6(表4)。以上结
果表明,海拔的变化对巧玲花遗传多样性水平有一
定的影响,中海拔地区巧玲花群体具有相对较高水
平的遗传多样性,而低海拔和高海拔巧玲花群体的
遗传多样性水平较低。
2.3 群体遗传分化及遗传结构
根据Nei′s指数,估算群体间的遗传分化系数
(Gst)为 0.109 4(表 5),表明总的遗传变异有
89.06%来自群体内,10.94%来自群体间,同时也反
映出6个不同海拔巧玲花群间的遗传差异较小,变
异主要存在于群体内。由Gst计算出群体间的基因
511第4期 王 羽 等:北京百花山不同海拔巧玲花遗传多样性分析
表4 百花山巧玲花遗传多样性ISSR分析
Table 4 Genetic diversity of S.pubescens in Baihuashan Mountain based on ISSR analysis
群体
多态基因
位点
多态性位点
百分率/% Na
* Ne*
Nei′s遗传
多样性指数
Shannons
多样性指数
Pop 1 57 73.08 1.730 8 1.397 7 0.238 3 0.361 1
Pop 2 57 73.08 1.730 8 1.396 2 0.231 1 0.348 8
Pop 3 62 79.49 1.794 9 1.409 5 0.241 3 0.366 5
Pop 4 67 85.90 1.859 0 1.412 4 0.252 4 0.390 0
Pop 5 61 78.21 1.782 1 1.463 8 0.271 0 0.405 7
Pop 6 49 62.82 1.628 2 1.362 3 0.216 2 0.326 5
平均 58.8 75.43 1.754 3 1.406 9 0.241 7 0.366 4
注:Na*观测等位基因数;Ne*期望等位基因数。
流(4.070 7)>1,表明相对于其他物种,百花山巧玲
花群体间有较小的遗传分化。
2.4 不同海拔巧玲花群体间的Nei′s遗传距离
用Nei′s遗传相似度和遗传距离对各群体的遗
传分化进一步分析发现海拔对各群体间的遗传距离
有一定影响(表6)。由表中数据可以看出相邻海拔
Pop1到Pop5巧玲花群体间的遗传距离相对较小,
而与Pop6群体均有较大的遗传距离。最小的遗传
距离出现在Pop3群体与Pop4群体间(0.022 2)(表
6)。此外,各巧玲花种群间的遗传一致度在0.9 024
~0.9 781之间,表明巧玲花6个群体间的相似程度
较高。
根据Nei′s无偏遗传距离构建群体间的 UPG-
MA聚类图,得到群体间亲缘关系树状图(图2),6
个不同海拔的巧玲花群体的聚类情况如下,首先
Pop3和Pop4聚为一组,之后与Pop5和Pop2先后
聚在一起,紧接着又与Pop1聚在一起,最终与Pop6
聚在一起,这一结果进一步说明Pop6群体与其他5
个群体的遗传距离较远。
表5 百花山巧玲花群体遗传分化系数和基因流
Table 5 Genetic differentiation coefficient and gene flow of
S.pubescens in Baihuashan Mountain natural
样本大小 Ht Hs Gst Nm*
132 0.271 4 0.241 7 0.109 4 4.070 7
注:Ht,总的基因多样性;Hs,种群内基因多样性 ;Gst,遗传分化系
数;Nm*,基因流。
表6 巧玲花群居间Nei′s遗传距离和遗传一致度
Table 6 Genetic distance(below diagonal)and genetic identity(above diagonal)among different populations of
S.pubescens calculated by Nei′s index
Pop ID 1 2 3 4 5 6
1 **** 0.956 1 0.960 9 0.961 7 0.954 3 0.902 4
2 0.044 9 **** 0.975 9 0.966 6 0.969 2 0.927 2
3 0.039 9 0.024 4 **** 0.978 1 0.971 9 0.942 3
4 0.039 0 0.033 9 0.022 2 **** 0.975 1 0.921 3
5 0.046 7 0.031 3 0.028 5 0.025 2 **** 0.937 6
6 0.102 7 0.075 6 0.059 4 0.082 0 0.064 4 ****
注:群居间Nei′s遗传距离(对角线下方)和遗传一致度(对角线上方)。
图2 不同纬度巧玲花种群间Nei′s遗传距离
UPGMA聚类图(群体代号同表1)
Fig.2 UPGMA dendrogram of S.pubescens on Nei′s genetic
distance at different latitudes.Population codes
are the same as in Table 1.
3 结论与讨论
遗传多样性是生物所携带遗传信息的总和,是
群体生存、发展和进化的基础,通常认为遗传多样性
的高低反映了物种对外界环境适应能力的强弱[14]。
本试验中百花山巧玲花群体的ISSR标记分析结果
表明其多态性位点百分率平均为75.43%(表4),不
同海拔各群体内遗传多样性存在一定差异,不同海
拔巧玲花群体的遗传变异水平随着海拔的升高呈现
低-高-低的分布。产生这一结果的原因可能是由于
低海拔地区受人为因素影响,如植被砍伐、牲畜的啃
食等致使其生境条件遭到破坏,影响巧玲花的正常
生长繁殖导致种群变小,从而使其遗传多样性降低;
中海拔巧玲花群体所处的生境多为阳坡,通风透光,
生境条件更适合于其生长发育,而且此海拔的群落
结构多样,种类组成复杂,在此生境条件下巧玲花群
体表现出较高的遗传变异水平;随着海拔的升高,巧
611 西北林学院学报 31卷
玲花的生境趋于极端化,其群落结构及种类组成趋于
单一,其花期、传粉、种子的发育都受到限制,在此生
境条件下基因流动困难,最终导致遗传多样性降低。
群体遗传多样性除了能够表现出遗传变异的高
低,同时还包括了遗传变异分布格局,即群体的遗传
结构[15-16]。Wright[17]指出遗传分化系数(Gst)>
0.25表明群体遗传分化极大。而本试验的Gst为
0.109 4,原因应归结于相似生境地理隔离不十分明
显,巧玲花的开花时期相近,花粉可以顺利的传播,
群体内基因交流较顺畅。植物群体的遗传结构不仅
决定于自身遗传基础、繁育系统及其起源进化进程,
而且还受到自然选择、遗传漂变和基因流等因素的
影响[18],本试验发现百花山巧玲花群体间的基因流
为4.070 7,因此,基因流不是百花山不同海拔巧玲
花群体间遗传分化的主要原因。导致百花山不同海
拔巧玲花群体间遗传分化的原因可能是:随着海拔
的不断升高,气候与植被等一系列因素也呈现出垂
直的变化,致使不同海拔群体微生境产生一定差异,
经过长期演化,最终导致了种群间的遗传分化。
遗传相似性系数或遗传距离也是衡量群体间遗
传分化程度的重要指标。本试验百花山低海拔到中
高海拔区段变化比较平缓,相近的海拔差使群体遗
传距离较近,而高海拔群体的位置相对于其他群体
跨度较大,位于较高的草甸上,而亚高山草甸环境相
对恶劣,影响了其正常生长繁殖,也影响了其与低海
拔种群间的基因交流,从而产生了较远的遗传距离。
本试验结果进一步表明海拔对基因交流存在一定的
阻碍作用。
遗传多样性的研究可以揭示物种或群体的进化
史,同时也可以进一步地分析物种的进化潜力[13]。
随着人类对植物群体的遗传结构以及影响生物多样
性的因素的研究不断深入,在遗传多样性研究的指
导下进行种质资源的收集、保存、评价和利用是一种
非常科学、可靠的方法,并逐渐被人们所接受。本试
验通过对百花山不同海拔巧玲花遗传多样性的分析
评价,为构建其野生种质资源保存和利用提供重要
的科学依据。
致谢:本试验中所用的巧玲花材料均由国家林
木种质资源平台提供,特此致谢!
参考文献:
[1] 杨晓霞,郑健,冷平生,等.暴马丁香ISSR-PCR反应体系优化
及引物筛选[J].分子植物育种,2014(5):1018-1026.
YANG X X,ZHENG J,LENG P S,et al.Optimization of IS-
SR-PCR system and selection of primers for Syringa reticulate
var.amurensis[J].Molecular Plant Breeding,2014(5):1018-
1026.(in Chinese)
[2] 温小成,谢久祥.紫丁香根部与枝条总酚、单宁与总黄酮含量研
究[J].青海大学学报:自然科学版,2015,33(1):21-26.
[3] 韩佳宏.辽东丁香枝化学成分及药理活性的研究[D].长春:吉
林农业大学,2014.
[4] 杨萍,罗燕燕,王瑞江.野丁香属植物叶表皮形态特征研究[J].
热带亚热带植物学报,2011,19(4):291-302.
[5] 李颖慧.丁香4种属植物茎和叶的比较解剖学研究[D].长春:
吉林农业大学,2011.
[6] 柴胜丰,庄雪影,邹蓉,等.濒危植物毛瓣金花茶遗传多样性的
ISSR分析[J].西北植物学报,2014,34(1):93-98.
CHAI S F,ZHUANG X Y,ZHOU R,et al.Genetic diversity
analysis of endangered plant Camellia pubipetala Detected by
ISSR[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2014,34
(1):93-98.(in Chinese)
[7] QIAN W,GE S,HONG D Y.Genetic variation within and a-
mong populations of a wild rice Oryza granulata from China de-
tected by RAPD and ISSR markers[J].Theor Appl Genet,
2001,1(2):440-449.
[8] 王建波.ISSR分子标记及其在植物遗传学中的应用[J].遗传,
2002,24(5):613-616.
WANG J B.ISSR markers and their applications in plant ge-
netics[J].Hereditas,2002,24(5):613-616.(in Chinese)
[9] 雒新艳,戴思兰.ISSR分子标记在观赏植物研究中的应用[J].
湖北农业科学,2009,48(7):1760-1768.
[10] TAKESHI I,TAKAYUKI K,HIDEKI T.Genetic diversity
of an endangered plant,Cypripedium macranthos var.re-
bunense(Orchidaceae):background genetic research for fu-
ture conservation[J].Conserv Genet,2007,8:1369-1376.
[11] 陈新露,曲式曾.中国丁香属植物[J].西北林学院学报,1989,
4(1):72-79.
CHEN X L,QU S Z.Genus Syringaof China[J].Journal of
Northwest Forestry University,1989,4(1):72-79.(in Chi-
nese)
[12] 陈永华,相阳,张冬林,等.4种不同广玉兰基因组DNA提取
方法的比较[J].中南林业科技大学学报,2008,28(3):45-48.
CHEN Y H,XIANG Y,ZHANG D L,et al.Comparison of 4
different extraction methods for Magnolia grandiflora DNA
[J].Journal of Central South University of Forestry and
Technology,2008,28(3):45-48.(in Chinese)
[13] 张翠琴,林丽丽,王祎玲.山西霍山五角枫不同海拔种群遗传
多样性研究[J].生物学杂志,2014,31(5):66-70.
[14] 黄玮,孙平,张文生,等.北京东灵山地区不同海拔柴胡居群的
遗传多样性[J].植物遗传资源学报,2008,9(4):453-457.
[15] HAMRICK J L,BLANTON H M,HAMRICK K J.The genetic
structure of geographicaly marginal populations of ponderosa pine
[J].American Journal of Botany,1989,76:1559-1568.
[16] 葛颂,洪德元.泡沙参复合体(桔梗科)的物种生物学研究:表
型的可塑性[J].植物分类学报,1994,32(6):489-503.
GE S,HONG D Y.Biosystematic Studies on Adenophora potani-
nii complex (Campanulaceae)phenotypic plasticity.[J].Acta
Phytotaxonomica Sinica,1994,32(6):489-503.(in Chinese)
[17] WRIGHT S.Evolution and the genetics of populations.vo.l 4,
Variabilitywithin and among naturalpopulations[M].Chicago:U-
niversity of Chicago Press,1978.
[18] 张春影,赵海佟,李美善,等.不同海拔牛皮杜鹃种群遗传多样
性的RAPD分析[J].延边大学农学学报,2012,34(1):46-50.
711第4期 王 羽 等:北京百花山不同海拔巧玲花遗传多样性分析