全 文 ：毛细管电泳法测定青叶胆中獐牙菜苦苷和异牡荆素的含量＊
肖琳 ,李静 ,孙文基＊＊
(西北大学陕西省生物医药重点实验室 ,西安 710069)
摘要　目的:建立测定青叶胆中獐牙菜苦苷和异牡荆素含量的高效毛细管电泳分析方法。方法:青叶胆药材粉末经 50%甲醇
溶液超声提取后 , 采用未涂层弹性石英毛细管柱(60.2 cm×75 μm, 有效长度 50 cm)作为分离通道;以含 5%甲醇的 50 mmol
· L-l硼砂(pH=9.37)为运行缓冲溶液;分离电压 15 kV;检测波长 236 nm;柱温 25℃。结果:獐牙菜苦苷和异牡荆素浓度分
别在 0.1304 ～ 1.304 mg· mL-l(r=0.9998)和 0.0298 ～ 0.298mg· mL-l(r=0.9994)范围内呈良好的线性关系;平均回收率
(n=6)分别为 98.5%和 99.3%, RSD均小于 2%。结论:本法简便 、快速 ,可用于青叶胆中獐牙菜苦苷和异牡荆素的含量测
定。
关键词:青叶胆;獐牙菜苦苷;异牡荆素;毛细管电泳;含量测定
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2009)12-2040-04
HPCEdeterminationofswertiamarinandisovitexinin
SwertiamileensisT.N.HoetW.L.Shih＊
XIAOLin, LIJing, SUNWen-ji＊＊
(BiologyandMedicineKeyLaboratoryofShaanxiProvince, NorthwestUniversity, Xian710069, China)
Abstract　Objective:TodevelopanHPCEmethodfordeterminationofswertiamarinandisovitexininSwertia
mileensisT.N.HoetW.L.Shih.Methods:SwertiamarinandisovitexininSwertiamileensiswereextractedwith
50%methanolsolutionbysupersonicwavetechnique, andthendeterminedbycapilaryelectrophoresis.Auncoated
fused-silicacapilarycolumn(60.2 cm×75 μm, anefectivelengthof50cm)wasadopted.Therunningbufer
wascomposedof50mmol·L-lboraxsolutioncontaining5% methanol(pH=9.37).Theappliedvoltagewas15
kVandthecapilarytemperaturewas25℃.Thedetectionwavelengthwas236 nm.Results:Agoodlinearitybe-
tweenpeakareaandconcentrationwasfoundintherangeof0.1304-1.304 mg· mL-l(r=0.9998)forswer-
tiamarinand0.0298-0.298 mg·mL-l(r=0.9994)forisovitexin;Theiraveragerecoveries(n=6)were98.5%
and99.3%respectively, andtherelativestandarddeviationwaslessthan2.0%.Conclusion:Themethodissimple
andrapid.ItcanbeusedtodetermineswertiamarinandisovitexininSwertiamileensis.
Keywords:Swertiamileensis;swertiamarin;isovitexin;capilaryelectrophoresis(CE);contentdetermination
　　青叶胆别名弥勒獐牙菜 、金鱼胆 、走胆药 [ 1] ,为
龙胆科獐牙菜属植物青叶胆 SwertiamileensisT.N.
HoetW.L.Shih的干燥全草。主要分布于云南 、四
川 、贵州 、广东 、广西 、湖南 、福建等地 。全草入药 ,具
有清肝利胆 、清热利湿的功效 ,用于黄疸尿赤 、热淋
涩痛等症[ 2] 。
青叶胆化学成分众多 ,主要含有黄酮类 、环烯醚
萜苷类 、 酮类 、三萜类以及微量的内酯类化合
物 [ 3] 。獐牙菜苦苷为环烯醚萜苷类化合物 ,是青叶
胆的主要化学成分之一 ,具有保肝 、解痉 、镇痛和抗
炎等作用 [ 4] ;异牡荆素为青叶胆中的黄酮类成分 ,
具有抗氧化 、抗炎[ 5, 6]等活性 。关于青叶胆中有效
成分的含量测定 ,文献报道了紫外分光光度法[ 7]以
及高效液相色谱法 [ 8] 对其中的獐牙菜苦苷和齐墩
果酸等成分进行分析。为探索新的测定方法 ,本文
采用毛细管电泳方法测定青叶胆中功效成分獐牙菜
苦苷和异牡荆素的含量 ,该法具有操作简便 、快速 、
进样量少 、成本低 、环保等优点[ 9] 。
—2040— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(12)
＊
＊＊
西北大学研究生自主创新资助项目(项目编号 08YZZ36)
通讯作者　Tel:(029)88304569;E-mail:cxbml@nwu.edu.cn
DOI :10.16155/j.0254-1793.2009.12.013
1　仪器与试药
BeckmanMDQ型毛细管电泳仪(Beckman仪器
公司 ,美国),配有二极管阵列检测器 (DAD)及 32
Karat色谱工作站 ,未涂层石英毛细管(60.2cm×75
μm,有效长度 50cm), PHS-3C型精密 pH计(上海
雷磁仪器厂)。
獐牙菜苦苷对照品由中国药品生物制品检定所
提供 ,批号为 785-9001;异牡荆素对照品由陕西省
生物医药重点实验室提供 , 经 IR、UV、1HNMR、
13CNMR确证结构 ,峰面积归一化法计算纯度大于
98%。
青叶胆药材购自安徽省亳州市华申药业有限公
司 ,经西北大学生命科学学院王亚洲教授鉴定为青
叶胆(SwertiamileensisT.N.HoetW.L.Shih)。晒干
后切断粉碎 ,过 3号筛 ,备用 。
所用甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有
限公司), 水为重蒸水 (自制);硼砂 (Na2B4O7 ·
10H2O)为分析纯(天津市大茂化学试剂厂);氢氧
化钠为 HPCE级(Beckman)。
2　溶液的制备
2.1　对照品溶液　精密称取对照品獐牙菜苦苷与
异牡荆素适量 ,加 50%甲醇溶液制成每 1 mL含獐
牙菜苦苷 1.304mg、含异牡荆素 0.298mg的混合溶
液 ,即得。
2.2　供试品溶液　精密称取青叶胆药材粉末 1 g,
置于具塞三角瓶内 ,加入 50%甲醇溶液 20mL,称定
重量 ,超声提取(500W, 40kHz)0.5 h,放置至室温 ,
称重 ,补足重量。精密移取上清液 8 mL,蒸干 ,用
50%甲醇溶液溶解 , 置 2 mL量瓶中定容后摇匀 ,
0.45μm滤膜滤过 ,滤液作为供试品溶液 。
3　毛细管电泳条件
运行缓冲液:含 5%甲醇的 50 mmol· L-l硼砂
溶液(pH=9.37);压力进样:3.448 kPa×5 s;分离
电压:15kV;毛细管柱温:25 ℃;检测波长:236 nm;
毛细管第 1次使用前依次用 1.0 mol·L-1氢氧化钠
溶液冲洗 10 min, 0.1 mol· L-1氢氧化钠溶液冲洗
10 min,蒸馏水冲洗 3 min,运行缓冲液冲洗 10 min;
两次运行之间毛细管依次用蒸馏水冲洗 2 min, 0.1
mol· L-1氢氧化钠溶液冲洗 3 min, 蒸馏水冲洗 2
min,运行缓冲液平衡 3min。为了保证重现性 ,进样
5次后 ,更换同样浓度的新鲜运行缓冲液。
在上述电泳条件下得到对照品和样品电泳分离
图 ,见图 1。
图 1　对照品(A)和云南样品(B)的电泳分离图
Fig1　Electropherogramsofreferencestandards(A)andsample
fromYunnanprovince(B)
1.獐牙菜苦苷(swertiamarin)　 2.异牡荆素(isovitexin)
4　线性关系的考察
精密吸取 “ 2.1”项下的对照品溶液 0.2, 0.4,
0.8, 1.2, 1.6 , 2.0 mL分别置 2 mL量瓶中 ,用 50%
甲醇定容 ,即得系列浓度溶液 ,用上述电泳条件对各
浓度溶液进行测定 。以峰面积积分值 A为纵坐标 ,
对照品浓度 C(mg· mL-l)为横坐标 ,进行回归分
析 ,得獐牙菜苦苷 、异牡荆素线性回归方程分别为:
A=563.5C+1.612×104　r=0.9998
A=2.270×103C+2.306×104　r=0.9994
线性范围分别为 0.1304 ～ 1.304 mg· mL-l和
0.0298 ～ 0.298mg·mL-l。
5　精密度试验
取 “ 2.1”项下的对照品溶液 ,在上述电泳条件
下连续测定 6次 ,獐牙菜苦苷与异牡荆素峰面积的
RSD(n=6)分别为 0.73%和 1.6%。
6　稳定性试验
精密称取过 3号筛青叶胆药材粉末 1 g,按照
“2.2”项所述方法制备供试品溶液 ,分别于 0, 3, 5,
7, 9, 12h进行测定 ,獐牙菜苦苷与异牡荆素峰面积
的 RSD(n=6)分别为 0.95%和 1.1%。结果表明 ,
供试品溶液在 12 h内稳定 。
7　重复性试验
精密称取过 3号筛青叶胆药材粉末 6份 ,每份
约 1 g,按 “2.2”项下方法制备供试品溶液 ,按 “3”项
下电泳条件进行测定 ,计算 ,獐牙菜苦苷与异牡荆素
平均含量(n=6)分别为 0.52%和 0.068%, RSD分
别为 1.5%和 1.4%。
—2041—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(12)
8　回收率试验
精密称取已知含量的青叶胆药材粉末 0.5 g共
6份 ,每份加入獐牙菜苦苷 3.0 mg、异牡荆素 0.425
mg,按 “2.2”项下方法进行样品处理 ,按 “ 3”项下所
述电泳条件进行测定 ,测得獐牙菜苦苷与异牡荆素
回收率(n=6)分别为 98.5%和 99.3%;RSD分别
为 1.5%和 1.8%。
9　样品测定
将所得 10批青叶胆药材粉末按 “2.2”项下方
法制备成供试品溶液 ,并按上述电泳条件进行分析 ,
每份溶液进样 3次 。以外标两点法计算含量 ,测定
结果见表 1。
表 1　青叶胆样品测定结果(n=3)
Tab1　Thedeterminationresultof
swertiamarinandisovitexin
来源
(source)
獐牙菜苦苷(swertiamarin) 异牡荆素(isovitexin)
含量
(content)/%
RSD
/%
含量
(content)/%
RSD
/%
湖南(Hunan) 0.58 1.2 0.064 0.89
安徽(Anhui) 0.63 2.3 0.075 2.0
福建(Fujian) 0.60 1.7 0.085 1.8
广东(Guangdong) 0.57 2.5 0.083 1.7
广西(Guangxi) 0.57 0.73 0.077 2.4
贵州(Guizhou) 0.51 1.7 0.059 2.8
山东(Shandong) 0.55 2.6 0.084 2.5
四川(Sichuan) 0.89 2.3 0.098 1.7
云南(Yunnan) 0.93 1.4 0.100 2.0
浙江(Zhejiang) 0.61 1.6 0.092 2.0
10　讨论
10.1　样品提取方法的考察　样品提取时常采用的
方法有回流提取法 、超声提取法 ,对于这 2种方法对
中药材成分是否产生影响 ,尚未见文献报道 ,但超声
提取法方法简单 ,所需时间较短 ,且易于操作 ,故采
用超声提取法。此外 ,本实验依次考察了不同浓度
的甲醇分别超声提取 10 , 20, 30, 40, 60, 90 min对獐
牙菜苦苷与异牡荆素含量的影响 。结果表明采用
50%甲醇较其他溶剂效率更高 ,且提取 30 min时 2
种成分基本提取完全 。
10.2　缓冲液浓度对分离的影响　在一定范围内增
加缓冲液离子强度可以改善柱效 ,提高分离度 。本
实验考察了硼砂浓度在 20 ～ 60mmol·L-l范围内对
分离的影响 ,发现随着硼砂浓度的提高 ,各物质分离
度明显改善 ,当硼砂浓度为 50mmol· L-l时 ,獐牙菜
苦苷电泳峰受电渗流峰的干扰较小 ,电泳迁移时间
较为适宜。
10.3　缓冲液 pH对分离的影响　缓冲液的 pH影
响电渗流的大小和被分离溶质的电荷 ,从而影响迁
移速率 , 是毛细管电泳的重要影响因素 。将 50
mmol· L-l硼砂缓冲液用 1 mol· L-l氢氧化钠溶液
在 pH9.0 ～ 10.3范围内调节 pH,结果表明 , pH对
分离度的改善不甚明显。故采用未调节时 pH为
9.37的缓冲液作为电解质条件。
10.4　有机溶剂对分离的影响　缓冲液中加入有机
试剂可使溶液的电导减小 ,电流降低 ,进而影响电渗
流和分离度。本实验比较了甲醇 、乙腈等有机试剂 ,
最终选用甲醇 , 并考察了体积分数分别为 5%,
10%, 15%, 20%时甲醇对分离的影响。结果表明 ,
随着甲醇浓度的增大 ,电泳迁移时间延长 ,而甲醇体
积分数为 5%时保留时间较为适宜 ,分离效果较为
理想 。故最终确定甲醇的体积分数为 5%。
10.5　运行电压对分离的影响　提高运行电压 ,可
以缩短分离时间 ,提高分离效率 ,但电压增高的同时
也会导致焦耳热增加 ,进而造成分离效率的下降。
分别考察 10, 15, 20, 25 kV电压条件下獐牙菜苦苷
和异牡荆素的分离效果 ,两者迁移时间差随电压增
大而减小 ,考虑到青叶胆药材中其他成分干扰的影
响 ,故 15kV的电压较为合适 。
10.6　检测波长的选择　本实验采用紫外可见分光
光度仪对獐牙菜苦苷和异牡荆素的甲醇溶液扫描 ,
獐牙菜苦苷的最大吸收波长为 236nm,异牡荆素的
最大吸收波长为 214 nm、272 nm和 332 nm。考虑
到同时测定二者 ,用二极管阵列检测器 ,试用了 210
nm、220 nm、228 nm、 236 nm、 245 nm、254 nm、 270
nm、330 nm等一系列波长检测 ,认为 236 nm较为合
适 ,既适用于测定獐牙菜苦苷 ,也适用于测定异牡荆
素。
10.7　小结　本实验通过对不同电泳条件和电解质
体系的优化及系统方法学的研究 ,建立了高效毛细
管电泳测定青叶胆中獐牙菜苦苷与异牡荆素含量的
方法 ,该方法灵敏度高 ,快速 ,重复性 、稳定性好 ,环
境友好;相对于 HPLC,具有分离速度快 ,样品耗量
少 ,毛细管容易清洗 ,成本低等特点 [ 9] ,可以作为控
制青叶胆药材质量的新型 、快速 、有效的分析方法 。
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(2):79
(本文于 2009年 6月 22日修改回)
安评中心举行奠基十周年庆典暨
首届药物安全评价国际研讨会在北京召开
　　国家药物安全评价监测中心奠基十周年庆典暨首届药物安全评价国际研讨会于 12月 2日至 3日在
亦庄经济技术开发区举行。副所长王军志主持庆典仪式并宣读了全国人大常委会副委员长 、中检所原所
长桑国卫院士的贺信 ,党委书记 、所长李云龙致欢迎词 ,国家食品药品监督管理局副局长边振甲以及科技
部 、卫生部有关部门的领导到会祝贺并讲话 。原 JICA专家代表专程从日本赶来参加了庆典仪式和学术研
讨会 。
庆典结束后 ,举行了首届药物安全评价国际研讨会 ,来自中国 、日本 、美国的专家学者围绕药物安全与
公众健康主题 ,就药物安全性评价领域的热点问题进行了深入的探讨和交流。
详见中检所网站
—2043—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(12)