全 文 ：· 3760 · 中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年9月第31卷第9期 CJTCMP , September 2016, Vol . 31, No. 9
·研究报告·
HPLC法测定喉毛花植物中5种有效成分的含量
刘小翠1,2,3，赵英1,2,3，曾擎屹1,2,3，林鹏程1,2,3
（1青海民族大学药学院，西宁 810007；2青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，西宁 810007；
3青海省药物分析重点实验室，西宁 810007）
摘要：目的：建立反相高效液相色谱法同时测定喉毛花植物中绿原酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、
槲皮素的含量。方法：采用ZORBAX SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以流动相甲醇和水（含0.04%磷
酸）的比例在0-45min内由10∶90至60∶40线性梯度洗脱，45-50min内60∶40等度洗脱，流速1mL/min，检测波长
254nm，柱温30℃。结果：5种成分均达到基线分离，绿原酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、槲皮素的线性
范围分别为0.0495-0.99μg（r=0.9998），0.0515-1.03μg（r=0.9999），0.06-1.2μg（r=0.9998），0.0495-0.99μg
（r=0.9998），0.0495-0.99μg（r=0.9999）；回收率为100.8%（RSD=2.51%），100.7%（RSD=0.91%），100.2%
（RSD=2.89%），99.6%（RSD=0.85%），99.8%（RSD=1.36%）。结论：该方法测定快速，结果准确、可靠。
关键词：反相高效液相色谱；喉毛花；绿原酸；獐牙菜苦苷；龙胆苦苷；獐牙菜苷；槲皮素
基金资助：青海省自然科学基金项目（No.2014-Z-925）
Determination of fi ve effective components in Comastoma pulmonarium by HPLC
LIU Xiao-cui1,2,3, ZHAO Ying1,2,3, ZENG Qing-yi1,2,3, LIN Peng-cheng1,2,3
( 1College of Pharmacy, Qinghai University for Nationalities, Xining 810007, China; 2Key Chemical Research Laboratory of Plant
Resources of Tibet Plateau of Qinghai Province, Xining 810007, China; 3Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis of
Qinghai Province, Xining 810007, China )
Abstract: Objective: To establish a quantitative method of simultaneously determination of chlorogenic acid,
swertiamarin, gentiopicroside, sweroside and quercetin in Comastoma pulmonarium by reverse phase high-performance liquid
chromatography (RP-HPLC). Methods: The samples were separated on the chromatographic column of ZORBAX SB-C18
(250mm×4.6mm, 5μm) which was eluted with the mobile phase of methanol and water (containing 0.04% phosphoric acid). The
ratio of methanol and water was eluted in a lineargradient from 10:90 to 60:40 within 0-45min, and isocratic elution was applied
in 60:40 within 45-50min; the fl ow rate was 1mL/min; the detected wavelength was 254nm and column temperature was 30℃.
Results: Five compounds were base-isolated. The linear ranges of chlorogenic acid, swertiamarin, gentiopicroside, sweroside,
and quercetin were 0.0495-0.99μg (r=0.9998), 0.0515-1.03μg (r=0.9999), 0.06-1.2μg (r=0.9998), 0.0495-0.99μg (r=0.9998),
and 0.0495-0.99μg (r=0.9999) respectively; the average recoveries were 100.8% (RSD=2.51%), 100.7% (RSD=0.91%), 100.2%
(RSD=2.89%), 99.6% (RSD=0.85%), 99.8% (RSD=1.36%) respectively. Conclusion: The method of determination is time-saving
with accurate and reliable results.
Key words: RP-HPLC; Comastoma pulmonarium; Chlorogenic acid; Swertiamarin; Gentiopicroside; Sweroside;
Quercetin
Funding: Natural Science Foundation of Qinghai Province (No.2014-Z-925)
通讯作者：林鹏程，西宁市八一路72号青海民族大学药学院修业楼208室，邮编：810000，电话：0971-8804649，E-mail：qhlpc@126.com
藏药喉毛花Comastoma pulmonarium (Turcz.) Toyohuni系
龙胆科喉毛花属植物。又名藏茵陈，藏药名桑斗，主要分布于
西藏、青海、甘肃、四川西部等地，海拔3 000-3 500m亚高山草
甸、林缘等生境[1]。《晶珠本草》记录喉毛花为藏蒙医常用药
材，性味苦寒，有利湿祛痰、清热解毒、舒肝利胆等功效[2]。现
代药理学研究表明璋牙菜苦苷有提高皮肤机能、促进毛发生
长、抑制中枢神经、镇痛和抗炎等作用；龙胆苦苷有促进胃液
分泌、抗原虫和抗炎作用；研究表明，绿原酸具有抑菌、抗病
毒、抗炎、解热、抗过敏等多种药理功能，并可用于食品保鲜，
可有效防止饮料和食品的腐败变质[4-7]；槲皮素具有非常广泛的
生理和药理活性，有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌、抗病毒、抗
癌等作用[8]。超声法相对于索氏法及回流法具有提取快速、完
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全、简便、次数少等特点[9]。为进一步深入研究喉毛花，本课题
组建立了超声提取、HPLC同时测定喉毛花中5种有效成分含量
的分析方法，该方法具有快速、灵敏、准确，可靠，重复性好等
特点，对评价药材质量及新药源的研究具有重要意义。
材料
1. 仪器 Ag i l en t 12 0 0液相色谱仪，DAD检测器，
Chemstation色谱工作站（安捷伦科技有限公司）；HH-4数显恒
温水浴锅（常州国华电器有限公司）；FZ102微型植物试样粉
碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；AUW-220D电子天平（日
本岛津）；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）
Rotavapor R-3旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。
2. 试药 对照品（均由中国药品生物检定所提供）：
獐牙菜苷（Swer o s ide，批号：PN1125SA13）、獐牙菜苦
苷（Swe r t i a m a r i n，批号：MUST-13 0 70 2 0 3）、龙胆苦
苷（Gent iopicr o s ide，批号：MUST-13082205）、绿原酸
（Chlorogenic acid，批号：110753-200413）、槲皮素（Quercetin，
批号：100081-200907）甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂
为分析纯。
3. 样品采集 喉毛花于2014年8月采自青海、西藏等地，经
青海民族大学药学院林鹏程教授鉴定位喉毛花，阴干后粉碎过
80目筛，冷藏保存。
方法与结果
1. 对照品储备液 精密称取对照品绿原酸0.99mg、獐牙
菜苦苷1.03mg、龙胆苦苷1.20mg、獐牙菜苷0.99mg、槲皮素
0.99mg，分别置1mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成相应
浓度的对照品储备液，使用时稀释成所需浓度。
2. 样品溶液 精密称取粉碎至80目的样品1g，加人甲
醇10mL，超声提取30min，抽滤，以甲醇洗涤滤渣2次，每次
1mL。滤渣重复上述操作，所得滤液与前1次滤液合并，定容至
25mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用在选定色谱条件下测定
有效成分的含量。
3. 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18（250mm×4.6mm，
5μm）色谱柱；流动相：甲醇和水（含0.04%磷酸）的比例以流动
相甲醉和水（含0.04%磷酸）的比例在0-45min内由10∶90至60∶40
线性梯度洗脱，45-50min内60∶40等度洗脱，流速1mL/min，
检测波长254nm，柱温30℃。该色谱条件下绿原酸、獐牙菜苦苷、
龙胆苦苷、獐牙菜苷、槲皮素5种成分均被洗脱且达到基线分
离，保留时间分别为19.5、21.5、23.6、25.1、46.2min，见图1。
4. 线性关系考察 精密量取5种对照品储备液，以甲醇
配制浓度分别为：绿原酸0.0099、0.0495、0.099、0.0485、
0.198mg/mL，獐牙菜苦苷0.0103、0.0515、0.103、0.1545、
0.206mg/mL，龙胆苦苷0.012、0.06、0.12、0.18、0.24mg/mL，
獐牙菜苷0.0099、0.0495、0.099、0.1485、0.198mg/mL，槲皮
素0.0099、0.0495、0.099、0.1485、0.198mg/mL的混合对照品
标准液系列溶液，每次进样5μL，以峰面积的积分值定量，测
得绿原酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、槲皮素的回归
方程。绿原酸：A=3 130.9X+1.5607，r=0.9998；獐牙菜苦苷：
A=5 504.5X+2.7398，r=0.9999；龙胆苦苷：A=3 387.7X+3.3235，
r=0.9998；獐牙菜苷：A=4 016.6X+5.9086，r=0.9998；槲皮素：
A=3 5183X-14.694，r=0.9999。
线性范围分别为0.0495-0.99、0.0515-1.03、0.06-1.2、
0.0495-0.99、0.0495-0.99μg。
图1 5种对照品（A）和喉毛花甲醇提取物（B）色谱图
注：1. 绿原酸；2. 獐牙菜苦苷；3. 龙胆苦苷；4. 獐牙菜苷；5. 槲
皮素。
时间（min）
吸
光
度（
mA
U）
吸
光
度（
mA
U）
A
B
时间（min）
5. 精密度试验 取浓度为0.0495mg/mL绿原酸、0.0515mg/
mL獐牙菜苦苷、0.0600mg/mL龙胆苦苷、0.0495mg/mL獐牙菜
苷、0.0495mg/mL槲皮素混合对照品溶液，在选定的色谱条件
下测定色谱峰的峰面积，计算得RSD分别为0.92%、0.66%、
0.85%、0.76%、0.69%（n=6），表明仪器精密度良好。
6. 重复性试验 精密称取喉毛花样品1.0g共6份，按“2.”
项下方法操作，在选定的色谱条件下测定绿原酸、獐牙菜苦
苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、槲皮素的含量，计算得RSD分别为
1.40%、2.00%、2.90%、1.37%、1.30%（n=6），表明方法重复性
良好。
7. 稳定性试验 精密称取喉毛花样品1.0g，按“2.”项下方
法操作，分别在0、2、4、6、8h时分别进样，测定绿原酸、獐牙
菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、槲皮素的峰面积，计算得RSD分
别为1.40%、1.80%、2.10%、1.34%、1.20%（n=5），表明样品溶
液在8h内稳定。
8. 回收率试验 分别取已知含量的喉毛花样品约0.1、
0.01、0.1、0.05、0.01g平行测6份，分别加入一定量的绿原
酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、槲皮素的对照品，
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按“2.”项下的方法操作，测定峰面积，计算加标回收率分
别为100.8%（RSD=2.51%），100.7%（RSD=0.91%），100.2%
（RSD=2.89%），99.6%（RSD=0.85%），99.8%（RSD=1.36%），
证明该方法具有良好的回收率。结果见表1。
表1 加样回收率试验结果
成分 称样量（mg）
样品
含量
（mg）
加入量
（mg）
测定量
（mg）
回收率
（%）
平均
回收率
（%）
RSD
（%）
绿原酸 103.50 1.08 0.87 1.98 103.4 100.8 2.51
105.20 1.10 0.89 2.03 104.4
100.60 1.05 1.06 2.09 98.1
107.30 1.13 1.15 2.29 100.8
101.20 1.06 1.30 2.35 99.2
104.40 1.09 1.32 2.40 99.2
獐牙菜
苦苷
10.40 3.48 2.80 6.30 100.7 100.7 0.91
10.30 3.45 2.75 6.25 101.8
12.20 4.08 4.05 8.20 101.7
11.20 3.75 3.73 7.51 100.8
11.10 3.72 4.50 8.19 99.3
11.70 3.92 4.67 8.61 100.4
龙胆苦苷 106.70 0.91 0.73 1.62 97.2 100.2 2.89
105.20 0.89 0.69 1.60 102.8
101.20 0.86 0.87 1.71 97.7
108.90 0.92 0.95 1.90 103.1
107.90 0.92 1.01 1.91 98.0
105.40 0.89 1.07 1.99 102.8
獐牙菜苷 50.30 3.04 2.45 5.46 98.7 99.6 0.85
52.10 3.15 2.52 5.65 99.2
52.30 3.16 3.18 6.32 99.3
53.20 3.22 3.25 6.50 100.9
51.20 3.09 3.74 6.81 99.4
52.50 3.17 3.82 7.01 100.5
槲皮素 10.30 1.17 0.95 2.11 98.9 99.8 1.36
10.50 1.19 0.96 2.14 98.9
10.90 1.24 1.23 2.49 101.6
10.70 1.21 1.22 2.45 101.5
11.20 1.27 1.54 2.79 98.7
10.40 1.18 1.43 2.60 99.3
9. 喉毛花中有效成分的测定 取“2.”项下制备的样品溶
液按上述色谱条件进行分析，经DAD检测器检测上述5种待测
组分的峰纯度，且其紫外光谱与对照品一致后，按外标法以峰
面积积分值计算，得5种有效成分的含量（每个样品重复进样3
次，取平均值）：绿原酸1.079%，獐牙菜苦苷33.543%，龙胆苦
苷0.856%，獐牙菜苷6.063%，槲皮素11.344%。
讨论
1. 检测波长的确定 对照品溶液进样后，利用DAD检测器
在200-400nm扫描其吸收光谱，对照品在254nm波长处有较高
的吸收峰，选择该波长为检测波长。
2. 提取方法 确定参照文献[10]，比较了不同提取方法
（超声和热回流）、提取时间（15、30、45、60min）对提取率的
影响，结果发现，超声提取法优于热回流提取法，且超声提取
30min即可将有效成分提取完全，故该试验采用超声提取法。
3. 流动相的选择 绿原酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙
菜苷、槲皮素的色谱峰易拖尾。研究发现，在水中加入0.04%
（V/V）磷酸时可改善绿原酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜
苷、槲皮素的峰形。故选择甲醇和含0.04%磷酸的水作流动相。
4. 喉毛花植物中的5种有效成分含量的比较 由表1结果
可见，喉毛花植物中5种有效成分含量不同，其中，獐牙菜苦苷
中含量最高占33.543%，龙胆苦苷的含量最低占0.856%。
5. 小结 本研究所建方法具有提取简便、快速，分析结果
准确可靠等特点，对全面评价药物质量及新药的研究有重要的
作用。
参 考 文 献
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[2] 钟伯雄,唐丽,焦建那拉,等.藏药喉毛花总黄酮提取工艺的实
验研究.中国民族医药志,2009,15(6):58-59
[3] 白晓朝.正交试验法优选宁夏产秦艽醇提工艺.中华中医药
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菌作用的比较.中医药导报,2005,11(9):8-9
[6] 李永梅,李莉,柏川,等.金银花的抗腺病毒作用研究.华西药学
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（收稿日期：2015年5月31日）