全 文 ：中图分类号:R151.2　　文献标识码:A　　文章编号:1002-3127(2009)06-0479-03 ·实验研究·
守宫木提取物对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞功能的影响
黄琼 ,熊习昆 ,黄建康 ,蔡玟 ,谭小华 ,黄俊明
(广东省疾病预防控制中心毒理实验所 ,广东 广州 510300)
关键词:守宫木;淋巴细胞增殖;Th1 Th2细胞因子;吞噬功能
基金项目:广东省科技计划项目(2006B20501009);广东省中医药局科研
课题(2007384)
作者简介:黄琼 ,博士生 ,研究方向:食品毒理学和免疫毒理学。
　　守宫木[ Sauropus androgynus(L)Merr , SA ] ,大戟科
守宫木属 ,别名天绿香 、树仔菜 、树菜 、越南菜和泰国枸
杞菜等 ,在我国华南地区和东南亚地区有较长食用历
史[ 1] 。郭巨先等[ 2] 曾对小鼠的实验研究表明守宫木可
能有一定蓄积毒性 ,不适宜作为蔬菜长期日常食用 ,这
项研究结果的公布引起媒体 、市民和商家的极大反响。
其实早在 1994年 ～ 1995年间 ,台湾地区连续发生阻塞
性细支气管炎的流行和爆发 ,多项人群流行病学的研
究证实病因可能与生吃一种减肥蔬菜———守宫木有
关[ 3-5] ,2005年日本学者也发表了类似病例报道[ 6] 。但
至今关于守宫木引起阻塞性细支气管炎的病理机制仍
然不明了 ,动物实验研究的报道也是众说纷纭[ 2 ,7] 。为
全面系统地评估守宫木的食用安全性 ,本项目组采集
我国海南产守宫木鲜样 ,采取统一的前处理提取方法 ,
对其细胞毒性 、遗传毒性 、亚急性和亚慢性毒性 、免疫
毒性等进行系统研究和分析。本研究从小鼠脾淋巴细
胞增殖能力 、细胞因子分泌功能和腹腔巨噬细胞的吞
噬功能的角度 ,分析守宫木对免疫系统的影响和可能
机制 。
1　材料与方法
1.1　材料　守宫木(Sauropus androgynus(L)Merr , SA)
于早春二月采自海南省五指山县 ,经华南师范大学生
命科学学院高峰教授鉴定 。守宫木嫩芽 160 g ,加纯水
240 ml低温研磨 ,低温超声破碎 ,过滤 ,低温真空浓缩
得50 ml提取液 ,回收率为 86.75%,1 ml提取液相当
于3.2 g 守宫木鲜样 ,0.22μ滤膜除菌后 ,用 RPMI1640
培养基分别稀释成 25 , 50 , 100 , 200 , 400 , 800 和
1 600 mg ml浓度的受试样品备用。
SPF 级 BALB C雌性小鼠 ,6 ～ 8周龄 ,体重 18 ～ 22
g 。由南方医科大学实验动物中心提供。合格证号:
SCXK(粤)2006-0015 ,质量合格证编号:0040118。颗粒
饲料由南方医科大学实验动物中心提供 。动物实验
室:SPF 级 ,使用许可证号:SYXK(粤)2003-0011 ,室温
(22±2)℃;湿度 50%～ 75%。
小鼠 Th1 Th2(IL-2 , IL-4 , IL-5 , TNF , IFN-γ)CBA 试
剂盒(Cat:551287)和流式细胞仪(FACS Calibur)为美国
Becton Dickinson 公司产品;CASY DT 型快速细胞分析
仪为德国 SCH RFE SYSTEM公司产品;RPMI1640培养
液为美国GIBCO 公司产品(Cat:C22400);伴刀豆球蛋
白A(ConA)为美国 Worthington Biochemical 公司产品
(Cat:50K904J);脂多糖(LPS)为美国 Sigma公司产品。
1.2　小鼠脾淋巴细胞分离 、分组及检测　无菌取 10
只小鼠脾分别制备成单细胞悬液 ,用 CASY DT 型快速
细胞分析仪计数活淋巴细胞数 ,调整细胞浓度为 6×
10
6 ml ,然后将各细胞悬液分至 2块 96孔培养板中 ,其
中一板进行ConA诱导的T 淋巴细胞增殖反应 ,另一板
进行 LPS 诱导的 B淋巴细胞增殖反应 ,守宫木提取物
终浓度分别为 10 、20 、40 、80 、160和 320 mg ml ,ConA和
LPS终浓度分别为 5和 1 μg ml ,置体积分数为 5%的
CO2 ,37 ℃培养 72 h后 ,收集 ConA诱导的 T 淋巴细胞
增殖反应孔培养上清 ,755 g 4 ℃离心 5 min后取上清 ,
使培养上清中所含 Th1 Th2细胞因子浓度进入标准曲
线浓度范围 。取连续倍比稀释的标准品和待测样品 ,
按照 CBA试剂盒说明书完成样品孵育步骤并对流式
细胞仪进行设置 ,然后用流式细胞仪和 CBA分析软件
获取数据并分析 。
1.3　小鼠腹腔巨噬细胞分离 、分组及功能分析　参照
本实验室所建立的流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞
吞噬功能的方法 ,小鼠腹腔巨噬细胞收集及荧光微球
前处理方法见文献[ 8] ,收集 6只 BALB C小鼠腹腔巨
噬细胞各 2ml ,细胞浓度为4 ～ 6×105 ml ,分至 8孔 ,与
调理后的荧光微球分别与终浓度为 0 、5 、10 、20 、40 、80 、
160和 320 mg ml的守宫木提取物37 ℃避光孵育 2 h ,
冷PBS 洗涤 1次后 , 70 μm 过滤器过滤后上流式细胞
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仪分析吞噬比例(PP)和吞噬指数(PI)。
1.4　统计学方法　实验数据经 SPSS 10.0统计软件包
处理并分别进行非参数 Mann-Whitney 检验(淋巴细胞
增殖功能和细胞因子含量比较)、单因素 LSD方差分
析(巨噬细胞吞噬功能比较)和 Pearson相关性检验(相
关性分析)。
2　结果
2.1　守宫木提取物对 ConA和 LPS诱导小鼠脾淋巴细
胞增殖功能的影响　小鼠脾淋巴细胞在体外与守宫木
提取物和 ConA 或 LPS 共培养 72 h 后 , 10 ～ 320 mg ml
剂量组淋巴细胞增殖能力均明显低于 ConA 单独培养
对照组 ,剂量-反应关系明显 ,差异有统计学意义(P <
0.01 ,图 1)。
　　与对照组比较 ,＊＊P <0.01
图 1　守宫木对 ConA 和 LPS诱导的淋巴细胞
增殖功能的影响
与对照组比较 , ＊P<0.05 ,＊＊P <0.01;PP:吞噬比例 , PI:吞噬指数。
图 2　守宫木提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
2.2　守宫木提取物对小鼠脾淋巴细胞 Th1 Th2细胞
因子谱的影响　小鼠脾淋巴细胞在 ConA 刺激作用下
培养 72 h后 , Th1细胞因子表达水平均明显高于 Th2
细胞因子 ,尤其是 TNF 和 IFN-γ表达较高 ,Th2细胞因
子均低于 2.5 pg ml检出限 。与对照组比较 ,10 ～ 320
mg ml剂量组守宫木提取物对 TNF 和 IFN-γ细胞因子
的分泌均有明显抑制作用 , 10 ～ 20 mg ml剂量组守宫
木提取物可刺激 IL-2表达增加 ,而40 ～ 320 mg ml剂量
组 IL-2表达又降低 ,差异有统计学意义(P<0.05或 P
<0.01 ,表 1)。
表 1　守宫木提取物对小鼠脾淋巴细胞
Th1 细胞因子的影响( x±s)
组别
(mg ml)
Th1细胞因子
TNF(pg ml) IFN-γ(MFI) IL-2(MFI)
对照组 482.2±174.0 1696.1±433.8 20.9±10.2
10 124.3±85.4＊＊ 139.9±153.6＊＊ 169.0±187.8＊＊
20 95.0±35.1＊＊ 89.5±134.2＊＊ 95.2±78.3＊＊
40 64.3±22.5＊＊ 8.8±6.7＊＊ 9.3±8.6＊
80 33.9±9.4＊＊ 5.5±0.3＊＊ 3.5±0.3＊＊
160 17.4±1.8＊＊ 6.1±0.5＊＊ 3.8±0.3＊＊
320 13.0±3.7＊＊ 8.3±0.6＊＊ 4.7±0.3＊＊
　　注:与对照组比较 ,＊＊P<0.01, ＊P <0.05, n=8;MFI:平均荧光强度。
2.3　小鼠脾淋巴细胞增殖和细胞因子分泌功能的相
关分析　ConA和 LPS 诱导小鼠脾淋巴细胞增殖功能
呈正相关 ,两者均与 TNF 、IFN-γ表达水平呈正相关 ,而
TNF 与 IFN-γ表达水平也呈正相关(P<0.01 ,表 2)。
表 2　小鼠脾淋巴细胞增殖和细胞因子
分泌功能的Pearson 相关分析
因素 B淋巴细胞增殖 TNF(pg ml) IFN-γ(MFI) IL-2(MFI)
T 淋巴细胞增殖 0.881■＊＊ 0.898＊＊ 0.655＊＊ 0.244
B淋巴细胞增殖 0.739＊＊ 0.606＊＊ 0.114
TNF(pg ml) 0.739＊＊ 0.768＊＊ 0.136
　　注:■Pearson 相关系数 ,相关性检验 , ＊＊P<0.01;MFI:平均荧光强度;n=64 。
2.4　守宫木提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的
影响　20 ～ 160 mg ml剂量组(PP)和 10 ～ 320 mg ml剂
量组(PI)均较对照组高 ,差异有统计学意义(P <0.05
或 P <0.01 ,图 2)。
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3　讨论
Lai等[ 7] 曾对守宫木能否引起SD大鼠发生阻塞性
细支气管炎进行了研究 ,结果表明守宫木不会引发 SD
大鼠的肺部损伤。Chang 等[ 9] 进行的病理研究中认为
淋巴细胞尤其是 T细胞介导的免疫反应在守宫木诱发
的阻塞性细支气管炎发生发展过程中发挥重要的作
用。
基于以上实验结果 ,本研究选择 BALB C 小鼠作
为实验动物 ,分析了守宫木对其脾 T 、B淋巴细胞体外
增殖功能 、细胞因子分泌功能和腹腔巨噬细胞吞噬功
能的影响 ,淋巴细胞功能分析结果表明:10 ～ 320 mg ml
的守宫木提取物对ConA 和 LPS 诱导的 T 和 B 淋巴细
胞增殖功能 、TNF 和 IFN-γ的分泌均有抑制作用 ,且两
两均呈正相关关系 ,剂量-反应关系明显 ,说明守宫木
体外能显著抑制淋巴细胞的增殖和活化 ,剂量越高抑
制作用越明显。但有趣的是 IL-2的分泌和表达结果 ,
低剂量的守宫木提取物(10 ～ 20 mg ml)能刺激 IL-2的
分泌 ,而相对高剂量的守宫木提取物(40 ～ 320 mg ml)
却表现为明显抑制作用 ,说明 20 ～ 40 mg ml似乎是影
响 IL-2表达的转折点 ,这种 IL-2刺激性的升高表达是
否与Th1细胞因子的内部平衡状态有关值得关注 ,是
否可以认为20 ～ 40 mg ml剂量是守宫木对小鼠脾淋巴
细胞的相对刺激剂量范围 。本项目组前期研究结果也
发现 20和 40 mg ml剂量组反应很特殊 ,染毒 24h时未
观察到细胞数量 、形态与对照组有明显差别 ,但在染毒
48和 72h时就会明显地发现这 2个剂量组的细胞数量
特别多 、细胞边界不清楚 、层次模糊和形态变异较
大[ 10] 。后续研究需要重点对 20 ～ 40 mg ml剂量间的
免疫反应表现进一步深入探讨 。
相比淋巴细胞的反应 ,守宫木对小鼠腹腔巨噬细
胞的刺激剂量范围似乎更宽 ,具体表现为:10 ～ 320
mg ml剂量范围的守宫木提取物均能提高腹腔巨噬细
胞对荧光微球的 PI ,但 320 mg ml剂量开始呈现下降
趋势 ,巨噬细胞吞噬功能是机体防御外界损伤的第一
道防线 ,相对低剂量守宫木能刺激其吞噬功能是否代
表机体的一种自我保护能力和代偿反应 ,也值得进一
步的探讨和分析 。本研究结果表明巨噬细胞与淋巴细
胞对守宫木的细胞毒性反应呈现剂量差别 ,与有关观
点一致 ,即不同细胞耐受同一种物质的毒性剂量可能
不相同 ,从本研究结果分析守宫木细胞毒性 ,淋巴细胞
相对较巨噬细胞更为敏感[ 11] 。利用细胞毒性的研究
结果寻找物质的可能毒作用途径已成为毒理学体外实
验研究的新热点 ,同时也可为毒物作用靶器官或组织
的寻找提供筛选手段 ,应该是体外细胞毒理学未来发
展的方向和重点[ 12] 。
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(收稿日期:2009-04-07)
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