全 文 ：江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.), 2009, 25(3):538～ 541
羊角槭基因组 DNA提取及 SRAP-PCR体系优化
李倩中 1 , 刘晓宏 2 , 苏家乐1 , 丛 郁 1
(1.江苏省农业科学院园艺研究所 ,江苏 南京 210014;2.扬州大学农学院 ,江苏 扬州 225009)
收稿日期:2008-12-21
基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目 [ CX(07)610] ;江苏
省林业三项工程项目 [ lysx(2007)16]
作者简介:李倩中(1968-),男,江苏沛县人 , 硕士 ,副研究员 ,主要从
事花卉苗木科研工作。 (Tel)025-84390223;(E-mail)
lqz20054321@yahoo.com.cn
摘要: 采用 CTAB法 、SDS法 、偏重亚硫酸钠法提取槭属中羊角槭基因组 DNA,通过 DNA含量测定 、琼脂糖凝
胶电泳检测对所提 DNA质量进行分析。结果表明 , 3种提取方法中 CTAB法最适合提取羊角槭基因组 DNA,所得
DNA的质量和纯度较高。以 CTAB法提取的 DNA为模板进行 SRAP扩增反应 , 对 SRAP反应体系的 dNTPs浓度 、
Mg2+浓度 、引物浓度 3个主要影响因子进行筛选。获得羊角槭 SRAP最优反应体系为:50 μl的 PCR体系中含有
DNA模板 100ng、10×PCRBuffer(不含 Mg2+)、Mg2+2.5mmol/L、dNTPs0.2 mmol/L、引物 0.5μmol/L、TaqDNA聚
合酶 1.0U。
关键词: 羊角槭;基因组 DNA;提取;SRAP;体系优化
中图分类号: Q781 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2009)03-0538-04
ExtractionofGenomicDNAfromAceryangjuechiandSystemOptimiza-
tionofSRAP-PCR
LIQian-zhong1 , LIUXiao-hong2 , SUJia-le1 , CONGYu1
(1.InituteofHorticulture, JiangsuAcademyofAgriculturalSciences, Nanjing210014, China;2.ColegeofAgriculture, YangzhouUniversity, Yangzhou
225009, China)
Abstract: TofindarapidandeffectiveDNAextractionmethodforAcer, CTABmethod, SDSmethodandNa2S2O5
methodwerecompared.TheDNAwasdetectedbyEppdendorfBiophotometerandagarosegelelectrophoresis.Theresults
showedtheCTABmethodwasmuchbetterthantheothersinextractingDNAofAceryangjuechi, andwhichwassuitablefor
SRAP-PCRanalysis.TheconcentrationsofdNTPs, Mg2+andprimerswhichafecttheSRAP-PCRreactionswereoptimized
inordertoestablishtheSRAPmolecularmarkersysteminAcer.Theoptimumsystemwasasfolows:templateDNA100
ng, 10×PCRBufer(Mg2+free), Mg2+2.5 mmol/L, dNTPs0.2 mmol/L, primers0.5 μmol/L, TaqDNApolymerase
1.0U.Thetotalvolumeofreactionwas50 μl.
Keywords: Aceryangjuechi;genomicDNA;extraction;SRAP;systemoptimization
DNA是遗传信息的载体 ,快速提取高分子量 、
高纯度的 DNA是进行遗传转化 、基因文库的构建 、
核酸分析等研究的前提。由于不同生物材料所含的
物质成分及含量不同 ,其 DNA提取所采用的方法也
有所不同[ 1-6] 。羊角槭(Aceryangjuechi)叶中含有大
量的二芳基庚烷衍生物类化合物 、苯丙素类化合物 、
萜类 、甾体类 、黄酮类等次生物质 ,具有很高的营养
保健价值 [ 7] ,但同时也增加了 DNA的提取难度。笔
者曾用 SDS法 [ 8]提取羊角槭 DNA,未得到理想的结
果。在参考 CTAB法[ 9] 、偏重亚硫酸钠法[ 10]基础上
适当改进 ,发现 CTAB法较适合提取羊角槭基因组
DNA,并可直接用于 SRAP分子标记(Sequence-re-
latedamplifiedpolymorphism,序列相关扩增多态性)
分析 。
SRAP分子标记技术简便 、快速 ,不需预知物种
的序列信息 ,近年来在植物遗传多样性分析 、种质鉴
538
定 、遗传连锁图的构建 、基因连锁标记的寻找与基因
定位和比较基因组学研究等 [ 11-14]方面得到广泛应
用 。为建立槭属植物 SRAP技术 ,本试验对 SRAP-
PCR反应体系的主要影响因素进行了优化 ,以期为
槭属植物遗传多样性分子标记研究提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 材料及试剂
1.1.1 材料 取自于江苏省南京市中山植物园 。
采集羊角槭植株幼嫩叶片装入自封袋 ,置于冰盒中
带回实验室 , -20℃冷冻保存 。
1.1.2 试剂 Mg2+、dNTPs、10×PCRBufer(不含
Mg2 +)、TaqDNA聚合酶 、DL2000 DNAMarker均购
自宝生物工程(大连)有限公司;SRAP引物 me1、
em7委托上海生工公司合成。引物序列为 me1:5′-
TGAGTCCAAACCGGATA-3′;em7:5′-GACTGCGT-
ACGAATTCAA-3′。
1.2 DNA提取方法
1.2.1 CTAB法 参照陈大明[ 9]的 CTAB法 ,并作
适当改良。称取 0.1 g叶片在液氮中研磨至粉末 ,
迅速转入含有 1.8 mlCTAB提取液的 2 ml离心管
中 ,充分混匀 , 4 ℃、13 000 r/min离心 15 min。弃去
上清液后重新加入 2 ml提取缓冲液悬浮沉淀 ,以同
样条件离心 15 min,弃去上清液。用 2 ml经 65 ℃
预热的裂解缓冲液悬浮沉淀 , 65 ℃水浴 30 ～ 60
min,不时轻轻摇动。加入 2ml氯仿-异戊醇 -乙醇溶
液 ,轻轻颠倒混匀 ,室温下静置 10min, 4℃下 13 000
r/min离心 15 min,小心地将上清液移入新的离心
管中 ,加入 1/10体积 3 mol/L(pH值为 5.2)醋酸钠
和 2倍体积冰无水酒精。混匀 , -20 ℃静置 2 ～ 4
h。出现 DNA形成絮状沉淀。钩出 DNA絮团 ,在
70%乙醇中漂洗 ,在超净工作台上风干 DNA。 20 μl
1×TE缓冲溶液溶解 DNA,于 -20 ℃保存备用。
1.2.2 SDS法 参照李珊等 [ 8]的方法。
1.2.3 偏重亚硫酸钠法 参照高志红等 [ 10]的偏重
亚硫酸钠法 ,并作适当改良 。称取 0.1 g叶片在液
氮中研磨至粉末 ,迅速转入含有 1.8 mlBufer匀浆
液 、2%巯基乙醇的 2 ml离心管中 ,充分混匀 , 65 ℃
水浴 30 ～ 60 min,期间颠倒几次 。取出后 4 ℃、
13 000 r/min离心 15min。上清液加入等体积的氯
仿 -异戊醇 -乙醇抽提 2次 。 200μl上清液中加入 10
mol/L醋酸胺 90 μl和 2倍体积的冰无水酒精 ,室温
静置 15 min, 4 ℃、8 000 r/min离心 5 min,弃上清
液。用 75%酒精洗涤 DNA沉淀 2次。在超净工作
台上风干 DNA。用 20 μl1×TE溶液溶解 DNA,于
-20 ℃保存备用。
1.3 DNA含量测定
使用 EppdendorfBiophotometer蛋白核酸测定仪
测定 。
1.4 琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖浓度 0.8%,电泳电压 100 V,应用 1 ×
TAE电泳缓冲液 , DYY-4C型电泳仪 , Tanon2 500紫
外凝胶成像系统观察并拍照 。
1.5 SRAP扩增反应体系优化 [ 15]
分别对影响 SRAP扩增反应体系的 3个主要因
素设 5个浓度梯度:dNTPs(0.10、0.15、0.20、0.25、
0.30 mmol/L)、 Mg2+ (1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0
mmol/L)、引物浓 度 (0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0
μmol/L)。以 CTAB法提取的基因组 DNA为 PCR
扩增模板 , 在 MyCyclerTm PCR仪上进行 50 μlSRAP
扩增反应。 PCR反应程序:94 ℃ 5 min;94 ℃
1min, 35 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 5个循环;94 ℃
1min, 50 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 30个循环;72 ℃
10min。 4 ℃保存。PCR产物在含有 EB的 1.8%琼
脂糖胶上电泳 ,用 Tanon2500紫外凝胶成像系统观
察并拍照 。
2 结 果
2.1 不同提取方法 、处理对 DNA提取质量的影响
从表 1可以看出 ,不同方法提取的 DNA质量差
异很大。 CTAB法提取的 DNA浓度 665.1 μg/μl,
产率 124.26 μg/g,蛋白质残留少 ,纯度高;SDS法
仅检测到少量 DNA;偏重亚硫酸钠法提取的 DNA
浓度 278.8 μg/μl,产率 47.70 μg/g。一般认为 ,提
取的 DNAOD260 /OD280比值为 1.8≤OD260 /OD280 <
2.0,表明 DNA纯度高[ 16-17] 。因此 , CTAB法最适合
提取羊角槭基因组 DNA,偏重亚硫酸钠法次之 , SDS
法最差。
2.2 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳检测分析
DNA电泳结果(图 1)显示 , SDS法几乎未检测
出 DNA条带;偏重亚硫酸钠法 DNA条带不清晰 ,后
有明显的拖尾;CTAB法中 DNA片段大小较一致 ,
条带清晰完整 ,后面没有明显的拖尾。综合 DNA浓
度检测结果 ,表明 CTAB法提取的 DNA纯度高 、完
539李倩中等:羊角槭基因组 DNA提取及 SRAP-PCR体系优化
表 1 不同方法提取的羊角槭 DNA的 OD值和产率
Table1 ODvalueandproductionrateofDNAfromAceryangjuechiwithdifferentmethodsofextraction
提取方法 DNA浓度(μg/μl) OD260 /OD280 OD260 /OD230 OD260
DNA产率
(μg/g)
CTAB法 665.1 1.84 2.10 0.133 124.26
SDS法 37.3 3.93 0.50 0.008 6.99
偏重亚硫酸钠法 278.8 1.67 1.35 0.056 47.70
整性好 。因此 ,采用 CTAB法提取的羊角槭基因组
DNA较适合作为 SRAP-PCR的模板 。
2.3 DNA样品的 SRAP体系优化
从单因素试验结果(图 2)显示 , dNTPs浓度在
0.10mmol/L时扩增量不够 、条带不清楚 ,而随着浓
度的增大条带逐渐清楚 , 在浓度达到最大的 0.30
mmol/L时条带最为清楚 ,而 0.20 mmol/L和 0.25
mmol/L的浓度也能获得较好的扩增效果 ,从经济方
面考虑 dNTPs的浓度选择 0.20 mmol/L;随着 Mg2+
浓度的升高条带逐渐清晰 ,当 Mg2+浓度达到 3.0
mmol/L时条带变模糊 ,故 Mg2+的最佳浓度为 2.5
mmol/L。引物含量随着浓度升高条带逐渐清晰 ,但
到 1.0 μmol/L时条带变模糊 ,在 0.4μmol/L与 0.6
μmol/L之间较合适 。综合上述分析 ,最佳 SRAP反
应体系为:50 μl的 PCR体系中含有 DNA模板 100
ng、10×PCRBufer(不含 Mg2+)、Mg2 +2.5 mmol/L、
dNTPs0.2mmol/L、引物 0.5μmol/L、TaqDNA聚合
酶 1.0 U。
1～ 6:CTAB法;7 ～ 12:SDS法;13～ 18:偏重亚硫酸法。
图 1 不同方法提取羊角槭 DNA电泳图
Fig.1 ElectrophoresisgraphofDNAofAceryangjuechiextractedbydiferentmethods
1～ 5:dNTPs浓度分别为 0.10mmol/L、 0.15mmol/L、 0.20mmol/L、 0.25mmol/L、 0.30mmol/L;6 ～ 10:Mg2+浓度分别为 1.0 mmol/L、 1.5
mmol/L、2.0mmol/L、 2.5mmol/L、3.0mmol/L; 11 ～ 15:引物浓度分别为 200 pmol/L、 400pmol/L、600pmol/L、800pmol/L、1 000pmol/L;M
为 DL2000DNAMarker。
图 2 dNTPs、Mg2+、引物浓度对SRAP反应的影响
Fig.2 EfeetsofdNTPs, Mg2+, primersconcentrationonSRAPamplification
540 江 苏 农 业 学 报 2009年 第 25 卷 第 3期
3 讨 论
在槭树植物中 ,尤其是羊角槭组织中含有大量
的酚类 、多糖 、色素 、单宁等干扰物质 ,这些物质对
TaqDNA聚合酶的活性有抑制作用 [ 18] ,在 DNA的
提取过程中要有效地控制它们。本试验采用 3种方
法对羊角槭基因组 DNA进行提取 ,经含量测定 、电
泳检测发现 , CTAB法最适合羊角槭叶片基因组
DNA提取 ,可直接用于 SRAP分析。采用 CTAB法
提取的基因组 DNA,干燥时呈透明的白色 ,溶于缓
冲液中无色 ,说明去除色素及次生代谢物的效果好;
OD260 /OD280值在 1.8以上 ,产率高。 SRAP分析带
型清晰 、重复性好。在 DNA提取过程中 ,影响因素
很多 ,如样品研磨要充分 ,速度要快 ,以防 DNA暴露
在空气中而被氧化;抽提后取上清液时 ,防止吸进中
间的杂质。因此 ,要想获得高质量的 DNA,除了注
意方法上的选择外 ,还应在操作技术上严格要求。
PCR扩增反应条件既具保守性 ,又有较大的灵
活性 ,不同的 PCR仪型号及不同的植物材料 ,要不
同的循环程序及反应体系 [ 19-21] ,且同一循环程序和
体系往往在另一物种上不能获得较好的扩增效果 。
本研究建立了适合羊角槭的 SRAP扩增体系 ,为今
后其他槭属植物遗传多样性分子标记提供了技术
支持。
致谢:感谢丛郁博士对本试验提出的宝贵意见
和悉心指导 !
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