全 文 ：收稿日期:2006 - 09 - 18
作者简介:郭凤芝(1981 -),女 ,硕士。研究方向:园林植物生物技术与遗传育种。
*通迅作者:潘东明(1956 -),男 ,教授。研究方向:园艺产品生理生化及产后贮藏保鲜。 Em ail:pdm 666@126. com。
九里香 、柚花瓣 HPL基因保守序列的克隆与分析
郭凤芝 1 , 姜翠翠 1 , 冯　会 2 , 陈桂信 1 , 夏海武 2 , 佘文琴2 , 潘东明 2*
(1.福建农林大学园艺植物遗传育种研究所;2.福建农林大学园艺学院 ,福建 福州 350002)
摘要:根据 GenBank中登录的一些植物的脂氢过氧化物裂解酶基因的保守序列设计引物 , 采用 RT-PCR技术从芸香科的 2
种植物(九里香 、柚)的花瓣中扩增出该基因的 cDNA片段。测序表明 ,片段大小为 512 bp。 2个片段均包含 H PL基因的 4
个活性中心 , 并且同源性很高。
关键词:九里香;柚;脂氢过氧化物裂解酶(HPL)基因;cDNA;克隆
中图分类号:Q785 文献标识码:A 文章编号:1673-0925(2007)01-0073-04
Cloning and sequencing of cDNA encoding conservative regions of hydroperox ide lyase
in petals ofMurraya paniculata , C itrusmaxima
GUO Feng-zhi1 , JIANG Cu i-cui1 , FENG Hu i2 , CHEN Gui-xin1 ,
X IA Ha i-wu2 , SHEWen-qin2 , PAN Dong-m ing2
(1. Institute o fH orticu ltu ra lGene tics and Breed ing;2. Co llege of H orticu lture, Fujian Agriculture
and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, Ch ina)
Abstrac t:PCR prim ers w ere de signed based on the consensus sequence o f som e hydroperox ide lyase (HPL) gene s reg iste red in
GenBank. Two a im ed 512 bp HPL gene-conserving sequence sw ere obta ined by using RT-PCR. Bo th o f the fragm en ts con ta ined the
fou r conserved struc ture dom a ins o f HPL gene and shared high hom o logy each o the r.
K ey words:Murraya pan icula ta;Citrus maxima;hydroperox ide ly ase (HPL) gene;cDNA;clone
脂氢过氧化物裂解酶 (hydrope roxide lyase, HPL)是植物脂氧化途径中脂氧合酶 ( lipoxygenase, LOX)
下游的酶 ,催化 LOX的反应产物 ———脂氢过氧化物裂解生成短链醛 (醇 )和 C12含氧酸[ 1] 。其催化产物中
短链挥发性醛及相应的醇 ,具有芬芳气味 ,是水果 、蔬菜特异气味的主要成分或前体 ,也可作为食品和香水
制造的添加剂 ,有较高的经济价值。
目前 HPL基因的研究主要集中在大田作物和果蔬方面。国外研究人员已从甜椒 [ 2] 、拟南芥 [ 3 - 4] 、番
茄 [ 5 - 6] 、紫花苜蓿[ 7] 、黄瓜 [ 8] 、番石榴 [ 9] 、甜瓜[ 10] 、马铃薯 [ 11] 、西瓜 [ 12]等植物中得到 HPL基因 。如果能克
隆出一些香花植物的 HPL基因 ,并通过基因操作将其转入到一些花色艳丽但缺乏香气的花卉中 ,而使其
产生香气 ,将为花卉香气改良提供一条新的途径[ 13] 。
1　材料与方法
1. 1　材料
供试材料为芸香科的 2种植物九里香 (Murraya paniculata)和柚 (Citrusmaxima)的即将开放花蕾的花
瓣 。花蕾采自福建农林大学植物园。
1. 2　试剂盒和试剂
逆转录试剂盒购自 Fe rmentas公司;寡核苷酸引物委托 Invitrogen公司合成;克隆载体 pGEM-T-Easy
V ec to r购自 Promega公司;DNA片段快速纯化 /回收试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司;Taq
DNA Polymerase、大肠杆菌 DH5α购自北京天为时代科技有限公司;其他均为分析纯试剂 。
亚热带农业研究　　　　　　
Sub tropical Ag riculture Research
第 3卷 第 1期
　 2007年 2月
DOI牶牨牥牣牨牫牫牪牨牤j牣cnki牣subtrop牣agric牣res牣牪牥牥牱牣牥牨牣牥牨牳
1. 3　试验方法
总 RNA的提取采用改良的 CTAB法 [ 14] :以总 RNA为模板 , O ligo(dT)18为引物 ,在反转录酶的作用
下合成 cDNA第一链 ,具体操作按照 Fermentas公司的逆转录试剂盒说明书进行 。根据在 GenBank登录的
甜椒 、拟南芥 、番茄 、紫花苜蓿 、番石榴 、马铃薯 、甜橙等的 HPL基因核苷酸序列设计 2对核苷酸引物 。
P1Ⅰ :5′- ACTACAACAAGCTCCACAACTTCGT - 3′, P2Ⅰ :5′- CACAACTTGCTGTTCATTCTAGGGT - 3′,
P1Ⅱ:5′- CACAACTTGCTGTTCATTCTAGGGT - 3′, P2Ⅱ:5′- GTCAAACAAGCAACGAGAGTCACGT - 3′。
以 cDNA第一链为模板 ,进行巢式 PCR扩增 。第一轮用 P1Ⅰ和 P2Ⅰ ,第二轮用 P1Ⅱ和 P2Ⅱ 。
巢式 PCR第一轮扩增体系:2. 5 μL 10×PCR Buffer、2μL 2. 5mmol L - 1 dNTP、0. 5 μL 10 μmo l L -1
P1Ⅰ 、0. 5μL 10μmol L- 1 P2Ⅰ 、1μL cDNA、0. 3μL 5U μL- 1 TaqDNA Polymerase ,加无菌 ddH2O至 25
μL。扩增条件是:94 ℃, 2m in进行热启动;94 ℃, 30 s;52 ℃, 30 s;72 ℃, 1 m in,共 30个循环;72℃, 10
m in;于 4 ℃保存。第一轮反应结束后 ,将产物稀释 100倍作为第二轮 PCR反应的模板 。第二轮反应的退
火温度为 55 ℃,引物改为第二轮引物 (P1Ⅱ、P2Ⅱ),其余条件与第一轮相同。
将第二轮 PCR扩增产物进行回收纯化后克隆于 pGEM-T Easy V ec to r上 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态
细胞。在含 X-ga l /IPTG的培养基上培养(37 ℃)过夜 ,挑取白色菌落于含有相应抗生素(ampr)的液体 LB
培养基中 ,于 190 r min- 1、37℃培养 12 h左右 ,取菌液进行 PCR检测和鉴定 ,筛选阳性克隆进行测序 ,测
序委托 Inv itrogen公司完成。序列的剪切 、分析和同源性比较用 DNAMAN软件完成 。
2　结果与分析
2. 1　总 RNA提取
电泳结果显示 ,提取的 RNA完整性很好 ,无降解 ,D 260 nm /D280 nm =1. 98,达到了 RT-PCR对 RNA的要求
(图 1)。
2. 2　九里香 、柚花瓣 HPL基因的克隆
将提取的 2种材料总 RNA在反转录酶的作用下合成 cDNA第一链 ,参照甜椒 、拟南芥 、番茄 、紫花苜
蓿 、番石榴 、马铃薯 、甜橙等的 HPL基因的核苷酸保守序列设计 2对核苷酸引物 ,以 cDNA第一链为模板 ,
进行巢式 PCR扩增 ,扩增出 500 bp左右的目标大小条带(图 2)。
A.九里香总 RNA(约 0. 3μg);B.柚总 RNA(约 0. 6μg)。
图 1　九里香 、柚花的总 RNA
Fig. 1　Total RNA from M. paniculata, C. m axim a
A. 2000 bpM arker;B.九里香第 2轮 PCR扩增产物;
C.柚第 2轮 PCR扩增产物。
图 2　九里香 、柚 HPL保守区 PCR扩增电泳图
F ig. 2　PCR am p lification ofHPL gene fragm en ts from
M. paniculata, C. m axim a
　　将目标大小的条带回收后连接到 pGEM-T Easy载体上 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,每种材料从
中挑选 4个白色菌落进行液体培养。菌液进行 PCR检测和鉴定 , 12个菌落的菌液全部鉴定出插入片段
(500 bp左右 )的阳性克隆。每种植物材料挑选其中的一个菌落的菌液样品测序。
2. 3　九里香 、柚花瓣 HPL基因片段的序列分析
2. 3. 1　片段同源性分析　测序结果显示 , 2个片段大小均为 512 bp。将测序得到的 2种材料的核苷酸序
列利用 DNAMAN软件进行同源性分析 ,两者的 HPL基因片段的同源性为 93%。利用 BLAST在 NCB I上
74 亚　热　带　农　业　研　究 第 3卷
进行检索后发现 ,九里香的 HPL基因保守区与甜橙 (AY242385)、粗柠檬(AB077765)的 HPL基因保守区
同源性均为 93%。柚的 HPL基因保守区与甜橙 (AY242385)、粗柠檬 (AB077765)的 HPL基因保守区同
源性分别达到 99%、98%。说明 2个片段均属 HPL基因。 2个片段已经在 GenBank中登陆 ,登陆号为:
DQ179654(九里香 )、DQ179653(柚 )。
2. 3. 2　HPL基因保守区编码的氨基酸序列比较　利用 DNAMAN分析软件将所得的核苷酸序列翻译成氨
基酸序列 ,将其与其他一些植物的 HPL的氨基酸序列进行比较 。结果 (图 3)表明:HPL的保守区氨基酸
序列具有很高的保守性 ,它们有着细胞色素 P450蛋白家族的普遍特征 ———C端具有 4个保守的结构域:
结构域 A、B、C和 D。结构域 A(Ⅰ -螺旋区 )在酶与底物的相互作用中起重要作用 ,其苯丙氨酸和甘氨
酸 —甘氨酸残基在不同植物 HPL蛋白间非常保守;结构域 B中的亮氨酸和脯氨酸残基 ,结构域 D(血红素
结合区 )的脯氨酸 ,半胱氨酸和赖氨酸残基在不同植物 HPL蛋白间也高度保守。不同的 B结构域中络氨
酸在代代和柚中却被半胱氨酸代替;大部分植物(如九里香 、柚 、甜橙)C结构域中有的脯氨酸被丝氨酸取代。
图 3　不同植物 HPL基因编码蛋白的 4个保守结构域序列的同源性比较
F ig. 3　A lignm en t of dedu ced am ino acid sequences of fou r con served structu re dom ains of several p lan ts
3　讨论
HPL基因属于细胞色素 P450基因家族的 CYP74亚家族 ,其具有细胞色素 P450基因家族的特征区
域 , C端都具有 4个保守的结构域 [ 15] 。克隆分离出的 HPL基因片段的同源性比较显示 ,其保守性非常高 ,
尤其是亲缘关系近的植物之间 。大部分植物(如九里香 、柚 、甜橙)C结构域中有的脯氨酸被丝氨酸取代 ,
可能是芸香科植物 HPL的结构特征 。
基因的编码产物脂氢过氧化物裂解酶的催化产物是植物特异气味的主要成分或前体 ,可以抵御微生
物病原体和害虫的侵害[ 16] ,在采后贮藏过程中可以作为抗菌熏蒸剂[ 17] ,诱导防御素的积累 [ 18] ,并与种子
休眠有关 [ 19] 。目前 HPL基因的研究主要集中在提高农作物抗性和改善果蔬风味方面。 Howe et al[ 7]利用
RNA-blo t分析 HPL基因表达情况的结果表明 ,在番茄的不同器官中 , HPL的 mRNA在发育的花中最丰富 。
这个发现暗示了来源于 HPL的产物可能在花香味的产生中担当了一定的角色。 HPL基因可能使花卉产
生新的香气 ,这为花卉香气方面的研究提供了一条途径。目前尚未见香花植物的 HPL基因克隆以及利用
其改善花香的报道。因此本研究下一步打算从香花植物的花瓣中克隆出 HPL基因全长 ,为花卉香味改良
提供参考。
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76 亚　热　带　农　业　研　究 第 3卷