全 文 ：基金项目:民族药材飞龙掌血标准修订及研究基金资助项目［黔科合中药字(2011)5027 号］
作者简介:冉勇华，男，硕士研究生 研究方向:中药活性成分及结构修饰 * 通讯作者:周强，男，主管药师 研究方向:中药、民族药研
究 Tel /Fax:13595117807 E-mail:gyidyyzc@ sina. com
高效液相色谱法同时测定飞龙掌血中橙皮苷等 4 种化学成分的含量
冉勇华1，2，周强1* ，周英2，3，杨世林2(1. 贵阳春科药业技术研发有限公司，贵阳 550081;2. 贵州大学生命科学学院，贵阳 550025;3.
贵州省中药民族药创制工程中心，贵阳 550025)
摘要:目的 建立反相高效液相色谱法( ＲP-HPLC) 同时测定飞龙掌血药材中橙皮苷、氯化两面针碱，白屈菜红碱，毛两面针素
的含量。方法 采用优化色谱条件;色谱柱: Diamonsil-C18柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ;流动相:乙腈( A) -0. 75%冰醋酸( B) ;
梯度洗脱;检测波长: 290 nm;流速: 1. 0 mL·min －1 ;紫外检测器检测; 分别测出其峰面积，采用外标法定量;柱温: 30 ℃。结果
飞龙掌血中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素的线性范围分别为 0. 487 4 ～ 2. 437 2 μg ( r = 0. 999 7 ) ，
0. 030 30 ～ 0. 151 5 μg( r = 0. 999 2) ，0. 062 34 ～ 0. 311 7 μg( r = 0. 999 3) ，0. 024 92 ～ 0. 124 6 μg( r = 0. 999 9) ;平均加样回收
率( n = 6) 分别为 100. 76% ( ＲSD 2. 75% ) 、97. 98% ( ＲSD 1. 25% ) 、100. 07% ( ＲSD 3. 24% ) 、100. 10% ( ＲSD 3. 83% ) 。结论
该方法简便、快速、准确，重现性好，回收率高，可用于飞龙掌血药材中 4 种主要化学成分含量的测定，其结果可为其质量控制、
合理用药及进一步研究开发提供参考。
关键词:反相高效液相色谱法;飞龙掌血;橙皮苷;氯化两面针碱;白屈菜红碱;毛两面针素
doi: 10. 11669 /cpj. 2014. 03. 017 中图分类号:Ｒ931. 71 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2014)03 － 0240 － 04
Simultaneous Determination of Four Effective Components in Toddalia asiatica(L. )Lam by ＲP-HPLC
ＲAN Yong-hua1，2，ZHOU Qiang1* ，ZHOU Ying2，3，YANG Shi-lin2，(1. Guiyang Spring Section Pharmaceutical Ｒesearch
and Development Co.，LTD，Guiyang 550081，China;2. College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China;3.
Guizhou Engineering Center for Innovative Traditional Chinese Medinice and Ethnic Medicine，Guiyang 550025，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To develop a ＲP-HPLC method for simultaneous determination of hesperidin，nitidine chloride，chel-
erythrine，and toddalolactone in Toddalia asiatica(L.)Lam. METHODS The ＲP-HPLC system consisted of a Diamonsil C18 column
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)with the mobile phase of acetonitrile-water solution containing 75% glacial acetic acid. UV detector was
used，and the detection wave length was 290 nm. Gradient elution was adopted at a flow rate of 1. 0 mL·min －1，and the column tem-
perature was 30 ℃. For different constituents，external standard method was used with the peak area at 290 nm as the quantitative in-
dex. ＲESULTS The liner ranges of hesperidin，nitidine chloride，chelerythrine and toddalolactone were 0. 487 4 － 2. 437 2 μg(r =
0. 999 7) ，0. 030 3 － 0. 151 5 μg(r = 0. 999 2) ，0. 062 3 － 0. 311 7 μg(r = 0. 999 3) ，and 0. 024 9 － 0. 124 6 μg(r = 0. 999 9) ，re-
spectively. The average recoveries (n = 6)were 100. 76%(ＲSD 2. 75%) ，97. 98%(ＲSD 1. 25%) ，100. 07%(ＲSD 3. 24%) ，and
100. 10%(ＲSD 3. 83%) ，respectively. CONCLUSION The method is accurate，simple，rapid，and reproducible for the determina-
tion of hesperidin，nitidine chloride，chelerythrine，and toddalolactone in Toddalia asiatica(L. )Lam. The determination result can be
used as a reference for the rational medication，quality control，and further study of Toddalia asiatica(L.)Lam．
KEY WOＲDS:ＲP-HPLC;Toddalia asiatica;hesperidin;nitidine chloride;chelerythrine;toddalolatone
飞龙掌血为芸香科飞龙掌血属植物飞龙掌血
［Toddalia asiatica(L. )Lam.］的全株植物，为贵州省
少数民族习用中药材之一，药用部位主要为根、根皮
及叶［1］。该药材暂无人工种植，均为野生药材。主
要分布于非洲东部、亚洲东南部、南部及澳洲等地，
我国主产于湖南、湖北、陕西、福建、台湾、浙江、四
川、云南、贵州、广西等地［2］。具有散瘀止血，祛风
除湿［3］，消肿解毒的功效。临床主要使用为根皮，
根，叶。其中，根皮可用于跌打损伤，风湿性关节炎，
肋间神经痛，胃痛，月经不调，痛经，闭经;外用治骨
折，外伤出血。叶:外用治痈疖肿毒，毒蛇咬伤等症。
由于叶单独入药，在此不予研究，只对根皮进行对比
研究。笔者前期收集了 10 批贵州不同产地的药材，
经查阅现有资料表明，该药材中含有橙皮苷、氯化两
面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素等物质。其中橙皮
苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫、防辐射、
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降低胆固醇、保护心血管系统的药理活性［4］;白屈
菜红碱及氯化两面针碱在抗炎、抗癌方面都作用显
著［5］;毛两面针素在飞龙掌血中含量较高，但药理
活性暂不明了。用飞龙掌血药材在治疗白血病方面
有很好的疗效［6］。因此，有必要对其药材进行多指
标性含量的测定，以便对该药材进行相关质量控制，
从而保证其药效。本实验建立 ＲP-HPLC 同时测定
飞龙掌血药材中这 4 种成分含量，该方法简便、快
捷、重复性好，适用于飞龙掌血药材的质量控制，为
进一步对飞龙掌血药材合理临床使用、扩大用药部
位和药材人工种植提供实验依据。
1 仪器与材料
1. 1 仪器
2010 － AHT高效液相色谱仪(日本岛津) ;电子
天平 AUW － 220D 型(日本岛津) ;超声波提取器
CHXIN CH －250 型(北京创新德超声电子研究所) ;
数显恒温水浴锅 HH － 4(国华电器有限公司) ;
TU －1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通
用仪器有限责任公司)等。
1. 2 试剂和药品
对照品:毛两面针素又名飞龙掌血内酯对照品
(中国药品生物制品检定所，批号:1531-200001) ;白
屈菜红碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号:
111718-200501) ;氯化两面针碱(中药固体制剂制造
技术国家工程研究中心，1109-091127) ;橙皮苷对照
品(中国药品生物制品检定所，批号:110721-
201014)。其纯度均达到 98% 以上。乙腈为色谱
纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。10 批试
验药材的根皮购自贵阳市万东桥下药材交易市场，
经林开忠(原贵州省食品药品检验所)主管药师鉴
定均为芸香科植物飞龙掌血［Toddalia asiatica(L．)
Lom．］的干燥根皮。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件
色谱柱:Diamonsil C18柱(4. 6 mm × 250 mm，5
μm) ;流动相:乙腈(A)-0. 75%冰醋酸(B) ;梯度洗
脱:0 ～ 35 min，79% ～ 74% B、35 ～ 45 min，74% ～
50%B、45 ～ 50 min，50% ～ 79% B;流速:1. 0 mL·
min －1;检测波长:290 nm;柱温:30 ℃;进样量:10
μL。在此条件下，以各成分计，理论塔板数均大于
6 000。分离度均大于 1. 5。各对照品和供试品溶液
的色谱图，见图 1。
图 1 飞龙掌血混合对照品溶液(A)与飞龙掌血样品溶液
(B)的 HPLC图谱
1 －橙皮苷;2 －氯化两面针碱;3 －白屈菜红碱;4 －毛两面针素
Fig. 1 HPLC Chromatograms of mixed reference standard solu-
tion (A)and sample solution of Toddalia asiatica(L. )Lam
(B)at 290 nm
1 － hesperidin;2 － nitidine chloride;3 － chelerythrine;4 － toddalolactone
2. 2 对照品溶液的制备
分别精密称取橙皮苷 10. 16 mg、氯化两面针碱
10. 10 mg、白屈菜红碱 10. 39 mg、毛两面针素 10. 13
mg对照品于 4 个 10 mL 量瓶中;用甲醇定容，再分
别稀释为 406. 32、101. 00、415. 6、及 41. 52 μg·
mL －1的储备液。分别吸取上述储备液 4、1、1、2 mL
混合于 10 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，
即得橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针
素质量浓度分别为 162. 48、10. 1、20. 78、8. 304 μg·
mL －1的混合对照品溶液。
2. 3 供试品溶液的制备
取不同批次药材粉末(过 2 号筛)各约 0. 5 g，
精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入 50 mL甲
醇，称定锥形瓶重量，超声提取 1 h(250 W，40
kHz) ，冷却后补足重量，摇匀，静置过滤，取续滤液
待用，进样前过 0. 45 μm 微孔滤膜，作为供试品溶
液，待测。
2. 4 线性关系考察
分别量取“2. 2”项下制备的混合对照品溶液，精
密吸取 3，5，8，10，12，15 μL，按“2. 1”项下色谱条件
测定，记录色谱图。以峰面积积分值 Y对各进样体积
折算成质量(μg)进行线性回归。结果见表 1。
以上数据说明数据线性关系较好，可以直接用
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外标法进行含量测定。
2. 5 检测限和定量限
按“2. 2”项下条件，将混合对照品标准溶液进
行连续稀释后进样，检测限依据 3 倍噪音的峰响应
值和称样量进行计算，得出橙皮苷、氯化两面针碱、
白屈菜红碱和毛两面针素的检测限分别为 0. 243 7，
0. 303 0，0. 207 8，0. 249 1 μg·mL －1，定量限依据 10
倍噪声的峰响应值和称样量进行计算，橙皮苷、氯化
两面针碱、白屈菜红碱和毛两面针素的定量限分别
为 0. 812 6，1. 010 0，0. 831 2，0. 830 4 μg·mL －1。
2. 6 精密度实验
精密吸取按“2. 3”项下制备的供试品溶液(药
材产地:都匀龙里)10 μL，按“2. 1”项下色谱条件进
行分析测定，重复进样 6 次。以橙皮苷、氯化两面针
碱、白屈菜红碱、毛两面针素的峰面积计算。其
ＲSD 分别为 0. 74%、0. 46%、0. 90%、0. 81%，表明
在此条件下仪器精密度良好。
2. 7 稳定性实验
精密吸取供试品溶液，室温下放置，按“2. 1”项
下色谱条件进行分析测定，分别于制备后的 0，2，4，
8，12，16，20 h 各进样 10 μL，注入高效液相色谱仪，
测定，记录橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两
面针素的峰面积，其 ＲSD 分别为 0. 89%、1. 60%、
0. 86%、0. 35%(n = 6) ，表明供试品溶液在 20 h 内
保持稳定。
2. 8 重复性实验
精密称取同一批次药材粉末(产地:都匀龙
里) ，按“2. 3”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，
色谱条件同“2. 1”项下，计算各成分含量。结果其
ＲSD 分别为 2. 26%、1. 55%、1. 85%、1. 31% (n =
6) ，表明方法测定重复性良好。
2. 9 加样回收率实验
精密称取已知含量同一批次药材粉末 6 份(产
地:都匀龙里) ，每份约 0. 25 g，分别加入一定量的橙
皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素对照
品溶液，按“2. 3”项下方法制备供试品溶液，按
“2. 1”项下色谱条件测定，计算回收率的平均值分
别为 100. 76%、97. 98%、100. 07%、100. 10% (n =
6)其 ＲSD分别为 2. 75%、1. 25%、3. 24%、3. 83%。
2. 10 样品测定
分别取各不同产地飞龙掌血根皮粉末，按
“2. 3”项下平行制备 2 份供试品溶液，按“2. 1”项下
条件测定，结果见表 2。
3 讨 论
3. 1 提取方法的选择
本实验考察了超声、回流 2 种方法，结果表明，
超声法对各成分的提取量均等于或高于回流法，而
甲醇超声提取效果显著高于其他溶剂。其中用
100%的甲醇对 4 种成分的提取整体效果明显高于
体积分数 75%甲醇、体积分数 50%甲醇，体积分数
50%乙醇、体积分数 75%乙醇、乙醇、水、甲醇-盐酸
(100∶ 0. 5)溶液，虽然毛两面针素用水提效果较好。
综合考虑后用甲醇超声提取 1 h的效果最好。
表 1 飞龙掌血中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两
面针素的线性考察
Tab. 1 The linear regression equation，correlation and the line-
ar response ranges of hesperidin，nitidine chloride，chelerythrine
and toddalolactone
Name The regression equation Linear range /μg r
Hesperidin ρ =1. 04 × 106C +48 766 0. 487 4 － 2. 437 2 0. 999 7
Nitidine chloride ρ =3. 33 × 106C +29 464 0. 030 30 － 0. 151 5 0. 999 2
Chelerythrine ρ =1. 57 × 106C +25 184 0. 062 34 － 0. 311 7 0. 999 3
Toddaloactone ρ =1. 23 × 106C +57 220 0. 024 92 － 0. 124 6 0. 999 9
表 2 飞龙掌血中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素的测定结果 . n = 2
Tab. 2 Determination results of hesperidin，nitidine chloride，chelerythrine and toddalolactone in Toddalia asiatica(L.)Lam . n = 2
Producing area(Guizhou) Harvest time
Content
(Hesperidin)/%
Content
(Nitidine chloride)/%
Content
(Chelerythrine)/%
Content
(Toddalolactone)/%
Dongzhan of Guiyang Guiyang In early August 2012 2. 293 0. 056 0. 067 0. 034
Qingyan of Huaxi Guiyang In the middle of August 2012 1. 005 0. 048 0. 058 0. 036
Guanling Anshun In the middle of August 2012 1. 977 0. 040 0. 055 0. 020
Shuitian of wudang guiyang In late July 2012 2. 103 0. 023 0. 052 0. 090
Longli Qiannan In early August 2012 1. 417 0. 049 0. 061 0. 070
Ahahu lake Guiyang In the middle of March 2012 5. 059 0. 027 0. 116 0. 052
Jinsha Bijie In early March 2012 4. 118 0. 018 0. 092 0. 059
Qingzhen Guiyang In the middle of April 2012 0. 923 0. 052 0. 085 0. 036
Shuitian of Wudang Guiyang In early May，2012 0. 625 0. 039 0. 061 0. 080
Xintianzhai Guiyang In the middle of December，2011 1. 665 0. 045 0. 081 0. 056
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3. 2 检测波长的选择
待测 4 种化合物分别在 200 ～ 400 nm内扫描发
现 3 组最大吸收波长，橙皮苷和白屈菜红碱的最大
吸收波长分别为 283 和 282. 5 nm，而氯化两面针碱
在 270，290，325 nm都存在最大吸收，毛两面针素在
328 nm有最大吸收，集合实际谱图，最后发现选择
290 nm可以兼顾各物质的峰型及分离效果。采用
梯度洗脱在保证各待测组分完全分离前提下缩短出
峰时间。故本实验采用紫外检测器，290 nm 波长，
梯度洗脱测定 4 种待测成分，保证方法稳定性。
3. 3 流动相的选择
本实验考察甲醇-水、乙腈-水 2 种流动相体系。
结果表明，采用乙腈-水系统作为流动相，成分分离
效果较好。由于生物碱中氮原子和固定相未键合的
硅醇基的相互作用，使成分中生物碱存在色谱峰展
宽拖尾、保留时间漂移和分离效果不佳等现象，为解
决这些问题，本实验考虑加入适量冰醋酸作为拖尾
抑制剂，显著减少了拖尾现象的发生。由于 0. 75%
冰醋酸对色谱柱损害不大，因此，实验采用乙腈-
0. 75%冰醋酸作为流动相。
3. 4 系统耐用性实验
分别量取“2. 3”项下制备的供试品溶液，选用
迪马公司生产的 Diamonsil Ｒ C18(4. 6 mm × 250
mm，5 μm)和大连依利特公司生产的 Kromasil C18
(4. 6 mm ×250 mm，5 μm)的 2 种色谱柱，按“2. 1”
项下色谱条件测定。对比 2 种柱子所得色谱图发
现，Diamonsil Ｒ能够把 4 种组分分开，而 Kromasil却
只能分开橙皮苷和毛两面针素，对中间的白屈菜红
碱和氯化两面针碱却无法分开，说明该方法耐用性
目前只对 Diamonsil Ｒ有效，由于缺少相关的其他色
谱柱作进行比较实验，该方法的系统耐用性有待进
一步研究。
3. 5 不同产地不同采收日期药材根皮含量测定结
果分析
对 10 批飞龙掌血药材根皮含量测定结果进行
分析显示，不同产地飞龙掌血根皮中的 4 种成分具
有一定差异，除生长环境不同外，该结果还与药材采
收时间、树龄等因素相关。
3. 6 结论
本实验所建立的同时测定飞龙掌血 4 中主要成
分的方法简单、准确，为进一步对飞龙掌血药材研究
开发及合理临床使用提供实验依据。
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