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. 贵阳中医学院学报 第 卷
二醛固定细胞 刀 清洗 次 , 饿酸固定 ,
清洗 次 ,丙酮梯度脱水后浸透包埋 ,
超薄切片机切片 旧立 一 透射电镜观察 。
统计学分析
所有数据采用 巧 统计软件分析 计量资料用均
数 士标准差 士 表示 组间比较运用 检验 ,以
为差异有统计学意义 。
结果
内皮抑素对 一 细胞增殖的影响 加入梯度浓度
的重组人内皮抑素 一 、 、 、 、 、 分
别作用 、 、 。 应用 法检测细胞生长情况 ,计算
抑制率 。 结果发现 从作用时问来看 、 、 组的抑
制效果无时间依赖关系 。 但每组均在作用 后抑制效果
达最 大 , 组 的 抑 制 率 分 另 为 、 巧 、
、 、 和 呈剂量依赖关系
。 从作用 浓度来看 ,内皮抑素浓度小于 几
作用 时 ,以及浓度小于 作用 时 与对照组
比较差异均无统计学意义 。 除此之外 洛组细胞
增殖均受到不同程度抑制 ,抑制效果随作用浓度增加而加
大 即 的抑制效果最大 、 、 的抑制率分
别为 、 、 。
内皮抑素对 一 细胞周期和凋亡的影响 应用
分析软件对 细胞周期拟合分析 ,计算出
组方图各时相分布的百分比 。 与对照组比较 在给药
后 、 内皮抑素组细胞 期比例增高 ,而 期细胞
比例降 。 两组差异无统计学意义 。 在 荧
光组方图上 调亡显示出个亚二倍体 峰 根据 峰
值计算出凋亡率 。 在内皮抑素处理后 即可出现凋亡细
胞群 。 之后 ,凋亡率逐渐下降 、 的凋亡率分别为
一 士 。一 和 士 ,均高于对照组
士 和 士 。
的两组差异无统计学意义 。
内皮抑素对 一 细胞超微结构的影响 透射电子
显微镜下对照组 一 细胞呈圆或椭圆形 ,胞质丰富 ,内
有线粒体 、 粗面内质网 、 游离核糖体 、 溶酶体 。 细胞核不规
则 偶有双核 在核旁的胞质里可见微丝 、 微管 。 加入内皮
抑素后 细胞微绒毛减少 ,染色质厚薄不均 ,位于核膜下 ,
细胞多处呈球形膨出 ,即出现凋亡现象且核膜旁胞质内的
微丝束消失 。
讨论
内皮抑素是近年来发现的一种强有效的内源性血管
生成抑制因子 。 研究证实 ,内皮抑素具有强效的抑制肿瘤
血管生成作用 进而抑制肿瘤的生长 、 侵袭和转移 ,对早期
和晚期肿瘤均有效 。 有研究中发现 ,内皮抑素还可以抑
制裸鼠肺癌移植瘤的淋 巴管生成及淋巴结转移 。 但目
前尚不清楚内皮抑素是否对肺癌细胞有无直接作用 。
本研究结果显示 内皮抑素对肺癌细胞的增殖有轻度
的抑制作用 , 定浓度的内皮抑素可诱导肺癌细胞发生凋
亡 提示内皮抑素有可能成为治疗肺癌的新手段 。 曾有研
究认为内皮抑素的抑制作用 是内皮特异性的 ,对肿瘤细胞
无作用 。 但近来的研究结果显示 ,内皮抑素并非只是特异
性地抑制内皮细胞的增殖和迁移 「 一 对某些肿瘤细胞同
样具有直接抑制作用 。 例如 ,重组人内皮抑素在体外可抑
制人舌鳞状细胞癌 、 头颈鳞状细胞癌以及膀肤癌细胞的增
殖和迁移 。 等 也曾报道 内皮抑素治疗肿瘤并
不是使肿瘤细胞的增殖减少 ,而是肿瘤细胞凋亡速度比治
疗前高出 倍 。
尽管有关内皮抑素促进细胞凋亡的机制还未完全阐
明 但有研究证实 内皮抑素可通过下调 一 、 一 的
表达促进内皮细胞凋亡 「」 。 还有研究证实 ,内皮抑素可 以
被内皮细胞内吞 使接头蛋白 磷酸化 随后可形成一种
。 的具有酪氨酸激酶活性的复合物或与酪氨酸激
酶结合在一起的复合体 ,内皮抑素可能通过该途径引起内
皮细胞停滞于 期 ,并发生凋亡 「 。 然而 ,由于肿瘤细胞
群的遗传不稳定性和异质性 ,肿瘤血管形成因子的表达会
随着肿瘤进展而发生改变 ,即大多数肿瘤在其进展期常表
达多种血管形成因子 「 。 很显然 单用内皮抑素治疗肺癌
也同样会存在耐药等问题 ,使其疗效降低 。 因此 ,抗血管
治疗与传统的化疗 、 放疗联合使用就成为了必然的选择 。
但内皮抑素能否与放化疗产生协同作用还不清楚 。
本研究结果显示 , 一 细胞经内皮抑素处理后 ,处
于细胞周期 即 期的细胞增多 而 期 、 期细胞减
少 引起 即 期捕获 。 这一 结果与文献报道一致 。 如
等「 」发现内皮抑素主要引起内皮细胞 即 捕获 ,
期细胞减少 。 等 发现内皮抑素通过抑制细胞周期
蛋白 表达 朋止 即 进程而抑制内皮细胞生长 。 现
已知道 处于 期和 期的细胞对放疗中度或高度
敏感 而处于 期的细胞则表现为抵抗 。 多数处于
期的肿瘤细胞对顺铂 是敏感的「 」 。 最近有学者
发现 放疗前使用内皮抑素 ,可降低 们 肺癌小鼠组织中
缺氧诱导因子 一 和血管内皮生长因子 的
表达 使放疗敏感性增加 「 。 这都提示内皮抑素可能通过
这些机制使肿瘤细胞对放疗和化疗的增敏性增强 。
本研究还表明 ,细胞移行过程的基础是微丝和微管
微丝的延长 、 微管的定向生长在细胞移行过程中有重要作
用 「 户 。 本研究结果显示 ,内皮抑素可以减少细胞内的微
丝数量 提示内皮抑素通过对细胞骨架进行调节 ,减弱细
胞的运动能力 ,从而抑制细胞的侵袭 。 本研究结果表明
内皮抑素可以在体外直接抑制肺癌细胞的增殖 ,诱导其凋
亡 并影响细胞周期 对放化疗可能有增敏作用 ,有可能成
为肺癌治疗的新手段 。
贵阳中医学院学报 第 卷
南部及澳洲 等地 ,我国主产于湖南 、 湖北 、 陕西 、 福建 、 台
湾 、 浙江 、 四川 、 云南 、贵州 、 广西等地 ,具有散痕止血 祛
风除湿 浮肖肿解毒 。 其中 根皮 跌打损伤 ,风湿性关
节炎 肋间神经痛 ,胃痛 ,月经不调 ,痛经 ,闭经 外用 治骨
折 外伤出血 叶 外用治痈疖肿毒 毒蛇咬伤等症 。 临
床主要使用为根皮 根 ,叶 。 由于叶单独入药 ,在此不予研
究 ,只对根皮进行对比研究 。 笔者前期收集了十批贵州不
同产地的药材 ,发现其指纹图谱的相似度很好 ,经查资料
表明 该药材中含有橙皮普 、 氯化两面针碱 、 白屈菜红碱 、
毛两面针素 。 其中陈皮普具有抗炎 、 抗氧化 、 抗菌 、 抗癌 、
调节免疫 、 防辐射 、 降低胆固醇 、 保护心血管系统的药理活
性 白屈菜红碱对某些真菌 、 细菌和病毒有抑制作用 ,但
对神经 、 心脏等有毒害 ,可引起麻痹 、 心脏抑制 ,甚至导致
死亡 。 在体外可抑制甲型链球菌 、 卡他 、 型奈氏菌 、 粘膜
奈氏菌 、 肺炎双球菌 、 流感嗜血杆菌和其他革兰氏阳性细
菌 。 在体内可抑制结核杆菌 。 低浓度 的白屈菜红碱能抑
制噬菌体和大肠杆菌 。 杨桦用飞龙掌血在治疗白血病方
面有很好的疗效 「」 。 因此 肩必要对其药材进行多指标性
含量的测定 以便对该药材进行相关质量控制 ,从而保证
其药效 。 本实验建立 一 同时测定飞龙掌血药材
中这两种成分含量 ,该方法简便 、 快捷 、 重复性好 ,适用于
飞龙掌血药材的质量控制 ,为进一步对飞龙掌血药材合理
防床使用 、 扩大用药部位和药材人工种植提供实验依据 。
仪器与材料
仪器 电子天平 一 型 日本岛津 超声波
提取器 一 型 北京创新德超声 电子研究
所 数显恒温水浴锅 一 国华电器有限公司 。
双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限
责任公司 一 高效液相色谱仪 日本岛津 等 。
试剂和药品 对照品 白屈菜红碱对照品 中国药品
生物制品检定所 ,批号 一 橙皮普对照品
中国药品生物制品检定所 ,批号 一 一 。 其
纯度均达到 以上 。 乙睛为色谱纯 ,水为去离子水 ,其
余试剂均为分析纯 。 批试验药材购自贵阳市万东桥下
药材交易市场 经林开忠老师 原贵州省食品药品检验所
鉴定均为芸香科植物飞龙掌血的干燥根皮 。
方法与结果
色 谱 条 件 色 谱 柱 柱
们 万林 卜流动相 乙睛 一 冰醋酸
梯度洗脱 一 汉 一 、 一 汉
一 、 一 阳 一 流速 一 检
测波长 柱温 进样量 林 。 在此条件下 以
各成分计 ,理论踏板数均大于 。 分离度均大于 。
各对照品和供试品溶液的色谱图 ,见 图 旧 。
对照品洛液的制备 分别精密称取橙皮百 、
白屈菜红碱 对照品分别于 容量瓶中 ,用 甲
醇 稀 释 至 刻 度 , 即 得 浓 度 分 别 为 林 一 、
林 一 的储备液 。 分别吸取上述储备液 、 混
合于 量瓶中 用甲醇定容至刻度 摇匀 ,即得橙皮普 、
白 屈 菜 红 碱 质 量 浓 度 分 别 为 林 一 、
林 一 的混合对照品溶液 。
供试品 溶液的制备 取不 同批 次药材粉末各 约
精密称定 ,分别置具塞锥形瓶中 ,精密加入 甲
醇 称定重量 超声提取 ,放冷后补足重量 ,摇匀 ,过滤
取续滤液过 林 微孔滤膜 作为供试品溶液 待测 。
线性关系考察 分别量取 ` , ” 项下混合对照品溶
液 精密吸取 万 , , , 林 ,按 “ ” 项下色谱条件测
定 记录色谱图 。 将峰面积积分值 对各进样体积折算成
质量 林 进行线性回归 见 表 。
表 飞龙掌血中橙皮普 、 白屈菜红碱的线性考察
成分 回归方程 线性范围 卜
橙皮普
白屈菜红碱
火
火
一
一
注 以上数据说明数据线性关系较好 河以直接用外标法进行含量测定
精密度试验 精密吸取按 项下制备的供试品溶
液 药材产地 都匀龙里 林 ,按 ` , ” 项下色谱条件进
行分析测定 重复进样 次 。 以橙皮普 、 白屈菜红碱的峰面
积计算 。 其 分别为 、 ,表明在此条件下
第 期 王冬梅 , 李 松 , 周 强 , 等 法同时测定飞龙掌血中两种化学成分的含量 , ,
仪器精密度 良好 。
稳定性试验 精密吸取供试品溶液 ,室温下放置 胺
, ”项下色谱条件进行分析测定 汾别于制备后的
另姆 江 各进样 林 ,注入高效液相色谱仪 侧定
记录橙皮普 、 白屈菜红碱的峰面积 ,其 分别为
、 表明供试品溶液在 内保持稳定 。
重复性试验 精密称取同一批次药材粉末 产地 都
匀龙里 胺 ` , ” 项下方法平行制备 份供试品溶液 ,色
谱条件同 ` , ”项下 ,计算各成分含量 。 结果其
分别为 、 表明方法测定重复性良好 。
加样回收率试验 精密称取已知含量同一批次药材
粉末 份 产地 都匀龙里 ,每份约 ,分别加入一 定
量的橙皮普 、 白屈菜红碱对照品溶液 胺 ` , ” 项下方法制
备供试品溶液 , ` ” 项下条件测定 计算回 收率 的平
均值分 别为 、 、 其 分别为
、 。
样品测定 分别取各不同药用部位药材飞龙掌血根
皮粉末 胺 ` , ”项下平行制备 份供试品溶液 ,按 ` , ”
项下条件测定 见 表 。
表 飞龙掌血中橙皮普 、 白屈菜红碱的测定结果
样品编号 产地 采收 日期 橙皮普含量 白屈菜红碱含量
气甘甘 甘
甘
贵阳东站
花溪青岩
安顺关岭
乌当水田
龙里
阿哈湖水库
毕节金沙
清镇九龙山
乌当水田
新添寨
年 月上旬
年 月中旬
年 月中旬
年 月下旬
年 月上旬
年 月中旬
年 月上旬
年 月中旬
年 月上旬
年 月中旬
讨论
提取方法的选择 本实验考察了超声 、 回流种方法 ,
结果表明 ,超声法对各成分的提取量均等于或高于回流
法 而甲醇超声提取效果显著高于其他溶剂 其中 的
甲醇对 种成分的提取整体效果明显高于 甲醇 、
甲醇 万 乙醇 、 乙醇 、 乙醇 、 水 。 综合考虑选用甲醇超
声提取 的效果最好 。
检测波长的选择 待测两种化合物分别在
波长范围扫描最大吸收波长 橙皮普和白屈菜红碱
的最大吸收波长分别为 和 集合实际谱图 ,最
后发现选择 可以兼两种物质的峰型及分离效果 。
流动相的选择 本实验考察甲醇 一 水 、 乙睛 一 水两
种流动相体系 。 结果表明 ,采用 乙 睛 一 水系统作为流动
相 成分分离效果较好 。 由于生物碱中氮原子和固定相未
键合的硅醇基的相互作用 ,使成分中生物碱存在色谱峰展
宽拖尾 、 保留时间漂移和分离效果不佳等现象 ,为解决这
些问题 本实验考虑加入适量冰醋酸作为拖尾抑制剂 ,显
著减少了拖尾现象的发生 。 由于 冰醋酸对色谱柱
损害不大 , 因此 ,实验采用 乙睛 一 冰醋酸作为流
动相 。
不同产地不同采收日期药材根皮含量测定结果分析
对十批飞龙掌血药材根皮含量测定结果进行分析显示 ,
不同产地飞龙掌血根皮中的两种成分具有一定差异 ,除生
长环境不同外 ,成分含量还与药材采收时间 、 树龄等因素
相关 。
结论
本实验所建立的同时测定飞龙掌血两种主要成分的
方法简单 、 准确 ,为进一步对飞龙掌血药材研究开发及临
床合理使用提供实验依据 。
参考文献
广西壮族自治区卫生厅 广西中药材质量标准 【 〕 南宁
广西科学技术出版社 江 一
国家中医药管理局 《中华本草 》编委会 中华本草苗药卷
〕 贵阳 贵州科技出版社 一
贵州省药 品监督管理局 贵州省中药材 、 民族药材质量标准
〕 贵阳 贵州科技出版社 一
两
〕 天然产物研究
与开发 一
杨桦 苗药 “ 见血飞 ” 治疗白血病临床观察 【〕 中国民族民
间医药 , 一
,
,气、
〕