全 文 ：表 2　5组肝脏组织的病变程度
组别 只数 肝脏病变程度-或± + ++ +++ ++++
A 12 0 3 7 1 1
B 10 0 6 4 0 0
C 10 0 6 3 1 0
D 10 0 5 4 1 0
E 10 10 0 0 0 0
　　B 、C 、D组与 A组比较 P<0.05
讨 论
　　本研究结果表明 , 在 D-Gal N 造成肝脏损伤坏死后 ,血
清中 TNF-α、ET-1 及 NO 均较阴性对照组明显升高 , 且三
者含量变化呈显著正相关。推测肝坏死中 TNF-α、ET-1 及
NO三者间有协同作用。在 B、C 、D 组中经拮抗 TNF-α(B
组)的作用后 , TNF-α、ET-1 及 NO 的含量均明显低于 A 组
(P <0.01 或 0.05),肝脏病理损伤也比 A 组显著减轻 , 经
拮抗 ET-1(C 组)及 NO(D 组)作用后 , 除相应被拮抗的指
标明显低于 A组(P <0.01)外 , 其他二项指标与 A 组比较
差异无显著性。但肝脏损伤程度均比 A 组明显减轻(P
<0.05),证明在 D-Gal N 造成的肝损伤后经分别选择性抑
制 TNF-α、ET-1 及 NO 的作用后 , 肝损伤有明显减轻 , 提
示:TNF-α、ET-1 及 iNOS 和其合成的 NO 对肝细胞的损伤
既有独立又有协同的作用。 文献报道 TNF-α、ET-1 及 NO
各自在肝坏死中的作用 , 我们的研究结果不仅支持这一观
点 ,而且进一步揭示它们之间在肝坏死中的密切关系。
TNF-α不仅是肝坏死的重要介质 , 而且可通过增加肝脏贮
脂细胞及巨噬细胞上的 iNOS 的表达 , 增加 NO 的合成。
Rockey 等[ 1]在实验细胞因子如 IL-1、TNF-α等单一与肝脏
贮脂细胞(Ito细胞)培育时 , 均不能或很少刺激 I to细胞激
活iNOS mRNA生成;但 NO 在与 IL-1、TNF-α一起刺激 Ito
细胞后 , iNOS 则明显增高 , 并且 NO 对贮脂细胞的收缩作
用可以检测到 ,当 I to 细胞与 TNF-α培育时 , 所发生的细胞
收缩作用(被 NO 所引起)又可以为血清或 ET-1 所阻断。
他们认为 NO 是 I to 细胞收缩的强力调节因子 ,在肝损伤中
起重要作用 ,而 ET-1 是通过肝细胞上的 ET 受体发挥血管
收缩作用 , 从而加重肝细胞缺氧 、水肿等使肝细胞发生损
害。 Ohuchi等[ 2]在以 D-Gal N-内毒素(LPS)诱导的大鼠肝
坏死中证明 D-Gal N-LPS 只是早期引起肝脏血管收缩 , 但
肝脏损伤的发展是通过 ET-1引起微血管紊乱所介导的。
本研究显示 ,在 D-Gal N造成肝坏死中 TNF-α、ET-1 及
NO 含量均明显升高的同时 ,肝功能及肝脏病理损伤严重 ,
而经拮抗 TNF-α、ET-1 及 NO 的作用后 , TNF-α、ET-1 及
NO 的含量明显下降的同时 ,肝功能及肝脏损伤明显减轻 ,
揭示 TNF-α、ET-1 及 NO 在肝坏死机制中的重要作用 , 为
临床寻找有效的预防及治疗手段提供了重要的实验依据。
参 考 文 献
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(收稿日期:1999-09-25)
(本文编辑　刁会正)
刀豆素 A 诱发小鼠急性肝损害模型的形态改变及 Fas和
FasL的表达
陈姬秀　韩絮琳　秦一中　万谟彬　王建军　徐向阳
作者单位:200433　上海 ,第二军医大学长海医院(陈姬秀 、韩
絮琳 、秦一中 、万谟彬 、徐向阳);第二军医大学病理解剖学教研室
(王建军)
　　刀豆素 A(Concanavalin A , Con A)在体外可刺激 T 细
胞进行有丝分裂 ,并释放细胞因子 , 诱导淋巴细胞及巨噬细
胞的细胞素毒性[ 1] 。而免疫性肝病病理变化的实质是 T、
B 淋巴细胞介导的免疫损害 , 尤其是 T 细胞介导的细胞免
疫在病毒性肝炎等疾病中是肝细胞损害的主要因素[ 2] 。
我们用尾静脉一次性注射一定剂量 Con A 的方法成功地建
立了 Balb/ C 小鼠特异性急性肝损害的动物模型 ,并对其病
理损害机制作了初步的探讨。
材料和方法
一 、实验材料
(一)实验动物　雄性 Balb/ C 小鼠 , 8 ～ 12 周 ,体重 20
～ 27 g , 第二军医大学动物中心提供。
(二)主要试剂　Con A:美国 Sigma 公司;兔抗鼠 Fas
单抗及 FasL单抗:美国 Santa Cruz 公司;羊抗兔 I gG:上海
医学化学检验所;LsAB 试剂盒:丹麦 DAKO 公司提供。
二 、实验方法
(一)小鼠急性肝损害模型的建立　将 Balb/C 小鼠随
·121·中华传染病杂志 2000年 5月第 18卷第 2期　Chin J Infect Dis , M ay 2000 , Vol.18 , No.2
机分成五组 , A 组(对照组)以 0.25 ml注射用生理盐水代
替 , B、C、D、E 组分别以每公斤体重 10 ～ 40 mg Con A 的剂
量 ,以 0.25 ml生理盐水充分溶解后尾静脉一次性注入 , 8
h后摘眼球放血 , 以 2 500 r/min 离心 20 min 后取血清待
检 ,脏器用中性缓冲福尔马林液固定。
(二)组织病理学检查　1.肝脏等组织普通病理:常
规 HE染色 ,对 A、B、D 三组用病理指标评定肝损程度 , 病
理指数的确定:在高倍镜下每次取 20 个视野 ,每一视野分
三等份;“0”记整个视野无肝细胞病变;“ 1”记肝细胞发生病
变<1/3 视野;“ 2”记肝细胞发生病变 1/ 3 ～ 2/3 视野;“ 3”
记肝细胞发生病变>2/3 视野;20 个视野得分相加即为肝
细胞的病理指数 PI 值。 2.链酶亲合素标记的辣根过氧化
物酶显色法(S-P法)观察肝组织 Fas 及 FasL 表达:(1)肝
组织 Fas表达:石蜡切片经二甲苯脱蜡至水 , 充分洗涤 , 微
波抗原修复后冷却至室温 ,以 LsAB试剂盒免疫组化检测 ,
按说明操作。依次用正常兔血清(阻断)、兔抗鼠 Fas 单抗
(反应)、生物素羊抗兔 IgG(连接)、过氧化物酶-链酶亲合
素反应 ,二氨基联苯胺(DAB)显色后 ,苏木素衬染。(2)肝
内FasL的表达检查:与检测 Fas 相同的免疫组织化学技
术 ,改用兔抗鼠 FasL 单抗 , 以氨基乙基咔唑显色。(3)实
验对照:阴性对照:用 PBS 替代第一抗体设空白对照;用正
常兔血清替代第一抗体设替代对照。阳性对照:用已知表
达 Fas及 FasL 的淋巴结为对照。(4)结果判定:阳性物质
呈棕黄色 , 分布于胞膜和胞浆中 , 胞核经苏木素衬染为淡
蓝色。
(三)丙氨酸转氨酶(ALT)测定　赖氏法。
三 、统计学处理
t检验 , F 检验 , 相关分析。
结 果
一 、不同剂量 Con A 作用 8 h 后ALT 表达水平
在实验中观察到 Con A 30 mg/ kg 及 40 mg/ kg 用量组
在用药后 6 h 左右出现少动 , 抓之无反抗 , 肢体逐步发凉 ,
放出的血 ,血凝块收缩不良等 , D 组在 7 h 死亡 1 只。各组
测定的 ALT 结果如表 1 所示。 以 Con A 剂量为变量 , 以
ALT 为应变量的相关分析显示两者呈显著的正相关 , 相关
系数 r=0.59(P=0.002), 说明肝功能的损害对 Con A 具
有剂量依赖性。
　　二 、组织病理学观察
(一)HE 染色　心 、肺 、肝 、肾 、脾等脏器 HE 染色结果
显示只有肝组织有明显的损害。不同程度地表现为肝小叶
结构欠清晰 ,肝细胞肿胀 、变性 ,肝窦及中央小静脉淤血 ,部
分肝细胞内有大的脂肪空泡形成 , 胞浆透亮 ,核固缩 , 小灶
性坏死多见 , 肝内小血管中可见到较多的炎性细胞集聚。
此外 ,单个肝细胞嗜酸性变非常普遍。 用病理指数作为肝
损的量化指标 , B 、D组分别为:41.5±9.2、45.5±7.8 , 随着
Con A 剂量的加大 , P I 有上升趋势 , 与对照 A 组 10±4.2
差异有显著及非常显著性。
表 1　不同剂量 Con A 处理后小鼠血清 ALT 表在水平
组别 Con A 量(mg/kg) 实验只数 死亡数 ALT(U/ L)
A 0 6 0 62±19
B 10 6 0 1 405±807＊＊
C 20 6 0 3 182±1 494＊＊
D 30 7 1 8 933±4 076＊＊
E 40 7 0 10 229±9 071＊＊
　　注:ALT 值为 x ±s　＊＊P<0.01
　　(二)免疫组织化学　Fas 在对照组和 Con A处理组肝
细胞表面及肝窦内皮细胞表面均有表达 , 但 Con A 处理组
比较显著;FasL 只表达于 Con A 处理组肝组织中 , 靠近中
央静脉的肝细胞内表达明显。
讨 论
Con A在体外能刺激 T 细胞分裂并释放各种细胞因
子 ,诱导淋巴细胞和巨噬细胞的细胞毒性是其生物学特性
之一。本实验在无需致敏的情况下用尾静脉一次性注射一
定剂量 Con A的方法成功地建立了纯种 Balb/C 小鼠特异
性肝损害模型。通过 Con A 注射剂量与血清 ALT 表达水
平的相关分析及病理指数的观察 , 提示在一定范围内肝损
程度与 Con A 剂量有显著的正相关。
通过对 Con A处理组 Balb/C 小鼠主要脏器的病理观
察显示 ,只有肝组织有明显的损害 ,不同程度地表现为肝细
胞肿胀 、变性 , 坏死 , 肝内小血管中可见到较多的炎性细胞
集聚。此外 ,单个肝细胞嗜酸性变非常普遍。 免疫组织化
学检查显示 Fas 在对照组的 Balb/C 小鼠肝组织中有表达 ,
这与文献报道一致 , 而 Con A 处理组肝组织中 Fas 表达尤
为明显 ,在肝细胞及肝窦内皮表面多见。 FasL 只表达于
Con A 处理组肝组织中 , 靠近中央静脉的肝细胞内呈强
阳性。
Con A 诱导特异性肝脏损害的原因尚不清楚。 Gantner
等[ 3]观察到 Con A 只聚集在肝窦内皮细胞表面。 Con A 对
肝脏的特异性损害尚取决于 T 淋巴细胞的激活 , 并依赖于
与巨噬细胞的互相作用。电镜还观察到淋巴细胞与肝细胞
紧密接触的现象[ 4] 。 Keren 等[ 5]认为 Con A 可能起到替代
抗原提呈细胞提呈的 MHC-Ⅱ类分子结合的多肽抗原的作
用。近年的研究认为 ,肝脏的结构特异性-肝细胞和库普弗
细胞的紧密接触 ,使其实质细胞与免疫细胞不必通过体液
循环而相互作用 ,这可能增加了作用的直接性和强度而较
别的脏器更容易遭受免疫攻击。本实验的结果显示肝实质
细胞是 Con A 毒性的靶细胞 , Con A 在体内可能亦能通过
诱导 T 细胞及巨噬细胞的细胞毒性 , 进一步分泌某些细胞
因子发挥作用。此外 ,小鼠的淋巴细胞 、肝细胞 、胆管细胞 ,
内皮细胞广泛地分布着 Fas[ 6] , 而活化的 T 淋巴细胞 , 尤其
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是CD+8 CTL 细胞及 CD+4 Th1 亚群可表达 FasL[ 7] , 因而 Con
A 可能通过激活 T 淋巴细胞表达 FasL , 以可溶性 FasL 的
形式诱导肝细胞凋亡。既往认为只有成熟 T 细胞表达
FasL。 Galle 等[ 8] 首次在酒精性肝病肝细胞表面检测到
FasL , 并提出了“细胞自杀”及“同胞相杀”的假设。本实验
初步观察到 Con A 处理组肝细胞内有 FasL表达 , 提示表达
FasL 的肝细胞可能充当效应细胞 , 引起“细胞自杀”及“同
胞相杀”的可能。
参 考 文 献
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(收稿日期:2000-01-26)
(本文编辑　刁会正)
肾综合征出血热患者降钙基因相关肽的动态检测及意义
张林华　任延录　邱守义　马凯　陈俊秀　侯朝晖　李春香
作者单位:157011　黑龙江省佳木斯大学医学院附属医院(张
林华 、邱守义);黑龙江省佳木斯市卫生局(任延录);哈尔滨铁路局
(马凯);哈尔滨铁路局牡丹江铁路医院(陈俊秀);空军第 465医院
(侯朝晖);山东省滨州医学院附属医院(李春香)
　　降钙基因相关肽(CGRP)是一种生物活性多肽 , 在人
体内广泛分布于中枢和外周神经系统及心血管 、消化 、呼
吸 、内分泌等系统 , 参与机体许多功能的调节。
为了解肾综合征出血热(HFRS)患者机体的体液因子
和肾血流量的变化及其在发病过程中的作用 , 对患者血浆
CGRP 进行动态检测 , 同时对内皮素(ET)和血尿素氮
(BUN)进行检测并比较 ,现报告如下。
材料和方法
一 、检测对象
临床诊断为 HFRS 患者共 31例 , 均经用酶联免疫法检
测血清特异性 I gM 抗体所证实。 男 24 例 , 女 7 例 , 年龄
16 ～ 62岁 , 平均 31 岁。按 1986 年南京会议拟定的 HFRS
诊断 、分型标准划分。临床分型:轻型 10 例 , 中型 13 例 , 重
型 8例。各病期检测例数:发热期 31 例 , 低血压期 28 例 ,
少尿期 29 例 , 多尿期 30 例 , 恢复期 30 例。 正常对照 30
例。男女各 15 例 , 均为本院工作人员及医学生 ,无心 、肝 、
肾等疾患史 ,年龄与观察组基本相同。
二 、样本的采集
发热期及恢复期为该期的第 2 或 3 天采血 , 低血压期
及少尿期均为进入该期的当天采血 , 多尿期为该期的第 2
天采血 ,避开移行期。
三 、实验方法
CGRP检测应用放射免疫法 , 试剂盒购自北京东亚免
疫技术研究所 ,实验操作严格按说明书进行。 ET 及 BUN
与 CGRP配对检测。
结 果
一 、HFRS 患者血浆 CGRP的改变
发热期即有增高 , 少尿期达峰值 ,多尿期开始下降。与
正常组相比 ,轻型患者中只有低血压期及少尿期差异有显
著性(P<0.05),中型 、重型患者从发热期到恢复期均显著
高于对照组(P<0.05～ 0.01),见表 1。
　　二 、CGRP 与 ET 的比值变化
二者的比值在发热期最高 , 少尿期最低 , 多尿期恢复。
重型患者各期比值均低于轻 、中型。轻型患者比值最高 ,见
表 2。
·123·中华传染病杂志 2000年 5月第 18卷第 2期　Chin J Infect Dis , M ay 2000 , Vol.18 , No.2