全 文 ：中国药物警戒第 9卷第 10期 2012年 10月 October, 2012, Vol.9, No.10
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（收稿日期：2012- 07- 18 编辑：范燕）
蝙蝠葛碱体外肝肾细胞毒性的初步研究
周倩 金若敏 姚广涛 * （上海中医药大学药物安全评价中心，上海 201203）
中图分类号：R282; R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672- 8629（2012）10- 0580- 04
基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）（2009CB522807）；
国家“重大新药创制”科技重大专项项目（2009ZX09502- 002）
作者简介：周倩，女，硕士，中药安全性评价。
*通讯作者：姚广涛，博士，副研究员，硕士生导师，中药新药及其安
全性评价研究。E- mail:ygt1969@yahoo.com.cn
摘要：目的 探讨北豆根中的成分蝙蝠葛碱在体外对人正常肝细胞（L- 02）、人胚肾细胞（HEK- 293）和人肾小管上皮
细胞（HK- 2）的影响。方法采用 MTT法检测蝙蝠葛碱对肝细胞和肾细胞活力的影响；采用倒置相差显微镜对给药
后的细胞形态进行观察；检测给予蝙蝠葛碱后，肝细胞培养上清液中的功能性指标（AST、ALP、LDH）和肾细胞培养
上清液中的功能性指标（LDH）的含量。结果MTT法显示，50~100 g·mL-1的蝙蝠葛碱能显著降低 L- 02细胞的活力
（P <0.01），25~200 g·mL-1的蝙蝠葛碱对 HEK- 293细胞有明显的抑制作用（P <0.01），12.5~50 g·mL-1的蝙蝠葛碱
能降低 HK- 2细胞的活力（P <0.01或 P <0.05）；给予蝙蝠葛碱后，肝肾细胞均不同程度的皱缩、减少、甚至死亡，且随
药物浓度的增加细胞呈现此状态的数目增多；100 和 200 g·mL-1的蝙蝠葛碱能显著升高肝细胞培养上清中的
AST、ALP、LDH含量和肾细胞上清中的 LDH含量（P <0.01）。结论蝙蝠葛碱对肝肾细胞均有毒性作用。
关键词：北豆根；蝙蝠葛碱；肝细胞毒；肾细胞毒
Preliminary Study on Hepatocytes and Nephrocytes Toxicity Induced by Dauricine
ZHOU Qian JIN Ruo-min YAO Guang-tao* (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai
201203, China)
Abstract: Objective To test the toxic effects of dauricine on human normal hepatic cells(L-02), human embryonic
kidney 293 cells(HEK293) and human renal tubular epithelial cells(HK-2). Methods MTT assay was used to test
the cell viability of dauricine on hepatocytes and nephrocytes. Morphological changes of hepatocytes and nephro－
cytes were observed through inverted phase contrast microscope. The contents of LDH in nephrocytes supernatant
and AST, ALP, LDH in hepatocytes supernatant were detected. Results The MTT assay showed that 50～100 g·mL-1
dauricine could inhibit L-02 cells viability obviously(P <0.01), 25～200 g·mL-1 dauricine showed significant
inhibitory action on HEK-293 cells viability(P <0.01), 12.5～50 g·mL-1 dauricine could inhibit HK-2 cells viability
(P<0.01 or P<0.05). Cell morphology showed that dauricine could damage the shapes of hepatocytes and nephrocytes
and increase the cells mortality in a dose-dependent manner by microscope. 100 and 200 g·mL-1 Dauricine could
increase the contents of LDH in nephrocytes supernatant and AST, ALP, LDH in hepatocytes supernatant(P <0.01).
Conclus ion Dauricine may cause hepatocytes and nephrocytes toxicity.
Key words : Rhizoma Menispermi; dauricine; hepatotoxicity; nephrotoxicity
μ
μ
μ
μ
μ
μ
μ μ
北豆根（Rhizoma Menispermi）系防已科植物蝙蝠葛
（Menispermum dauricum）的干燥根茎，始载于《中国药植
志》。北豆根性味苦寒，有小毒，归肺、胃、大肠经，具有清热
解毒、祛风止痛的功效，用于治疗咽喉肿痛、肠炎痢疾、
风湿痹痛[1]。北豆根含有生物碱类、挥发油类、多糖类等化
学成分，其总生物碱的含量为 1.7%～2.5%。目前，对北豆根
化学成分的研究主要集中在其生物碱类成分，主要有效
成分为蝙蝠葛碱、蝙蝠葛苏林碱等多种酚性生物碱[2]。现
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代药理研究表明，北豆根具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、增强免
疫调节等多种药理活性[3]，毒理方面已有部分肝肾毒性、中
枢系统毒性等的研究，但采用体外实验方法对北豆根进行
毒性评价的研究还未有报道。本文选用北豆根的主要活性
成分蝙蝠葛碱，探讨其在体外是否具有肝肾细胞毒性。
1 材料
1.1 细胞株
L- 02细胞株，HEK- 293细胞株，HK- 2细胞株均来
自上海中科院细胞库，其中 L- 02细胞和 HEK- 293细胞
使用的完全培养液为 DMEM 培养液 +10%胎牛血清
+1%双抗，HK- 2细胞使用的完全培养液为 DMEM/F12
培养液 +10%胎牛血清 +1%双抗。
1.2 试剂及材料
蝙蝠葛碱（上海融禾医药科技发展有限公司，纯度
>98%，批号：110829）；DMEM培养基（Gibco公司，批号：
938928）；DMEM/F12培养基（Gibco公司，批号：909369）；
双抗（Gibco公司，批号：741996）；胎牛血清（Hyclone 公
司，批号：NVM0347）；PBS；胰蛋白酶（Sigma公司，批号：
0458）；MTT（Sigma公司，批号：M2128）；二甲基亚砜（国
药集团化学试剂有限公司，批号：T20110414）；AST（日
本世诺临床诊断制品株式会社，批号：L134/R1 L129/R2）；
ALP（日本世诺临床诊断制品株式会社，批号：F126/R1
F127/R2）；LDH（日本世诺临床诊断制品株式会社，批号：
A124/R1 K204/R2）。
1.3 仪器
CO2培养箱（Thermo 公司，SN：309519- 9426）；全自
动酶标仪（BioTek公司，Synergy HT）；日立 7080全自动
血液生化仪（日本日立贸易有限公司）；荧光倒置相差显
微镜（Olympus公司，型号：CKX41）。
2 方法
2.1 蝙蝠葛碱对肝肾细胞活力的影响
将处于对数生长期的 L- 02、HEK- 293 或 HK- 2 细
胞分别经 0.25%胰酶消化后，制成细胞悬液，接种于 96
孔板中,每孔 180 L（细胞浓度约为 7×104 mL-1）。孵育
24h后分别以含不同浓度药物组的完全培养液处理细
胞，同时设不加药的空白对照组，每组设 4个平行孔，置
于 37℃ CO2培养箱中。蝙蝠葛碱在各细胞试验中的浓
度及分组如下：L- 02 细胞（12.5、25、50、100 g·mL-1），
HEK- 293 细胞（25、50、100、200 g·mL-1），HK- 2 细胞
（6.25、12.5、25、50 g·mL-1）。培养 20 h后避光加入 MTT
溶液 20 L，置培养箱中继续培养 4h。弃上清，加入二甲
基亚砜溶解蓝紫色结晶，振荡混匀，另设调零孔，在酶标
仪检测波长 570 nm处测定吸光度 A，计算细胞活力，并
将药物组与对照组进行统计分析，重复实验 3次。公式：
细胞活力 =（药物组平均 A- 调零孔 A）÷（对照组平均
A- 调零孔 A）×100％。
2.2 蝙蝠葛碱对肝肾细胞形态的影响
将处于对数生长期的 L- 02、HEK- 293 或 HK- 2 细
胞分别经 0.25%胰酶消化后，制成细胞悬液，接种于 24
孔板中，每孔 900 L（细胞浓度约为 18×104mL-1）。孵
育 24 h后分别以含不同浓度药物组的完全培养液处理
细胞，同时设不加药的空白对照组，每组设 3个平行孔，
置于 37℃ CO2培养箱中。蝙蝠葛碱在肝肾细胞试验中
的浓度及分组如下：25、50、100、200 g·mL-1。给药 24h
后，用倒置相差显微镜进行细胞形态学观察。
2.3 蝙蝠葛碱对肝肾细胞功能性指标的影响
同 2.2对细胞进行处理，给药 24h后取细胞上清液，
1200 r·min-1离心 5 min，取上清，全自动血液生化仪检
测肝细胞上清液中的 AST、ALP、LDH和肾细胞上清液
中的 LDH含量。
2.4 统计学处理
实验数据均采用 ±s表示，使用 SPSS 15.0软件进
行统计处理，采用单因素方差分析（One- way ANOVA），
方差齐时用 LSD方法分析，方差不齐时用 Dunnett’s方
法分析。若 P <0.01，两者有极显著性差异；若 P <0.05，两
者有显著性差异。IC50采用 Bliss法进行计算。
3 结果
3.1 蝙蝠葛碱对肝肾细胞活力的影响
3.1.1 蝙蝠葛碱对 L- 02细胞活力的影响 与对照组相比，
给予 12.5~100 g·mL-1蝙蝠葛碱 24h后，50与 100 g·mL-1
组的肝细胞活力均明显下降，有极显著性差异（P<0.01），且
呈剂量依赖性，IC50=60.20 g·mL-1（表 1）。
3.1.2蝙蝠葛碱对 HEK- 293细胞活力的影响 与对照组
相比，给予 25~200 g·mL-1蝙蝠葛碱 24h后，各组的肾
细胞活力均明显下降，有极显著性差异（P <0.01），且呈
剂量依赖性，IC50=48.56 g·mL-1（表 2）。
3.1.3 蝙蝠葛碱对 HK- 2细胞活力的影响 与对照组相
μ
μ
μ
μ
χ
μ
μ μ
表 1 蝙蝠葛碱对 L-02细胞活力的影响（ ±s，n =4）
组别 浓度（ g·mL-1） A 细胞活力（%）
对照 - 0.840±0.033 100.00±3.93
蝙蝠葛碱 100 0.108±0.020** 12.86±2.38**
50 0.516±0.056** 61.43±6.67**
25 0.854±0.087 101.67±10.36
12.5 0.820±0.066 97.62±7.86
μ
χ
注：与对照组相比，**P <0.01
μ
μ
μ
μ
μ
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比，给予 6.25~50 g·mL-1蝙蝠葛碱 24h 后，12.5、25 和
50 g·mL-1组的肾细胞活力均明显下降，有显著性差异
（P <0.01或 0.05），且呈剂量依赖性，IC50=52.52 g·mL-1
（表 3）。
3.2 蝙蝠葛碱对肝肾细胞形态的影响
3.2.1 蝙蝠葛碱对 L- 02细胞形态的影响 正常 L- 02细胞
呈不规则的多边形，细胞紧密衔接且贴壁生长；200 g·mL-1
蝙蝠葛碱组的肝细胞大量变圆、死亡且漂浮于培养液
中，其余细胞呈梭状生长；100 g·mL-1蝙蝠葛碱组的肝
细胞数量明显减少，形状由多边形变为梭形，细胞内可见
大量空泡产生，部分细胞变圆脱落死亡；25和 50 g·mL-1
蝙蝠葛碱组的肝细胞形态未发生明显的改变。
3.2.2 蝙蝠葛碱对HEK- 293细胞形态的影响 正常HEK-
293细胞呈不规则的多边形，细胞紧密衔接且贴壁生长；
200 g·mL-1蝙蝠葛碱组的肾细胞大量变圆、死亡且漂
浮于培养液中；100 g·mL-1蝙蝠葛碱组的肾细胞部分皱
缩、变圆脱落且形状由多边形变为梭形；25和 50 g·mL-1
蝙蝠葛碱组的肾细胞形态未发生明显的改变。
3.2.3 蝙蝠葛碱对 HK- 2细胞形态的影响 正常 HK- 2细
胞间连接紧密，贴壁生长，形态呈鹅卵石样；200 g·mL-1
蝙蝠葛碱组的肾细胞数量大量减少、细胞皱缩变圆、部
分死亡细胞漂浮于培养液中；100 g·mL-1蝙蝠葛碱组
的肾细胞数量明显减少、细胞拉长呈纺锤状、少量细胞
脱壁死亡；25和 50 g·mL-1蝙蝠葛碱组的肾细胞形态
未发生明显的改变。
3.3蝙蝠葛碱对肝肾细胞功能性指标的影响
3.3.1 蝙蝠葛碱对 L- 02细胞功能性指标的影响 与对
照组相比，给予 25~200 g·mL-1蝙蝠葛碱 24h 后，100
和 200 g·mL-1组的肝细胞上清液中的 AST、ALP、LDH
表 2 蝙蝠葛碱对 HEK-293细胞活力的影响（ ±s,n =4）χ
组别 浓度（ g·mL-1） A 细胞活力（%）
对照 - 0.704±0.039 100.00±5.54
蝙蝠葛碱 200 0.152±0.031** 21.59±4.40**
100 0.178±0.042** 25.28±5.97**
50 0.352±0.069** 50.00±9.80**
25 0.482±0.037** 68.47±5.26**
μ
注：与对照组相比，**P <0.01
图 3 蝙蝠葛碱对 HK-2细胞形态的影响（200倍）
对照 25 g·mL-1蝙蝠葛碱μ 50 g·mL-1蝙蝠葛碱μ
100 g·mL-1蝙蝠葛碱μ 200 g·mL-1蝙蝠葛碱μ
表 3 蝙蝠葛碱对 HK-2细胞活力的影响（ ±s,n =4）χ
组别 浓度（ g·mL-1） A 细胞活力（%）
对照 - 0.189±0.013 100.00±6.88
蝙蝠葛碱 50 0.095±0.016** 50.26±8.47**
25 0.167±0.006** 88.36±3.17**
12.5 0.170±0.007* 89.95±3.70*
6.25 0.178±0.004 94.18±2.12
注：与对照组相比，**P <0.01，*P <0.05
μ
μ
μ
图 1 蝙蝠葛碱对 L-02细胞形态的影响（200倍）
对照 25 g·mL-1蝙蝠葛碱μ 50 g·mL-1蝙蝠葛碱μ
100 g·mL-1蝙蝠葛碱μ 200 g·mL-1蝙蝠葛碱μ
μ
μ
μ
图 2 蝙蝠葛碱对 HEK-293细胞形态的影响（200倍）
对照 25 g·mL-1蝙蝠葛碱μ 50 g·mL-1蝙蝠葛碱μ
100 g·mL-1蝙蝠葛碱μ 200 g·mL-1蝙蝠葛碱μ
μ
μ
μ
μ
μ
μ
μ
μ
μ
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含量均明显升高，有显著性差异（P <0.01），且呈剂量依
赖性（表 4）。
3.3.2 蝙蝠葛碱对 HEK- 293细胞功能性指标的影响 与
对照组相比，给予 25~200 g·mL-1蝙蝠葛碱 24h后，50~
200 g·mL-1组的肾细胞上清液中的 LDH含量均明显
升高，有显著性差异（P <0.01 或 <0.05），且呈剂量依赖
性（表 5）。
3.3.3蝙蝠葛碱对 HK- 2细胞功能性指标的影响 与对照
组相比，给予 25~200 g·mL-1蝙蝠葛碱 24h 后，100 和
200 g·mL-1组的肾细胞上清液中的 LDH含量明显升
高，有显著性差异（P <0.01），且呈剂量依赖性（表 6）。
4 讨论
北豆根有小毒，临床不良反应报道主要是肠道反
应，大剂量使用会造成肾毒性损伤。大量药理研究表明
其发挥功效的物质主要为其所含的生物碱类成分，部分
毒理实验表明其产生毒性的物质基础亦为所含的生物
碱类成分，其中蝙蝠葛碱可造成动物中枢神经兴奋、惊
厥，最后导致呼吸肌麻痹而死亡[4]。已有研究表明，北豆
根水提、醇提组分对大鼠的长期毒性表现主要是肝、肾
损伤，且醇提物的损伤更大[5]。北豆根小鼠急毒实验显示
其水提组分的最大耐受量为 92.12 g·kg-1，醇提组分的半
数致死量为 75.116 g·kg-1[6]，但北豆根不同组分中蝙蝠
葛碱的含量大小与急性毒性并不完全一致[7]。
本实验研究表明，蝙蝠葛碱对肝肾细胞的活力均有
明显的抑制作用，且存在量效关系，其对 L- 02、HEK- 293
和 HK- 2细胞的半抑制浓度 IC50值分别为 60.20、48.56
和 52.52 g·mL-1，IC50值相近，表明蝙蝠葛碱对肝肾细胞
活力的抑制程度基本一致。蝙蝠葛碱高剂量组（200和
100 g·mL-1组）能明显升高肝细胞上清液中的功能性
指标 AST、ALP、LDH含量和肾细胞上清液中的功能性
指标 LDH含量，而形态方面的影响主要表现为肝肾细
胞拉长呈纺锤状或梭状生长、细胞的大量死亡且肝细胞
中出现大量明显的空泡等，其对细胞的损伤程度存在量
效关系。MTT实验、细胞形态学观察和功能性指标检测
实验结果之间存在一定的相关性，但相比之下 MTT实
验的结果更为敏感，可能是由于相同药物浓度作用下的
细胞浓度不同的关系。以上的实验结果均表明了蝙蝠葛
碱对肝肾细胞具有一定的毒性作用。
通过以上的实验，初步证实北豆根中的成分蝙蝠葛
碱对人正常肝细胞、人胚肾细胞和人肾小管上皮细胞有
一定的毒性作用，提示蝙蝠葛碱对肝肾可能具有毒性且
是中药北豆根的肝肾毒性物质基础之一，且北豆根体外
实验与体内实验有一定的相关性，体外实验能对体内实
验的研究提供一定的参考依据。
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（收稿日期：2011- 06- 18 编辑：汤韧）
表 4 蝙蝠葛碱对 L-02细胞功能性指标的影响（ ±s，n =3）
组别
浓度
（ g·mL-1）
AST
（IU·L-1）
ALP
（IU·L-1）
LDH
（IU·L-1）
对照 - 3.00±0.00 11.33±0.58 66.67±1.15
蝙蝠葛碱 200 17.00±1.00** 24.33±0.58** 214.00±7.00**
100 7.00±0.00** 17.67±0.58** 105.33±3.51**
50 3.00±0.00 12.33±0.58 67.33±2.31
25 2.67±0.58 11.67±1.53 63.67±4.51
μ
χ
注：与对照组相比，**P <0.01
组别
浓度
（ g·mL-1）
LDH
（IU·L-1）
对照 - 69.67±0.58
蝙蝠葛碱 200 118.67±13.43**
100 90.00±1.00**
50 81.33±0.58*
25 72.33±0.58
表 5 蝙蝠葛碱对 HEK-293细胞功能性指标的影响（ ±s，n =3）χ
注：与对照组相比，**P <0.01，*P <0.05
μ
表 6 蝙蝠葛碱对 HK-2细胞功能性指标的影响（ ±s，n =3）
组别
浓度
（ g·mL-1）
LDH
（IU·L-1）
对照 - 78.00±1.00
蝙蝠葛碱 200 102.00±2.65**
100 86.67±0.58**
50 81.67±2.08
25 79.33±2.87
χ
μ
注：与对照组相比，**P <0.01，*P <0.05
μ
μ
μ
μ
μ
μ
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