全 文 :第 31 卷 第 3 期
2012 年 3 月
分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)
Vol. 31 No. 3
247 ~ 254
收稿日期:2011 - 10 - 07;修回日期:2011 - 12 - 03
基金项目:国家自然科学基金项目(30872404);“973 计划”资助项目 (2010CB /833603);中国博士后基金项目(20090450099,
201003359)
* 通讯作者:蔡继业,博士,教授,研究方向:生物纳米技术,Tel:020 - 85223569,E - mail:tjycai@ jnu. edu. cn
AFM研究蝙蝠葛碱对 daudi细胞毒性的影响
陈 伟1,2,王穗湘3,胡小毛4,刑晓波1,2,蔡继业1,2*
(1. 暨南大学 光电信息与传感技术广东普通高校重点实验室,广东 广州 510632;2. 暨南大学
化学系,广东 广州 510632;3. 暨南大学 医学院,广东 广州 510632;4. 暨南大学
第一临床医学院,广东 广州 510632)
摘 要:利用原子力显微镜、CCK-8 实验和流式细胞术研究了蝙蝠葛碱(dauricine)对 B 细胞淋巴瘤 daudi 细
胞的细胞毒性。蝙蝠葛碱能显著抑制 daudi细胞的增殖。CCK-8 实验表明,细胞存活率与蝙蝠葛碱浓度存在
时间依赖和剂量依赖关系。经 10 ~ 50 μmol /L的蝙蝠葛碱作用 24 h后,daudi细胞存活率从(89. 8 ± 4. 3)%降
至(11. 2 ± 3. 2)%;48 h后,存活率从(68. 9 ± 2. 6)%降至(2. 5 ± 0. 5)%。流式细胞术表明蝙蝠葛碱处理 dau-
di细胞 24 h后,凋亡率从 5. 2%增至 28. 2%(60 μmol /L)。AFM 数据显示对照组细胞呈圆形,表面较光滑。
经蝙蝠葛碱处理后,daudi细胞坍塌,超微结构显示细胞表面粗糙、凹凸不平。此外,经不同浓度蝙蝠葛碱
作用的 daudi细胞,其线粒体膜电位随着药物浓度的加大而降低。蝙蝠葛碱能显著抑制 daudi细胞生长增殖。
关键词:蝙蝠葛碱;原子力显微镜;细胞毒性;超微结构;daudi细胞;细胞凋亡
中图分类号:O766. 1;R361. 3 文献标识码:A 文章编号:1004 - 4957(2012)03 - 0247 - 08
doi:10. 3969 / j. issn. 1004 - 4957. 2012. 03. 002
Study of Cell Toxicity of Dauricine on Daudi Cells Based
on Atomic Force Microscope
CHEN Wei1,2,WANG Sui-xiang3,HU Xiao-mao4,XING Xiao-bo1,2,CAI Ji-ye1,2*
(1. Key Laboratory of Optoelectronic Information and Sensing Technologies of Guangdong Higher Education Institutes,
Jinan Uinversity,Guangzhou 510632,China;2. Department of Chemistry,Jinan Universtiy,Guangzhou 510632,
China;3. Medical College,Jinan Universtiy,Guangzhou 510632,China;4. The First Affliated Hospital,
Jinan University,Guangzhou 510632,China )
Abstract:The toxicity of dauricine on daudi cell of B cell lymphoma was investigated by atomic force
microscopy,CCK-8 assay and flow cytometer method. The results showed that dauricine could sup-
press the proliferation of daudi cells. By CCK-8 assay,it was found that cell viability was related
with the reaction time and drug concentration. When 10 - 50 μmol /L dauricine was incubated with
daudi cells for 24 h and 48 h,respectively, the cell viability declined from (89. 8 ± 4. 3)% to
(11. 2 ± 3. 2)% and (68. 9 ± 2. 6)% to (2. 5 ± 0. 5)%,respectively. In addition,daudi cells
were cultured with different concentrations of dauricine for 24 h,the result revealed that the apoptosis
rate increased from 5. 2% to 28. 2% (60 μmol /L). AFM data showed that control cells were round
and the surface was smooth. After treated with dauricine,daudi cell collapsed,the ultrastructure re-
vealed that cell surface was rough and full of bumps and holes. Furthermore,daudi cells were treated
with different concentrations of dauricine, the mitochondrial membrane potential of cell decreased
with the increase of the dauricine concentration. Dauricine significantly inhibited the growth and pro-
liferation of daudi cells.
Key words:dauricine;atomic force microscope;cell toxicity;ultrasructure;daudi cell ;cell ap-
optosis
淋巴瘤是发源于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤。常见的淋巴瘤可分为霍奇金病和非霍奇金淋
巴瘤两大类。近年来,恶性淋巴瘤新发病例逐年上升,死亡率为 1. 5 /10 万,位列恶性肿瘤死亡数的第
分析测试学报 第 31 卷
11 ~ 13 位,与白血病相仿。Daudi 细胞系是来源于 Burkitt 氏淋巴瘤(Human Negroid Burkitts lymphoma)
的肿瘤细胞系之一,Burkitt 氏淋巴瘤是一类严重威胁人们生命与健康的恶性肿瘤,目前缺乏有效的治
疗方法。
图 1 蝙蝠葛碱的化学结构式
Fig. 1 Chemical structure of dauricine
蝙蝠葛碱(Dau,结构式见图 1)又称山豆根碱或北
豆根碱,是北豆根中最主要的成分。蝙蝠葛碱通过抑
制钠、钾、钙通道减慢心率,具有抗心律失常的作
用[1 - 3];临床上在治疗扁桃体炎、咽喉肿痛等方面有
良好效果。蝙蝠葛碱可通过 NF - kB 信号转导通道促
进结肠癌细胞凋亡[4],对多种癌细胞具有一定的抑制
增殖和诱导凋亡作用[5 - 7]。极少有文献研究其对 Bur-
kitt 氏淋巴瘤 daudi细胞的凋亡作用,本工作旨在研究蝙蝠葛碱诱导人 Burkitt 氏淋巴瘤 daudi细胞凋亡
作用,为蝙蝠葛碱应用于淋巴瘤的临床治疗提供一定的依据。
原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)具有纳米量级的分辨率,近年来广泛应用于生物、
物理等领域。AFM能够对单个细胞的形貌和超微结构进行三维化和定量分析,获得细胞表面结构和力
学性质的定量数据[8 - 13]。利用其可视化成像,可在形态学上显示细胞经药物作用前后的变化。AFM不
仅可应用于临床区分正常细胞和癌细胞,也有助于癌症的预防和早期诊断,以及推进抗癌新药物的发
展。而对细胞膜超微结构的研究可使医药学者更直观地理解细胞表面结构的变化对癌症形成、发展和
转移的影响。
本文通过 CCK-8、流式细胞术实验研究了蝙蝠葛碱对 daudi 细胞生长状态的影响,结合 AFM 分析
了蝙蝠葛碱作用前后细胞膜超微结构的变化,并探讨了蝙蝠葛碱对 B 细胞淋巴瘤 daudi 细胞增殖的
影响。
1 实验部分
1. 1 材料与仪器
细胞株与试剂:蝙蝠葛碱购自上海融禾医药科技发展有限公司(纯度 > 99. 2%) ;Daudi 细胞由暨
南大学医学院血液病研究所提供;RPMI 1640 培养液、链霉素和青霉素为美国 Gibco公司产品;小牛血
清购自杭州四季青公司;CCK-8 购自日本同仁化学研究所;JC-1 试剂盒购自上海碧云天有限公司;细
胞凋亡与坏死检测试剂盒为南京凯基公司产品。
AutoProbe CP Research 型原子力显微镜(美国 Thermo microscopes 公司)、酶标仪(奥地利 Tzcan 公
司)、流式细胞仪(Becton Dickinson) ,实验用水为超纯水。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 细胞培养 Daudi 细胞用含 10%新生胎牛血清、青霉素(100 U /mL)、链霉素(100 mg /L)的
RPMI 1640 培养基置于 5% CO2、37 ℃培养箱中培养,所有实验用细胞均取对数期细胞,实验前以台
盼蓝染色检测细胞活性均大于 95%。将蝙蝠葛碱用二甲基亚砜(DMSO )溶解为 100 mmol /L 的母液,
- 20 ℃保存,实验时取适量用培养基稀释至 1 000 μmol /L,再根据实验稀释至最终浓度,其中 DMSO
的体积分数不大于 0. 1%。
1. 2. 2 蝙蝠葛碱对 daudi细胞的生长抑制作用 取生长状态良好的对数期细胞种于 24 孔板中,密度
约 106 个 /mL,每孔 1 mL。加入 1 000 μmol /L蝙蝠葛碱调成终浓度为 10、20、30、40、50 μmol /L,培
养 24、48 h后,取 100 μL接种在 96 孔板中,并设对照组和空白组,每孔加入 10 μL CCK-8 试剂,在
细胞培养箱中孵育 5 h,以酶标仪测定 OD值(波长 450 nm,参比波长 630 nm) ,每组细胞设 5 个复孔。
细胞存活率 (%) =[(实验组 -空白组)/(对照组 -空白组) ]× 100%
空白组:含培养基和 CCK-8;实验组:含有细胞的培养基、CCK-8 和蝙蝠葛碱;对照组:含有细
胞的培养基、CCK-8。
1. 2. 3 细胞凋亡检测 将细胞种于 6 孔板中,密度约为 106 个 /mL,每孔 1. 5 mL,加入 1 000 μmol /L
蝙蝠葛碱调成终浓度为 10、20、30、40、60 μmol /L,培养 24 h,将细胞收集到 4 mL EP管中,离心弃
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第 3 期 陈 伟等:AFM研究蝙蝠葛碱对 daudi细胞毒性的影响
上清液,用 PBS重悬洗涤 1 次,并转移细胞至 1. 5 mL EP管中,16 ℃以 1 000 r /min离心 5 min,弃上
清液。加入 500 μL的缓冲液(Binding Buffer)重悬细胞和 5 μL的 AnnexinV - FITC 混匀后,再加入 5 μL
碘化丙啶(Propidium iodide,PI) ,混匀室温避光反应 15 min,1 h内用流式细胞仪检测。
1. 2. 4 原子力显微镜观察细胞形貌变化 用 0. 025 g /L 的多聚赖氨酸浸泡消毒过的盖玻片 4 h,室温
晾干,将其置于 6 孔板中,取生长状态良好的 daudi 细胞种在此 6 孔板中,调节细胞密度为 105 ~ 106
个 /mL,每孔 2 mL,加入蝙蝠葛碱,使终浓度为 10、20、30、40、60 μmol /L,培养细胞 24 h 后,吸
出培养基,每孔加入 1 mL 4%的多聚甲醛固定细胞 1 h,弃去多聚甲醛,用超纯水洗涤盖玻片 3 次。将
制备好的样品置于原子力显微镜的 XY 扫描台上,用监视器定位待扫描的样品区域,接触模式成像。
实验采用 100 μm扫描器,UL20B硅探针,微悬臂的弹性系数为 2. 8 N /m。AFM 图像仅经过自带软件
IP 2. 1 版的平滑处理,以消除扫描方向上的低频背景噪音。
1. 2. 5 细胞线粒体膜电位检测 将 daudi细胞种于 6 孔板,调整细胞密度 5 × 105 ~ 106 个 /mL,6 h 后
以 0、10、20、40 μmol /L的蝙蝠葛碱作用 12 h,每孔加入 1 mL JC-1 染色工作液(5 mg /L) ,置于 37 ℃
5% CO2 细胞培养箱孵育 20 min;离心收集细胞,以 JC-1 染色缓冲液洗涤细胞 2 次,最后染色缓冲液
重悬细胞,用流式细胞仪检测,设置 3 个重复组。
1. 3 数据分析
采用 Origin 7. 0 软件进行统计学检验。实验结果以 x ± s表示,数据分析采用单因素方差分析。
2 结果与讨论
图 2 不同浓度蝙蝠葛碱作用 daudi细胞
24 h和 48 h后的存活率
Fig. 2 Cell viability of daudi cells after being treated
with dauricine at various concentrations
for 24 h and 48 h
2. 1 蝙蝠葛碱对 Daudi细胞的生长抑制率情况
CCK-8 试剂含有的 WST-8 在电子载体 1-甲
氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)
作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶
性的黄色甲臜染料。生成的甲臜物数量和活细
胞数量成正比,被广泛用于细胞增殖和毒性分
析。以 10、20、30、40、50 μmol /L的蝙蝠葛碱
分别作用 daudi细胞 24 h后,细胞存活率逐步降
低,从(89. 8 ± 4. 3)% 依次下降到(60. 8 ±
4. 6)%、(52. 1 ± 5. 5)%、(43. 5 ± 4. 8)%、
(11. 2 ± 3. 2)%,其存活率 IC50值约为 30 μmol /
L;作用 48 h后细胞存活率从(68. 9 ± 2. 6)%依
次下降到(51. 9 ± 4. 6)%、(37. 6 ± 5. 1)%、
(22. 2 ± 2. 4)%、(2. 5 ± 0. 5)%,存活率 IC50值
约为 20 μmol /L(见图 2)。数据表明,蝙蝠葛碱
的浓度越大,daudi 细胞存活率越低,且同浓度
药物处理 48 h的存活率比 24 h低。
2. 2 细胞凋亡率分析
为进一步证明蝙蝠葛碱能显著抑制 daudi细胞增殖,采用 Annexin - V /PI 双染法定量检测 daudi 细
胞凋亡率。以 0 、10、20、30、40、60 μmol /L的蝙蝠葛碱作用 daudi细胞 24 h,流式细胞仪检测其凋
亡率,结果如图 3 所示。结果表明,早期凋亡率从 5. 2% (对照组)依次增加到 17. 6 %、23. 3%、
24. 6%、26. 9%、28. 2%(图 3 Q4 区),晚期凋亡率从 4. 4% (对照组)依次增加到 8. 4%、13. 1%、
11. 7%、20. 6%、30. 6%(图 3 Q2 区)。药物浓度越大,凋亡率越大,这与 CCK-8 实验结果大致相
吻合。
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分析测试学报 第 31 卷
图 3 不同浓度的蝙蝠葛碱作用 daudi细胞 24 h后凋亡率
Fig. 3 Daudi cells apoptosis rate under different concentrations of dauricine for 24 h
2. 3 细胞形貌的 AFM分析
细胞膜是细胞的重要结构,其内含有丰富的糖及蛋白等生物大分子,细胞膜把细胞与外界环境隔
开,保持细胞内部一系列的相对平衡稳定。细胞与外界环境发生的一切反应均通过细胞膜来完成,其
在调节细胞各项功能和生理代谢过程中发挥着巨大作用,包括物质运输、代谢调节和分子免疫
等[14 - 15]。因此细胞功能是否正常与细胞膜结构的变化有着直接联系[16 - 17]。经 AFM扫描成像,获得了
对照组和不同浓度蝙蝠葛碱作用的单个细胞成像,每组至少 10 个细胞。A、B 组为对照组,C 组为经
过 10 μmol /L蝙蝠葛碱作用 24 h的 daudi细胞,D、E 组为经过 20 μmol /L蝙蝠葛碱处理 24 h 的 daudi
细胞。在图 4 ~ 5 中,A1 ~ E1 是细胞误差信号图,A2 ~ E2 是细胞 3D图,A3 ~ E3 是细胞形貌图,A4 ~
E4 是 A3 ~ E3 细胞横切面高度图,A5 ~ E5 是细胞超微结构误差信号图,A6 ~ E6 是细胞超微结构形貌
图,A7 ~ E7 是 A6 ~ E6 对应结构区域粒径分布统计图。由图 4 中 A 组 A1、A2、A3 和 B 组 B1、B2、
B3 可以观察到对照组细胞呈大致圆形,直径约 10 μm,高度约 1. 5 ~ 2. 5 μm,细胞膜表面整体均一平
滑,细胞饱满、形态完整。图 C1 ~ C4 是 daudi细胞经 10 μmol /L蝙蝠葛碱处理 24 h组,观察到细胞皱
缩并出现膜孔(如 C1 中箭头所示) ,细胞高度约从 2. 5 μm 降至 1. 2 μm。细胞膜表面变粗糙、凹凸不
平,细胞膜不再平滑均一。细胞膜由蛋白质、脂质和糖等组成,相同细胞经过不同处理后,其细胞膜
表面的蛋白、脂质和糖组分会有很大的差异[16 - 17]。对照组细胞 3 μm × 3 μm 超微结构膜表面较平坦,
无较大分子颗粒突出或内凹,细胞膜结构完整。如图 5 中 C5、C6 能清楚地观察到细胞膜表面密集的颗
粒状突起物,其中凹凸不平的膜表面分布着大量小颗粒,这是细胞膜表面的蛋白质、脂、糖等生物大
分子[7,18]。A7 ~ E7,表示细胞 3 μm ×3 μm超微结构膜表面颗粒的粒径分布统计图,横坐标表示颗粒直
径,纵坐标表示颗粒数,由 AFM自带软件 IP 2. 1自动对成像区域统计分析所得。对照组细胞的超微结构
颗粒粒径分布主要聚集在 40 ~80 nm(<100 nm) (图 5 A7、B7) ,药物处理组细胞(10 μmol /L)超微结构粒
径分布则在 150 ~180 nm(>100 nm) (图 5 C7)。D1、E1细胞高度较对照组细胞下降,细胞周围出现不规
则丝状伪足,胞质外流,其 3 μm ×3 μm超微结构显示,细胞膜上的颗粒排列疏松致使膜表面凹凸不平,
大分子颗粒物突出、内凹,粒径分布大于 100 nm。细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸从胞质转至胞外、细胞质
外流是细胞早期凋亡的一个重要特征[19 - 22],D组和 E组细胞从形态学上展现了相同的细胞凋亡现象。实
验结果证明蝙蝠葛碱能破坏 daudi细胞膜结构,使细胞质外流,进而引发细胞凋亡。
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第 3 期 陈 伟等:AFM研究蝙蝠葛碱对 daudi细胞毒性的影响
图 4 对照组与蝙蝠葛碱(10、20 μmol /L)处理 24 h后的 daudi细胞拓扑形貌图
Fig. 4 The topological morphology of daudi cells between control group and drug group being
treated by 10,20 μmol /L dauricine for 24 h
A1 - E1:the whole cell image;A2 - E2 ∶ the 3D mode of A1 - E1;A3 - E3:
topological morphology;A4 - E4:the cross - sectional height profile of A3 - E3
2. 4 线粒体膜电位变化
线粒体在细胞凋亡过程中处于核心位置,线粒体跨膜电位的耗散和膜通透性的增加会导致线粒体
内的物质如细胞色素 C(Cytochrome C)等转移至胞浆中,引发一系列凋亡过程。JC-1 是一种广泛用于
检测线粒体膜电位 ΔΨm的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时,JC-1 聚集在线粒体的基质中,形成
的聚合物可产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1 为单体(Monomer) ,产生绿色荧光。因此可
通过荧光颜色的转变检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
线粒体去极化增强发生在细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻之前,继而引发细胞凋亡[23]。细胞凋亡和线粒体膜
电位密切相关,凋亡和坏死细胞使红色荧光强度降低,绿色荧光强度上升。红绿荧光强度比值下降,
表明细胞线粒体膜电位下降。分别以 0、10、20、40 μmol /L蝙蝠葛碱作用 daudi细胞 12 h,结果如图 6
所示,图 B 的 4 个小图中,箭头指示部分表示红色荧光强度,P2 闭合区间部分表示绿色荧光强度,图
A是对红绿荧光强度比值的统计图,结果发现,其红绿荧光强度比由 0. 896 ± 0. 019 下降至 0. 713 ±
0. 015,线粒体膜电位下降。
3 讨 论
蝙蝠葛碱的药理作用广泛,近年来越来越多的文献报道了其对肿瘤的抑制增殖作用[3 - 7]。本实验
结果证明蝙蝠葛碱对 daudi细胞具有明显的抑制增殖作用,且随着药物浓度的增加,抑制作用变明显。
蝙蝠葛碱作用 daudi细胞 24 h后,细胞存活率从(89. 8 ± 4. 3)%下降至(11. 2 ± 3. 2)%,作用 48 h 后,
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分析测试学报 第 31 卷
其存活率从(68. 9 ± 2. 6)%下降至(2. 5 ± 0. 5)%,表明蝙蝠葛碱对 daudi细胞具有抑制增殖并诱导凋亡
的作用。
图 5 细胞超微结构图(3 μm ×3 μm)
Fig. 5 Ultrastructural data of daudi cells(3 μm ×3 μm)
A5 - E5:AFM three-dimensional images;A6 - E6:ultrasructure of cell membrane;A7 - E7:histograms of the particle size
AFM因其超高分辨率,对样品无损伤及制样简单等优点已广泛应用于生物医学领域[24 - 25],利用
AFM对 daudi细胞形貌和细胞膜表面超微结构进行可视化研究,探讨对照组和药物处理组 daudi细胞的
高度、形貌学和超微结构变化,将细胞形态结构与生理功能相联系,可为各种生理及病理机制提供可
视化依据[26 - 27]。本实验发现对照组细胞呈大致圆形,细胞饱满,细胞膜表面光滑平整;药物作用组细
胞骨架破坏,出现塌陷,细胞皱缩;细胞膜表面出现孔洞,膜表面粒径分布增大,超微结构变复杂,
这可能与生物大分子颗粒聚集变化导致细胞膜粗糙不平有关[6 - 7]。且膜表面出现不规则的凹凸,并伴
随大量丝状伪足伸出,胞质外流,细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻,这是细胞早期凋亡的典型特
征[19 - 22]。细胞凋亡实验也证明了蝙蝠葛碱能显著诱导 daudi 细胞凋亡,且凋亡率与浓度呈依赖关系。
作为一种具有超高分辨率的新型检测细胞凋亡手段,AFM可在纳米尺度上进一步探讨新药物对癌细胞
的杀伤作用,为临床提供有价值的数据。
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第 3 期 陈 伟等:AFM研究蝙蝠葛碱对 daudi细胞毒性的影响
图 6 流式细胞仪检测不同蝙蝠葛碱处理 daudi细胞 12 h后的荧光强度比
Fig. 6 Flurorescence intensity ratio of daudi cells after being treated with dauricine in
different concentrations for 12 h by flow cytometry
A:statistic graph of red /green fluorescence ratio;B:intensity value of red and green fluorescence
线粒体是细胞的发动机,控制着细胞生命活动的 ATP运输,若线粒体出现异常,将会影响细胞活
性,引起诸如谷胱甘肽下降、活性氧水平上升、线粒体膜电位下降等一系列变化,这些变化均与细胞
凋亡密切相关[28]。本实验发现,随着药物浓度的增加,daudi 细胞的线粒体膜电位降低,而蝙蝠葛碱
抑制 B细胞淋巴瘤 daudi细胞增殖、促其凋亡的具体机制尚不清晰。本实验结果对进一步研究线粒体
凋亡通道是否为 daudi细胞凋亡通道提供了一定的理论基础。
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279 - 290.
波兰和爱尔兰科学家联合研制成功可以灭杀源于医院病菌的纳米材料
各个国家的医院无一不是不同病人的汇集处和病菌交叉传染地,有效防止源于医院病菌的扩散一
直是国际医务界普遍关注的课题,并为此不惜工本采取了各种预防措施。
波兰弗罗茨瓦夫理工大学、弗罗茨瓦夫医科大学和爱尔兰利默里克大学的科学家们联合研制成功
一种纳米材料可以有效地灭杀大部分种类源于医院的病菌,以最大限度地减少患病的危险。这种纳米
材料是一种可以加入到普通纺织物的二氧化钛纳米粒子,它具有灭杀病菌的特性,在日光下可以在非
由外力诱发下灭杀常见的病菌。
科学家介绍说,新的技术经济效益高,使用范围广,可以重复使用,替代目前欧洲医院广泛使用
的一次性的医生专用服,除此之外,还可以做窗帘、地毯,理发店、游泳馆和饭店的毛巾,被单,各
类交通工具的座套。加入这种材料的纺织物看上去很普通,与其它材料没有不同,可以在洗衣机中洗
涤。目前科学家正在尝试尽可能减少使用高分子数量。
(信息来源:科技部)
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