全 文 ：作者简介:欧仕益(1963-),男 ,暨南大学食品科学与工程系教授 、博
士。 E-mail:tosy@jnu.edu.cn
收稿日期:2007-03-13
第 23卷第 4期
2 0 0 7年 7月
FOOD＆ MACHINERY
食 品 与 机 械 Vol.23, No.4July, 2 00 7
米团花色素的毒理学研究
Toxicologicalresearchonyelowpigmentpreparedfrom
Leucosceptrumcanum(Smith)
欧仕益 1
OUShi-yi1　
朱易佳1
ZHUYi-jia1　
谭艳来 1
TANYan-lai1　
张广文1
ZHANGGuang-wen1　
黄才欢1
HUANGCai-huan1　
黄俊明2
HUANGJun-ming2
(1.暨南大学食品科学与工程系 ,广东 广州　510632;2.广东省疾病预防控制中心 ,广东 广州　510300)
(1.DepartmentofFoodScienceandEngineering, JinanUniversity, Guangzhou, Guangdong510632, China;
2.CenterofDiseaseControlofGuangdongProvince, Guangzhou, Guangdong510300, China)
摘要:采用热水提取 , 获得色价为 1 040 U/mL的米团花色
素 , 利用小鼠进行急性毒性(LD50)、微核试验 、精子畸变和
Ames试验等毒理学试验项目 。结果表明:雌雄小鼠 LD50 >
21.5 g/kgBW, 属无毒级物质;2.50 ～ 10.0g/kgBW剂量的
微核试验和精子畸变试验结果为阴性 ,受试物对体细胞和生
殖细胞无诱变作用;Ames试验结果为阴性 ,受试物无直接或
间接的致突变作用。
关键词:米团花;色素;毒理学
Abstract:Yellowpigmentwithcolorvalue1 040 U/mLwasextractedby
waterat85℃ fromflowerofLeucosceptrumcanum(Smith)andtoxico-
logicalresearchwascariedoutintheCenterofDiseaseControlofGuang-
dongProvince.NIHmouse(SPEgrade)wasgivenoralyatdoseof2.15、
4.64、10.0、21.5g/kgBWanditwasfoundthattheLD50 valueofthe
pigmentwasmorethan21.5g/kgBW, clasifiedasnon-toxicgrade.No
mutationefectforbodycelandreproductivecelwasobservedatdoseof
2.5to10.0g/kgBWrespectivelybybonemarowmicroleuesassayand
spermshapeabnormalitytest.Amestestwasnegative.
Keywords:Leucosceptrumcanum(Smith);Pigment;Toxicology
天然色素具有天然和健康属性 , 世界天然色素市场以 2
倍以上的速度快速增长 , 其售价为合成色素的数倍至数十
倍 [ 1～ 4] 。但天然色素稳定性差成为阻碍其应用的瓶颈 , 开发
天然 、稳定 、保健的食用色素是今后的主攻目标。
在红 、黄 、兰(绿)3类色素中 , 黄色素是应用最广的一
种 , 占市场需求量的 60%,涉及的食品有焙烤食品 、油炸食品
(方便面)、饮料(含果汁)、罐头 、糖果 、凉果类 、冰淇淋 、肉制
品等 [ 5] 。目前 ,我国批准使用的天然黄色素主要为栀子黄 、
红花黄 、姜黄 、菊花黄浸膏 、玉米黄 、柑桔黄 , 而水溶性好的只
有栀子黄 、菊花黄浸膏。栀子黄是目前应用最广的一种天然
水溶性黄色色素 , 但它耐光性较差 , 耐氧化还原能力一般 , 对
Na2SO3 、Fe3+耐受性较差 [ 6] ,且使用的原料是栀子果实 , 争夺
中药资源 , 制作成本较高。
米团花(Leucosceptrumcanum, Smith)为蜂源花 [ 7] , 是山
区的一种多年生灌木或乔木 ,其叶片可作为猪 、羊饲料 , 又称
羊巴巴;一些山区的居民自古以来就用其花浸提色素染色面
制品。 米团花色素色价高 、对光 、热 、酸 、氧化剂 、VC较稳
定 [ 8] , 且不是药食兼用资源 ,开发前景广阔。
为了推动米团花色素在食品工业中应用 , 进行了毒理学
试验。
1　材料与方法
1.1　材料和试验动物
米团花(Leucosceptrumcanum, Smith):采自云南省宝山
市 , 晒干后于 105 ℃烘干 4 h备用;
NIH种 SPF级健康小白鼠:由南方医科大学试验动物中
心提供(动物生产许可证号:2005A043, 质量合格证编号:
NO.0015301, 0015334, 0015332);
毒理学试验:在广东省疾病预防控制中心进行 , 中心试
验动物使用许可证号为 SYXK(粤)2003-0011。
1.2　色素的制备
称取 2 kg米团花 ,用 85 ℃的热水 15 L提取 30 min, 共
提取 3次;离心去渣 ,真空减压浓缩至 3 kg左右 ,加乙醇至乙
醇终浓度 60%, 静置 6h,过滤 , 真空减压浓缩至 2kg,测定色
价 、重金属和农药残留。
色价测定:取 1mL色素溶液稀释 2 000倍 ,在 433nm下
测定 OD值。
色价(U/mL)=OD433 ×稀释倍数
112
DOI :10.13652/j.issn.1003-5788.2007.04.027
汞 、 砷 、 铅 检 测 分 别 按 GB/T5009.17——— 2003,
GB/T5009.11——— 2003和 GB/T5009.12——— 2003进行;六六
六 、滴滴涕检测按 GB/T5009.19——— 2003进行。
1.3　小鼠急性毒性(LD50)、微核试验 、精子畸变试验
按《食品安全性毒理学评价程序和方法》 [ 9]进行。
1.3.1　急性毒性试验　采用霍恩氏(Horn s)法。 受试物剂
量为 21.5, 10.0, 4.64, 2.15 g/kgBW,试验时称取样品 21.5,
10.0, 4.64, 2.15 g用纯净水稀释至 30mL供试。
选用体重 18 ～ 22 g的健康 NIH种小白鼠 40只 , 随机分
为 4个剂量组 , 每组 10只 ,雌雄各半 , 禁食不禁水 16 h后按
2.15, 4.64, 10.0, 21.5 g/kgBW剂量给予受试物 , 灌胃量
0.3 mL/10 gBW, 灌胃 1次 ,观察 1周 , 记录小鼠中毒表现及
死亡情况。
1.3.2　小鼠骨髓微核试验　受试物设 2.50, 5.00, 10.0 g/kg
BW 3个剂量组 , 称取样品 2.50, 5.00, 10.0 g分别用纯净水
稀释至 20mL供试。 另设阴性对照组和阳性对照组。阴性
对照组给予等量的纯净水 , 阳性对照组选用受试剂量为
50 mg/kgBW的环磷酰胺(称取 50 mg环磷酰胺用纯净水稀
释至 20mL供试)。
用 30h给受试动物进行试验。选择 NIH种小白鼠 50
只 , 体重 25 ～ 30 g,随机分为 5组 , 每组 10只 , 雌雄各半。灌
胃量均为 0.2 mL/10 gBW, 24 h后以同样的剂量进行第 2
次染毒 , 6 h后 , 处死小鼠取胸骨骨髓材料制片 、染色 、油镜
下每只小鼠观察 1 000个嗜多染红细胞 (PCE),计数含有微
核的嗜多染红细胞数 ,计算各组微核发生率(‰), 同时计数
200个 PCE时观察到的正染红细胞(NCE), 求出嗜多染红细
胞数与成熟红细胞比值(PCE/RBC), 按泊松分布方法作统
计学处理。
1.3.3　小鼠精子畸形试验　受试物给予试验方法同 1.3.2。
选择 NIH种雄性小鼠 25只 , 体重 25 ～ 35 g, 随机分成 5组 ,
每组 5 只。 每天灌胃 1 次 , 连续灌胃 5 d, 灌胃量均为
0.2 mL/10 gBW, 首次染毒后第 35天处死动物取双侧副睾
按常规制片 、染色 , 高倍镜下每只小鼠观察 1 000条完整精
子 , 计数含有精子畸形的数量和类型 , 计算各组精子畸形发
生率(‰), 按 Wilcoson秩和检验方法作统计学处理 。
1.4　鼠伤寒沙门氏菌 /哺乳动物微粒体酶试验(Ames)试验
按《食品安全性毒理学评价程序和方法 》[ 9]进行。试验
菌株为经过鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型
TA97、TA98、TA100、TA102。 代谢活化系统为多氯联苯
(PCB)诱导的大鼠肝匀浆 S9液(当代谢活化时加入)。
根据受试物情况 ,本试验最高剂量设定为 5 000 μg/皿 ,
按 5倍间隔 , 共设 5个剂量组 , 分别为 5 000, 1 000, 200, 40,
8 μg/皿 , 同时设自发回变 、溶剂对照和阳性对照组。 试验前
称取样品 5.00 g, 以无菌蒸馏水为溶剂 , 待样品溶解后 , 用无
菌蒸馏水加至 100 mL, 沸水浴 30 min后 , 制成 5%的母液作
为最高剂量。另无菌取 10.00 mL5%的母液以无菌蒸馏水
稀释至 50mL,振摇混匀 , 制成次剂量受试物溶液 , 按上述操
作依次做 5倍稀释至所需各剂量受试物溶液供试验用。
试验方法为平板掺入法:在顶层培养基中加入 0.10 mL
试验菌株增菌液 , 0.10 mL受试物溶液和 S9混合液(当代谢
活化时加入)0.50 mL, 混匀后倒入底层培养基平板上 , 每一
剂量组均为 3个皿。置 37 ℃下培养 48 h, 记录各试验组每
皿回变菌落数。当受试物组回变菌落数的增加超过溶剂对
照组 2倍以上 、并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重
复的并有统计学意义的阳性反应 ,即判定为该受试物 Ames
试验为阳性。
2　结果与分析
2.1　供试米团花色素的卫生学指标
米团花色素溶液的重金属和农药残留量见表 1, 大大低
于对姜黄素的限量 [ 10] 。
表 1　米团花色素的色价和卫生学指标
色价 /
(U· mL-1)
Hg/
(mg· kg-1)
As/
(mg· kg-1)
Pb/
(mg· kg-1)
六六六 /
(mg· kg-1)
滴滴涕 /
(mg· kg-1)
1 040 <0.01 <0.1 <0.1 <0.005 <0.005
2.2　小鼠急性毒理学试验
在 2.15 ～ 21.5 g/kgBW灌胃剂量范围内 , 未观察到小
鼠有不良反应 , 获得雄性和雌性小鼠经口急性毒性 LD50 >
21.5 g/kgBW(见表 2)。根据急性毒性分级 , 米团花色素属
于无毒级物质。
表 2　米团花色素的急性毒性试验结果
性别 剂量/(g· kg-1BW)
动物数
/只
始重
/g
终重
/g
死亡数
/只
雄性
21.5 5 19.8±1.2 28.8±0.5 0
10.0 5 20.3±0.4 28.9±1.2 0
4.64 5 20.2±1.3 29.2±1.2 0
2.15 5 19.3±1.4 28.4±1.7 0
雌性
21.5 5 20.1±1.3 25.1±1.1 0
10.0 5 18.8±0.4 24.2±0.9 0
4.64 5 20.8±0.7 24.0±0.7 0
2.15 5 20.0±1.6 24.0±0.9 0
2.3　小鼠骨髓微核试验和小鼠精子畸形试验
经统计学分析 , 米团花色素各剂量组的微核率与阴性对
照组比较均无显著性差异 (P>0.05), 试验结果为阴性(见
表 3);其精子畸形率与阴性对照组比较也无显著性差异
(P>0.05),试验结果为阴性(见表 4)。说明米团花色素对
小鼠体细胞和生殖细胞均无诱变作用。
113
安全与检测 　 2007年第 4期
表 3　米团花色素小鼠骨髓微核试验 +
剂量
/(g· kg-1 BW)
嗜多染红细胞数 /个
雌 雄
微核数 /个
雌 雄
微核率 /‰
雌 雄
PCE/RBC＊
雌 雄
10.0 5 000 5 000 8±1.4 6±1.2 1.6 1.2 0.74 0.71
5.0 5 000 5 000 7±1.2 8±1.6 1.4 1.6 0.81 0.74
2.5 5 000 5 000 6±1.6 5±1.2 1.2 1.0 0.77 0.79
0.00 5 000 5 000 5±1.0 4±1.9 1.0 0.8 0.79 0.77
环磷酰胺(0.05) 5 000 5 000 177±2.5＊＊ 192±4.7＊＊ 35.4 38.4 0.61 0.64
　　+　＊嗜多染红细胞数与成熟红细胞比值;＊＊与阴性对照组比较 P<0.01
表 4　米团花色素小鼠精子畸形结果 +
剂量
/(g· kg-1BW)
精子数
/条
精子畸形
数 /条
精子畸形
率 /%
10.0 5 000 83±5.2 16.6
5.0 5 000 91±9.5 18.2
2.5 5 000 95±4.4 19.0
0.00 5 000 83±4.7 16.6
环磷酰胺(0.05) 5 000 382±15.0＊＊ 76.4
　　+　＊＊与阴性对照组比较 P<0.01
2.4　Ames试验
米团花色素对鼠伤寒沙门氏菌 TA97、TA9S、TA100、
TAI02 4株试验菌株在加和不加 S9时 , 5 000, 1 000, 200,
40, 8 μg/皿 5个剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照菌落数
2倍 , 亦无剂量反应关系 , 表明 Ames试验结果阴性 (见
表 5)。
表 5　米团花色素对鼠伤寒沙门氏菌回变的影响
项目 剂量/((g·皿 -1)
TA97
-S9 +S9
TA98
-S9 +S9
TA100
-S9 +S9
TA102
-S9 +S9
5 000 116±7 129±11 34±3 36±3 163±13 190±9 263±28 313±37
1 000 108±12 139±15 33±3 39±2 155±15 167±17 285±30 301±26
样品组 200 108±11 126±10 33±2 40±7 164±7 174±6 272±16 291±21
40 103±18 125±15 34±1 37±5 168±6 175±6 271±26 287±19
8 117±9 125±14 37±6 39±4 172±14 183±17 271±21 291±22
自发回变 107±12 130±14 33±3 38±2 164±18 179±11 292±21 311±21
溶剂对照 120±12 126±14 32±3 41±1 164±7 184±14 295±17 297±21
NaN
3 1578±187
2-AF 1611±136 2344±214 2506±147
敌克松 2478±157 1937±144
丝裂霉素 C 2262±179
1, 8-二羟蒽醌 826±134
3　结论
以米团花黄色素为原料 ,利用小鼠进行急性毒性(LD50)、
微核试验、精子畸变和 Ames试验等毒理学研究 , 测得其
LD50 >21.5 g/kgBW(属无毒级物质);微核试验 、精子畸变试
验和 Ames试验结果均为阴性。这些毒理学试验结果表明:米
团花色素是一种安全的天然色素 ,可用作食用着色剂。
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114
第 23卷第 4期 欧仕益等:米团花色素的毒理学研究