全 文 ：湖南农业科学 2009，（9）：11~14 Hunan Agricultural Sciences
龙山大头菜乳酸菌的分离与鉴定
黄 群，麻成金，余 佶，张永康，吴 标
（吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000）
摘 要：通过对龙山大头酸菜乳酸菌的富集培养、分离初筛，得到 5株生长良好的菌株 Lab.1～Lab.5。对形态特征和菌落特征进
行的初步判定，及乳酸纸层析实验，确定其均为乳酸菌菌株。通过复筛，得到 Lab.4、Lab.5 2株产酸能力强，硫化氢、甲基红和吲
哚实验呈阴性，能分解蛋白质、糖类和明胶的优势乳酸菌菌株。
关键词：大头菜；乳酸菌；分离鉴定
中图分类号：Q93-331 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2009）09-0011-04
Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Longshan
Sauerkraut
HUANG Qun, MA Cheng-jin, YU Ji, ZHANG Yong-kang, WU Biao
( Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, PRC)
Abstract: Five productive bacterial strains (Lab.1, Lab.2, Lab.3, Lab.4, and Lab.5) were obtained by enrichment and
preliminary isolation for the lactic acid bacteria (LAB) in Longshan sauerkraut. The five strains were ascertained as LAB
strains according to the systematic identification in morphology and colony characteristics and the paper
chromatography of LAB. The acid producing ability of Lab.4 and Lab.5 were confirmed to be strong, and the
experiments of hydrogen sulfide, methyl red and indole were all appeared negative, which are advantaged LAB strains
that could disassemble the proteins, carbohydrates and gelatin.
Key words: sauerkraut; lactic acid bacteria; isolation and identification
龙山大头菜为湘西自治州地方名优特产，产品
色泽金黄、肉质脆嫩、香气馥郁、味美爽口。传统工
艺为全天然自然发酵，参与微生物种类丰富。但传
统工艺季节性强，发酵周期长，食盐、亚硝酸盐含量
高，导致产品质量难以保证，经济效益低下。乳酸菌
为决定大头菜质量的主要菌种，以传统发酵龙山大
头菜为原料，通过分离、初筛和复筛，获得产酸能力
较强、不产硫化氢、甲基红试验呈阴性、能利用糖类
和蛋白质等优良生产性能的优势乳酸菌菌株，为缩
短龙山大头菜生产周期、改善产品品质、实现产业
化生产提供优良菌种，对改进龙山大头菜传统酿造
工艺、实现产业化具有重要的理论与现实意义。
1 材料与方法
1.1 材 料
龙山大头酸菜，龙山人福大头菜有限公司提供。
1.2 试 剂
蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、琼脂、酵母膏、乙酸
钠、氯化钠、柠檬酸二铵、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、
七水硫酸镁、溴甲酚紫、溴甲酚绿、氢氧化钠、盐酸、
醋酸铅、亚硝酸钠、苯甲醇、正丁醇、甲酸等，均为分
析纯。
1.3 实验仪器
VS- 1300- U型洁净工作台，DS- 1型高速组织
捣碎机，LZD- 4 型自动立式高压蒸汽灭菌锅，
SPX- 250B- Z型恒温生化培养箱，GZX- 9146MBE
型电热鼓风干燥箱，TP- 1200C型电子天平等。
1.4 培养基
1.4.1 分离培养基 MRS液体培养基：蛋白胨 10.0
g，牛肉膏 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，磷酸氢二钾 2.0
g，柠檬酸二铵 2.0 g，乙酸钠 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐
温 80 0.1 mL，七水硫酸镁 0.58 g，四水硫酸锰 0.025
g，蒸馏水 1 000 mL。调 pH 6.2~6.4，121℃灭菌 20
min。
MRS固体培养基：在液体培养基中添加 18.0
g/L的琼脂。筛选时加入 3.0 g无水碳酸钙，121℃灭
收稿日期：2009-07-14
基金项目：湘西州科技计划项目(州科字[2007]123号)；吉首大
学校级科研项目（08JD020）
作者简介：黄 群(1977- )，男，湖南武冈市人，讲师，硕士，主
要从事食物资源研究与开发的教学科研工作。
DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2009.09.007
第 9期湖南农业科学
菌 20 min。
1.4.2 鉴定培养基 乳酸纸层析培养基：蛋白胨
5.0 g、牛肉膏 5.0 g、酵母膏 5.0 g、吐温 80 0.5 mL、葡
萄糖 10.0 g、蒸馏水 1 000 mL、1.6%溴甲酚紫 1.4
mL。调 pH 6.8～7.0，121℃灭菌 20 min。
1.4.3 筛选培养基 蛋白胨培养基：蛋白胨 8.0 g，
氯化钠 1.5 g，蒸馏水 100 mL。121℃灭菌 20 min。
产酸性实验培养基：MRS液体培养基。
产硫化氢培养基：牛肉膏 7.5 g、蛋白胨 10.0 g、
氯化钠 5.0 g、明胶 5.0 g、10%硫酸亚铁 5.0 mL、蒸
馏水 1 000 mL、pH 7.0、121℃灭菌 20 min。灭菌后，
在明胶尚未凝固时，加入新制备除菌后的硫酸亚
铁，高度为 4～6 cm，冷却，供穿刺接种。
甲基红实验培养基：蛋白胨 1.0 g，酵母提取物
1.0 g，无机盐溶液 4.0 mL（盐溶液成分：无水氯化钙
0.2 g，七水硫酸镁 20.0 g，磷酸氢二钾 1.0 g，磷酸二
氢钾 1.0 g，碳酸氢钠 10.0 g，氯化钠 2.0 g，葡萄糖
1.0 g）。将氯化钙和硫酸镁一起溶解于 300 mL蒸馏
水中，再加 500 mL蒸馏水，一边搅拌一边缓慢加入
其他盐类。继续搅拌直到全部溶解，加蒸馏水定容
至 1 000 mL，混合后贮备于 4℃。
蛋白质分解培养基：向 MRS固体培养基中加
入 15 g奶粉，121℃灭菌 20 min。倒平板，供穿刺接
种用。
吲哚实验培养基：试验用蛋白胨培养液中培养
该菌后，加入少量乙醚，滴入对二甲基氨基苯甲醛。
明胶水解实验：MRS固体培养基中用明胶替换
琼脂。
糖发酵培养基：蛋白胨 1.0 g、氯化钠 0.5 g、葡
萄糖 1.0 g（或其他糖醇）、蒸馏水 100 mL、pH 7.4。配
制时将蛋白胨先加热溶解。调 pH值，加入溴甲酚
紫溶液（1.6%水溶液）呈紫色，再加入葡萄糖（或其
他糖醇）使之溶解，分装试管，最后将杜氏小管倒置
放入试管中，121℃灭菌 30 min。
1.5 试验方法
1.5.1 富集培养 因乳酸菌主要集中在发酵酸菜
汁中，为达到更好的分离效果，可在分离筛选前进
行增殖培养。称取 10 g切碎的大头酸菜，加到 8%
的经灭菌的蛋白胨液体培养基中，30℃在摇床中厌
氧培养 2 h。
1.5.2 菌种初筛 将富集培养样品用无菌生理盐
水稀释至 10-1～10-5，分别吸取 0.1 mL涂布于培养
皿中，上面覆一层MRS固体培养基。30℃恒温培养
36～48 h。挑取长势良好且钙溶圈大的菌落。进行
反复的分离、纯化，至得到纯菌落为止。将所获菌落
菌株编号、保存备用。
1.5.3 菌种鉴定 乳酸纸层析实验：把筛选出的菌
株分别进行乳酸纸层析分析。
1.5.4 复 筛 将筛选出的菌株分别进行形态特
征、菌落特征的观察，并进行各种生理生化特征试
验，包括蛋白质分离实验、产酸性实验、吲哚实验、
明胶水解实验、硫化氢实验、甲基红实验、糖发酵实
验。
1.5.5 菌种保存 将筛选出的菌种进行斜面接种，
在 30℃下培养 24 h，包扎好后在 0～4℃保存。
1.6 乳酸菌定性测定
乳酸定性鉴定－纸层析法：以 1.5%乳酸为标
准溶液对 Lab.1~Lab.5共 5株菌株发酵液进行纸层
析实验。展开剂为乙醇∶浓氨水∶水 =80∶5∶15
（体积比）；以 0.04%的溴甲酚绿酒精溶液为显色
剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸喷洒显色剂，并
计算 Rf值。
1.7 生化特征试验
1.7.1 产酸性实验 将分离的菌株接种于 MRS液
体培养，30℃培养 24 h，以空白培养基为对照，计算
其酸度。
1.7.2 产硫化氢实验 用新鲜斜面培养的菌种接
种在MRS固体培养基上，接种后用无菌镊子夹取
一条醋酸铅纸条用棉塞塞紧，使悬挂于试管中，下
端接近培养基表面，不接触液面，适温培养 3、7、14
d后观察，纸条变黑者为阳性，不变黑者为阴性。
1.7.3 甲基红实验 挑取新的待试纯培养物少许，
接种于通用培养基，培养于 36±1℃或 30℃（以
30℃较好）3~5 d，从第 2天起，每日取培养液 1 mL，
加甲基红指示剂 1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈
淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第 5天仍
为阴性，即可判定结果。
1.7.4 蛋白质分解实验 牛奶中主要含有乳糖和
酪蛋白，将分离的菌株进行穿刺接种，30℃下培养
48 h，连续培养基中能否形成一透明环。形成透明
环者为蛋白质分解试验阳性菌，表示该菌株能分解
蛋白质。
1.7.5 吲哚实验 将分离的菌株接种于蛋白胨培
养液中，30℃培养 48 h，加入少量乙醚，滴入对二甲
基氨基苯甲醛，产生玫瑰色者呈阳性。
1.7.6 糖发酵实验 将分离的菌株接种到带有置
杜氏小管的糖类产气培养基中，30℃培养 24 h，观
察杜氏小管内是否有气泡产生，同时还可通过观察
培养液的颜色确定菌株是否产酸。阳性为黄色，阴
12
第 9期
表 2 甲基红试验
编 号
Lab.1
Lab.2
Lab.3
Lab.4
Lab.5
2 d
+
-
-
-
-
4 d
+
-
-
-
-
6 d
+
-
-
-
-
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
酸
度
（
%）
0 4 8 12 16 24 30 36 48
时 间（h）
图 1 产酸试验结果
lab.1
lab.2
lab.3
lab.4
lab.5
表 1 产硫化氢试验
编 号
Lab.1
Lab.2
Lab.3
Lab.4
Lab.5
3 d
-
+
-
-
-
7 d
-
+
-
-
-
14 d
-
+
-
-
-
注:“+”为呈阳性反应，“-”呈阴性反应（下同）。
性为紫色。
1.8 测定方法
1.8.1 酸度测定 移液管准确量取 2 mL经发酵菌
液，加入 75 mL去离子水，摇匀后向发酵菌液中加
入 2~3滴酚酞指示剂，用 0.1 mol/L NaOH进行滴
定，至微红色 30 s不褪色即可。酸度计算公式：
酸度（以乳酸计）＝C（V1- V2）×0.09×100/W
C：为消耗 NaOH溶液的摩尔浓度；V1：为标定
时所消耗 NaOH标准溶液的体积；V2：为空白试验
中所消耗的 NaOH标准溶液体积；W：为样品重量；
0.09：为换算为乳酸的系数，即 1 mmol NaOH相当
于乳酸的克数。
1.8.2 Rf 值测定 将发酵菌液稀释至原浓度的
10-1～10-5，用滴管将 1滴稀释菌液点在纸上，重复
点样几次，每次点之前吹干。待层析液挥发完全后，
喷洒显色剂，测定菌液移动的距离。Rf值计算公式：
Rf=发酵菌液移动距离 /展开剂移动距离
2 结果与分析
2.1 菌株初筛
菌株产酸高低与溶钙圈大小成正比，据此共分
离得到 5株产酸能力较高的菌株，编号为 Lab.1、
Lab.2、Lab.3、Lab.4、Lab.5。
2.2 菌落观察
形态特征：菌株 Lab.1、Lab.2的形态特征及排
列方式都基本一致，均为短杆或豆状，无鞭毛，单个
或呈链状排列，数量较少；Lab.3、Lab.4、Lab.5表面
有鞭毛，半球状突起成对或串联，数量较多。
菌落特征：菌株 Lab.1、Lab.2在 MRS琼脂培养
基上的生长特性基本一致，菌落呈白色，圆形，中央
凸起，表面光滑，质地均匀，而且在挑取菌体时都有
一定的黏性。Lab.3、Lab.4、Lab.5表面凹凸不平，菌
落呈淡黄色。
根据对菌株形态特征和菌落特征观察，初步确
定所得菌株为乳酸菌菌株，其中 Lab.1、Lab.2为球
菌，Lab.3、Lab.4、Lab.5为杆菌。
2.3 乳酸定性鉴定
为进一步鉴定所得菌株是否为乳酸菌菌株，进
行纸层析试验。标准乳酸纸层析试验的 Rf值为
0.75，乳酸纸层析试验结果表明，5株菌株所产菌液
的 Rf值依次为 0.74、0.75、0.76、0.75、0.73，接近标
准 Rf值，可知菌液为乳酸，5菌株均为乳酸菌。
2.4 优势菌株筛选
2.4.1 产酸性试验 向 MRS液体培养基分别加入
1 mL菌液，摇匀后 30℃培养 24 h，每隔 4 h测定一
次酸度，结果如图 1所示。乳酸菌数量不够或产酸
能力低不仅会影响产品品质而且不能抑制其他微
生物的繁殖，导致产品质量下降甚至发酵失败；而
产酸能力过强会引起大头菜软化、也会导致产品品
质下降。酸菜食用时间与乳酸菌的发酵时期关系密
切。若前期食用，咸而不酸；若后期食用，酸而不咸，
失去酸菜风味，酸度达到 1.2～1.4时为酸菜的最佳
食用期。由图 1分析可知，筛选出的 Lab.4、Lab.5 2
株乳酸菌菌株发酵大头菜只需 48 h即可达到最佳
食用期，大大缩短发酵时间，提高生产效率。
2.4.2 产硫化氢试验 龙山大头菜若在发酵过程
中产生硫化氢，将会严重影响产品感官品质和风
味，产硫化氢试验结果见表 1。由表分析可知，Lab.2
产硫化氢试验呈阳性，其余均为阴性。利用其余 4
株菌株发酵将不会产生特殊味道的气体，可选择
Lab.1、Lab.3、Lab.4、Lab.5作为优势菌种。
2.4.3 甲基红试验 葡萄糖作为重要的能源物质，
是分解产生乳酸的重要物质。丙酮酸作为葡萄糖分
解的副产物，其产生、积累不仅影响大头菜产品品
质，还会抑制乳酸发酵。甲基红试验结果见表 2。由
表分析可知，Lab.1甲基红试验呈阳性，即能产生丙
酮酸。其余 4株甲基红试验均呈阴性，表示不产生
黄 群等：龙山大头菜乳酸菌的分离与鉴定 13
第 9期湖南农业科学
（上接第 10页）
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（责任编辑：卢红玲）
表 3 糖发酵试验
糖种类
乳 糖
鼠李糖
麦芽糖
肌 醇
树胶醛糖
半乳糖
葡萄糖
木 糖
果 糖
核 糖
海藻糖
Lab.1
+
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
Lab.2
+
-
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Lab.3
+
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
Lab.4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
Lab.5
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
注：“+”代表能利用该种糖，“-”代表不能利用该种糖。
丙酮酸，可作为甲基红试验优势菌种。
2.4.4 蛋白质分解试验 蛋白质作为重要的能源
物质，其代谢是影响产品品质的重要因素。由试验可
知，Lab.1、Lab.4、Lab.5能分解蛋白质，可作为蛋白质
分解试验的优势乳酸菌。
2.4.5 吲哚试验 吲哚试验是通过含有色氨酸酶
的细菌来分解色氨酸生成吲哚。吲哚具有强烈的粪
臭味，会影响产品的感官品质，吲哚试验表明 5株
菌株吲哚试验均呈阴性，即不产生吲哚，均可作为
吲哚试验的优势菌株。
2.4.6 糖发酵试验 细菌对各种糖的分解能力及
代谢产物不同，糖类分解能力越强，则菌类代谢能
力越强，糖发酵试验结果见表 3。由表分析可知，通
过对表 3中 11种糖发酵试验，5 株菌株糖分解能
力均较强，其中菌株 Lab.4分解能力最强，其余 4
株菌株对糖类的利用能力稍弱。
3 结 论
通过对龙山大头菜传统发酵优势乳酸菌分离
初筛，选出 5株钙溶圈大、长势良好的菌株 Lab.1～
Lab.5。对这 5株菌株菌体形态、菌落特征进行初步
鉴定，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步确定它们
为乳酸菌，其中 Lab.1、Lab.2为乳球菌，Lab.3、Lab.4、
Lab.5为乳杆菌。进行乳酸纸层析定性鉴定试验，确
定均为乳酸菌菌株，通过进一步筛选，选出 2株产
酸能力较强、不产硫化氢、吲哚试验呈阴性、能利用
糖类、蛋白质的乳酸菌优势菌株 Lab.4、Lab.5。试验
为实现龙山大头菜产业化生产、改善产品品质提供
优良菌株，对改进龙山大头菜传统发酵工艺具有重
要的理论与现实意义。
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（责任编辑：卢红玲）
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