全 文 ：Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2014年第20期
低盐腌制大头菜腐败菌的分离与
初步鉴定
胡怀容1，张 庆1，2，鲜欣言1，唐 萍1，张友华1，蒋梦琳3，李明元1，2，*
（1.西华大学生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，四川成都 610039；
2.西华大学古法发酵（酿造）生物技术研究所，四川成都 610039；
3.宜宾戎陈坊食品有限公司，四川宜宾 644000）
摘 要：以低盐腌制大头菜为原料，对贮藏、流通期间主要腐败微生物进行分离鉴定。利用微生物学传统分离培养方
法从腐败的真空包装低盐腌制大头菜中分离得到菌落形态差异明显的7株细菌、2株酵母。对细菌菌株进行革兰氏染
色，同时提取细菌和酵母菌纯培养物基因组DNA，分别进行16S rDNA、26S rDNA的D1/D2序列PCR扩增。测序结果与
NCBI中已知序列进行比对和鉴定，发现5株为Bacillus属，1株为Lysinibacillus属，2株为Candida属，1株为非培养细菌的
同源菌。经系统发育分析，菌株X5和Lysinibacillus sphaericus的相似性为97%，其余菌株分别与Bacillus sp.，Bacillus
subtilis，Bacillus megaterium，Bacillus boroniphilus，Bacillus gibsonii，Uncultured bacterium，Candida pararugosa，Candida
zemplinina的相似性为99%~100%。通过微生物生理特性研究及腐败现象分析，推断芽孢杆菌和酵母可能是引起腌制
大头菜腐败变质的主要原因。
关键词：低盐，腌制，腐败微生物，分离鉴定
Isolation and identification of specific spoilage from
low-salinity pickled turnip
HU Huai-rong1，ZHANG Qing1，2，XIAN Xin-yan1，TANG Ping1，ZHANG You-hua1，
JIANG Meng-lin3，LI Ming-yuan1，2，*
（1.Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan，College of Bioengineering，Xihua University，
Chengdu 610039，China；
2.Biotechnology Institute of Ancient Brewing，Xihua University，Chengdu 610039，China；
3.Yibin Rong Chen Fang Food Co.，Ltd.，Yibin 644000，China）
Abstract：The spoilage organisms in low-salinity pickled turnip during storage or circulation period were isolated
and identified in this experiment. Seven bacteria strains and two yeasts obviously different in colony morphology
were screened out following the traditional microbial culture and separation ways. Gram stain was conducted
on bacterial strains，and DNA were extracted from the pure culture of bacterium and yeast. The 16S rDNA and
26S rDNA of D1/D2 sequence gene sequencing were amplified. PCR products were sequenced and the results
were identified and compared with the closest known sequences from NCBI，five bacteria were closed to Bacillus
genera，one bacteria was closed to Lysinibacillus genera，two bacterias were closed toCandida genera，one bacteria
was similar to a reported uncultured bacterium. By phylogenetic analysis，X5 share 97% similarity to Lysinibacillus
sphaericus. The other strains shared 99%~100% similarity to Bacillus sp.，Bacillus subtilis，Bacillus megaterium，
Bacillus boroniphilus，Lysinibacillus sphaericus，Bacillus gibsonii，Uncultured bacterium，Candida pararugosa，
Candida zemplinina. It was speculated that the presence of bacillus and candida might be the major reason for
spoilage of low-salinity pickled turnip through physiological，biochemical characteristic and analysis of corruption.
Key words：low-salinity；pickled turnip；spoilage bacteria；isolation and identification
中图分类号：TS255 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2014）20-0248-05
doi：10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.046
收稿日期：2014－01－15
作者简介：胡怀容（1988-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全与加
工保鲜技术。
* 通讯作者：李明元（1965-），男，硕士研究生，教授，研究方向：食品安
全与加工保鲜技术。
基金项目：教育部春晖计划（Z2011093）；四川省科技支撑项目（2011NZ0071）。
大头菜学名芥菜，十字花科二年生草本植物，是
中国著名的特产蔬菜。除高寒和干旱地区外，大头菜
在我国不存在分布边界，为全国各地栽培的常用蔬
菜，其富含VA、胡萝卜素，但由于其组织坚脆且具有
刺激舌头和鼻窦的芥辣味，不宜鲜食，常被制成腌制
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生 物 工 程
2014年第20期
Vol . 35 , No . 20 , 2014
表1 低盐腌制大头菜感官检查、酸度、糖及盐含量
Table 1 Sensory examination，acidity，the content of sugar and salt with Low-salinity Pickled Turnip
组别 pH 总酸（g/100g） 含盐量（g/100g） 感官检查
对照组 4.54~4.83 0.38~0.42 7.51~7.74 具有正常的外观色泽、滋气味
非胀袋组 3.18~3.44 1.98~2.32 7.03~7.31 色泽变暗、脆度降低
胀袋组 3.04~3.37 1.87~2.11 6.94~7.26 有白色物质生成且发粘，滋气味发生明显改变，发生胀袋现象
品。腌制大头菜作为我国传统的腌制加工蔬菜，名闻
全国，享有较大的声誉，深受广大消费者喜爱，是人
们日常生活的消费食品。
目前大头菜生产总体处于粗放作坊式加工状
态，以传统自然发酵工艺为主，生产技术相对较落
后，劳动密集型产业较多[1]。在传统工艺下，缺乏操作
规范，往往造成产品货架期短、腐败变质严重和质量
不统一。为满足人们低盐饮食的需求，大量厂家不惜
大量加入超过国家标准的防腐剂。袋装酱腌菜，尤其
是低盐的酱腌菜在贮、运、销过程中易被有害微生物
污染，发生腐败变质[2]。本实验针对3~5月份包装销售
的腌制大头菜易变质的现象，多次对不同生产批次
的真空包装腌制大头菜感官检测，发现两类情况：第
一类，腌制大头菜色泽变暗、脆度降低；第二类，腌制
大头菜表面有白色物质且发粘，滋气味发生明显改
变，发生胀袋。因此，本研究对上述两类腐败变质腌
制大头菜的微生物进行分离鉴定及系统发育分析，
确定腐败微生物的种类，以期为低盐腌制大头菜防
腐保藏技术研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
原材料 经高温灭菌真空包装后发生腐败变质
的腌制大头菜，宜宾戎陈坊食品有限公司；培养基 孟
加拉红培养基，营养琼脂培养基，酵母浸出粉胨葡萄
糖培养基，营养肉汤；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼
脂 北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂糖 购
自invitrogen；E.Z.N.ATM. Gel Extraction Ki t、E.Z.N.ATM.
Plasmid Mini KitⅠ 购自Omegabiotek；Premix TaqTM
购自TaKaRa Biotechnology（Dalian）Co.，Ltd.；pGM-
T Ligation Kit试剂盒（TIANGEN VT202-01） 购自
天根生化科技（北京）有限公司。
SGSP-02电热恒温隔水式培养箱 黄石市恒丰
医疗器械有限公司；SW-CJ-2F双人双面净化工作
台 苏州净化设备有限公司；LDZX-40AI立式自动
压力蒸汽灭菌锅 上海三申医疗核子仪器厂；电子
天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；Eppendorf
PCR扩增仪，PHS-3C酸度计 方舟科技。
1.2 实验方法
1.2.1 实验原材料检测项目
1.2.1.1 pH测定 用PHS-3C型酸度计测定产品pH，
参照GB10468-89。
1.2.1.2 总酸测定 采用酸碱滴定法测定产品中的
总酸度，参照GB/T12456-2008。
1.2.1.3 含盐量的测定 直接沉淀滴定法，参照GB/
T12457-2008。
1.2.1.4 对腐败变质的腌制大头菜感官检查 参照
SBT 10439-2007。
1.2.2 腐败微生物的分离和形态学鉴定[3-4] 在无菌
操作条件下，称取25g样品剪碎后加入到盛有225mL
无菌水三角瓶中，振荡混匀，再以无菌水进行梯度稀
释。取10-1~10-4稀释液于培养皿中，倒入灭菌且冷却
至45℃左右的孟加拉红、营养琼脂培养基，分别在
30、37℃恒温箱中培养。细菌培养14h和24h，酵母菌
培养48h。选择菌落数合适的平板，挑取单菌落反复
划线分离，纯化菌株，获得纯培养物。
1.2.3 腐败微生物基因组DNA的提取[5] 采用改进
的SDS-CTAB法提取基因组DNA。
1.2.4 16S rDNA、26S rDNA的D1/D2序列的PCR扩增
和产物纯化[6-7] 序列如下所示：
16S rDNA序列PCR反应引物：
EU27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
1490R：5′-GGTTACCT TGTTACGACTT-3′
反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃
2min，35个扩增循环；72℃ 10min。
26S rDNA的D1/D2序列的PCR反应引物：
NL1∶5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′
NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′
反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，52℃ 1min，72℃
2min，35个扩增循环；72℃ 10min。
PCR产物经质量分数为0.7%的琼脂糖电泳检测
后，回收PCR产物，-20℃保存备用。
1.2.5 测序及构建系统发育树 16S rDNA序列扩增
的产物电泳检测回收后，采用pGM-T Ligation Kit试
剂盒（TIANGEN VT202-01）与pGM-T载体克隆入
E.coli DH5α，挑选阳性克隆子，提取重组质粒。将重
组质粒和经电泳检测回收后的26S rDNA D1/D2序列
PCR扩增产物送成都博瑞克生物技术有限公司测
序，将得到的序列用GenBank中 BLAST进行相似序
列检索分析，用Clustal X 软件进行多序列比对，采用
MEGA 4.0软件的邻接法（Neighbor-joining）构建系统
发育树，分析真空包装腌制大头菜腐败微生物的分
类学地位。
2 结果与分析
2.1 实验原材料检测
以不发生腐败腌制大头菜为对照，对两类变质
腌制大头菜的检查统计结果见表1。
由表1可知，真空包装低盐腌制大头菜在流通贮
藏期间，发生腐败变质的腌制大头菜酸度、含盐量都
降低，产品外观色泽、滋气味发生改变。
2.2 腐败微生物的分离和形态学鉴定
以10-2的样品稀释液接种平板上计数和观察，细
菌在营养琼脂上培养14h和24h，酵母菌在孟加拉红
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Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2014年第20期
表2 第一类腐败变质低盐腌制大头菜中细菌特征
Table 2 The properties of bacteria in the first spoilage Low-salinity Pickled Turnip
编号 菌落数 菌落形态 产酸 产气 革兰氏染色
X1 44 菌落圆形，灰白色，表明光滑干燥，不透明 + - G+
X2 29 菌落圆形，微带黄色，表明粗糙，不透明 + - G+
X3 21 菌落圆形，灰白色，表明粗糙干燥，边缘整齐，不透明 + - G+
X4 13 菌落圆形，微带黄色，表明光滑干燥，半透明 - - G+
X5 11 菌落圆形，黄色，表明光滑湿润，边缘整齐，不透明 - - G+
X6 5 菌落圆形，黄色，表明光滑干燥，半透明 - - G+
X7 6 菌落圆形，无色，表明光滑湿润，边缘整齐，透明 - - G+
注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。
编号 菌落数 菌落形态 产酸 产气 革兰氏染色
X1 9 菌落圆形，灰白色，表明光滑干燥，不透明 + - G+
X2 7 菌落圆形，微带黄色，表明粗糙，不透明 + - G+
X3 4 菌落圆形，灰白色，表明粗糙干燥，边缘整齐，不透明 + - G+
Y1 94 菌落圆形，凸起，粉红色，表明湿润，边缘整齐 - + W
Y2 48 菌落圆形，凸起，红色，表明湿润，边缘整齐 - + W
表3 第二类腐败变质低盐腌制大头菜中细菌、酵母特征
Table 3 The properties of bacteria、yeast in the second spoilage Low-salinity Pickled Turnip
注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应；“W”表示无此实验。
图1 菌株的16S rDNA 电泳图谱
Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA
——2000
——1000
bpX7 X6 X5 X4 X3 X2 X1 M
培养基上培养48h。通过微生物学传统培养和划线
分离法从色泽变暗、脆度降低的第一类腐败变质腌
制大头菜中得到7种细菌，形态学鉴定结果见表2，其
中菌株6是在培养24h后分离得到，这可能是吉氏芽
孢杆菌适合碱性环境，在略偏酸的环境下，长势较
慢；在滋气味明显改变，发粘的第二类腐败变质腌制
大头菜中得到3种细菌，2种酵母，形态学鉴定结果见
表3。
2.3 16S rDNA、26S rDNA的D1/D2序列的PCR扩增
和产物纯化
用改进的SDS-CTAB法分别提取细菌X1、X2、
X3、X4、X5、X6、X7和酵母Y1、Y2共9株菌的基因组
DNA，以此为模板，用引物Eu27f和1490R PCR扩增
16S rDNA序列，用引物NL1和NL4 PCR扩增26S rDNA
的D1/D2序列。PCR产物经质量分数为0.7%的琼脂糖
电泳检测，7株细菌进行16S rDNA全长序列的PCR扩
增；2株酵母进行26S rDNA的D1/D2序列扩增后，都
得到了稳定且清晰的特异条带，片段分别大约1500bp
和600bp，结果如图1、图2所示。
2.4 系统发育分析
将测序结果经BLAST分析多重比对后，利用
MEGA4.0构建系统发育树，得到与测序菌株亲缘关
系最近的菌株，结果见图3、图4。Stackebrandt等[8]认为
当16S rRNA的序列同源性≥97%时可以认为是一个
属，序列同源性≥98%时则可以认为是一个种。从腐
败变质的真空包装腌制大头菜中分离得到7株细菌，
2株酵母，其中5株为Bacillus属，1株为Lysinibacillus
属，2株为Candida属，1株为非培养细菌的同源菌。由
图3可知，菌株X5和Lysinibacillus sphaericus相似性
为97%，其余菌株的相似性为99%~100%，菌株X1与
芽孢杆菌属的Bacillus sp.WPCB 165亲缘关系最近，
菌株X2与芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌 Bacillus
subtilis strain Y J001亲缘关系最近，菌株X3与芽孢
杆菌属的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium strain
PRE9亲缘关系最近，菌株X4与芽孢杆菌属的嗜硼芽
孢杆菌Bacillus boroniphilus strain CM25亲缘关系最
近，菌株X5与球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus
sphaericus亲缘关系最近，菌株X6与芽孢杆菌属的
图2 菌株的26S rDNA电泳图谱
Fig.2 PCR amplification of 26S rDNA
750——
bp M Y1 Y2
500——
250
生 物 工 程
2014年第20期
Vol . 35 , No . 20 , 2014
图6 第二类变质腌制大头菜微生物分布
Fig.6 The distribution of microorganism in the second spoilage
Low-salinity Pickled Turnip
70
60
50
40
30
20
10
0
Bac
illu
s sp
.
菌
株
百
分
含
量
（
%）
B.s
ubt
ilis
B.m
ega
teri
um
C.p
ara
rug
os
C.z
emp
lini
na
图5 第一类变质腌制大头菜微生物分布
Fig.5 The distribution of microorganism in the first spoilage
Low-salinity Pickled Turnip
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Bac
illu
s sp
.
菌
株
百
分
含
量
（
%）
B.s
ubt
ilis
B.m
ega
teri
um
B.b
oro
nip
hilu
s
L.sp
hae
ricu
s
B.g
ibso
nii
Unc
ultu
red
bac
teri
um
Bacillus gibsonii strain S-2亲缘关系最近，菌株X7与
Uncultured bacterium clone GZ84亲缘关系最近；由
图4可知，菌株Y1与念珠菌属的Candida pararugosa
strain UWFP-348亲缘关系最近，菌株Y2与念珠菌属
的Candida zemplinina strain CEC RMe-S-7亲缘关系
最近。
2.5 腐败微生物分析
对腐败变质腌制大头菜的两类情况进行微生物
分布分析，结果见图5、图6。由此可知，在色泽变暗、
脆度降低的第一类腐败变质腌制大头菜中，未分离
到酵母菌，主要是芽孢杆菌属，其中Bacillus sp.所占
比列达到34%；在滋气味明显改变，发粘的第二类腐
败变质腌制大头菜中，分离得到3株芽孢杆菌属细菌
和2株酵母，且2株酵母所占比列高达88%。
3 结论与讨论
本实验通过微生物学传统分离培养方法，从发
生腐败变质的腌制大头菜中，分离得到7株细菌菌
株，2株酵母菌株。提取菌株基因组DNA，PCR扩增
16S rDNA、26S rDNA D1/D2序列，16S rDNA序列PCR
扩增产物经连接转化反应，获得重组质粒。将测序结
果用GenBank中BLAST进行相似序列检索分析，构建
系统发育树，发现7株细菌以Bacillus属为主，2株酵母
都为Candida属。经革兰氏染色，7株细菌全为阳性，
其中菌株X1~X3产酸不产气，X4~X7不产酸不产气，
菌株Y1、Y2产气不产酸。
相关文献报道，蔬菜腌制品中的腐败微生物主
要是芽孢杆菌属和酵母菌，其中大多数为枯草芽孢
杆菌、巨大芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌 [9-11]。本次实验
中，分离得到的腐败微生物，与之前的报道相符，同
时也存在差异性。Lysinibacillus sphaericus在色泽变
暗、脆度降低的第一类腐败变质腌制大头菜中所占
比例为9%，是其中的次优势腐败微生物，在以往腌
菜制品的文献中未见报道，但刘海等曾在“花壳”干
辣椒中分离得到[12]；目前，关于腌菜制品中的腐败酵
母研究不多[9-10]，由酵母引起的再发酵现象，可通过
加热至60~70℃即可达到杀菌目的[13]，但酵母菌对食
盐的耐受力比细菌大得多，能耐受较低的pH[14]，本研
究在低盐腌制大头菜中分析发现了Candida pararugosa、
Candida zemplinina两株酵母，在滋气味明显改变，发
粘的第二类腐败变质腌制大头菜中占88%比例，为
优势菌株。Candida pararugosa曾在酸粥中分离得
Bacillus sp. MBEA40
Bacillus arsenicus strain NBM47
Bacillus gibsonii strain CCGE2037
Bacillus sp. 095003
Bacillus sp. R-6782
X1
Bacillus sp. WPCB165
Bacillus sp. 1068
Firmicutes bacterium K16
Bacillus sp. 1080
Bacillus megaterium strain PRE9
X3
X7
Uncultured bacterium clone GZ84
X4
Bacillus boroniphilus strain CM25
Uncultured bacterium
Bacillus sp. BF47
Bacillus sp. D1
Uncultured Bacillus sp. clone SGR170
Bacillus niacini
Bacillus niacini strain BIHB 356
X2
Bacillus subtilis strain YJ001
Bacillus gibsonii strain CCGE2038
Bacillus gibsonii strain S-2
X6
Bacillus sp. NER
Bacillus sp. K12-5
Bacillus clausii
Bacillus clausii strain S8-13
Bacillus clausii strain NSB10
Lysinibacillus sphaericus strain JAN-1
Lysinibacillus sp. 210_61
Lysinibacillus sphaericus strain DSM 28
Lysinibacillus sphaericus
X5
图3 细菌系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria
图4 酵母系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of yeast
Candida pararugosa strain NM 2b cla
Y1
Candida pararugosa strain VTT C-04522
Candida pararugosa strain UWFP-348
Fungal yeast sp. Urf2094
Candida cf. pararugosa EVN 1237
Candida sp. BG01-8-31-001A-2-1
Starmerella cf. bombicola UWOPS 00-227.2
Candida riodocensis
Candida bombi
Y2
Candida zemplinina strain CEC RMe-S-7
Candida floris strain UFMG Cor-151
Candida cellae
（下转第268页）
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Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2014年第20期
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到 [15]，Candida zemplinina是葡萄酒中常见的酿酒酵
母菌[16-21]。
低盐腌制大头菜营养丰富、水分活度较高，腐败
微生物极容易生长和繁殖，加上生产加工所用辅料
种类多、来源复杂，源头污染和二次污染难以控制。
如只采用传统的高温水浴法处理，部分耐热微生物
和产品因受热不均遗留的微生物仍然能残存，极容
易导致腌制大头菜发生微生物性腐败。在工厂化的
批量生产中，袋装量、高温灭菌温度与时间影响灭菌
效果，冯作山等[22]曾研究过，腌制大头菜高温灭菌温
度和时间受产品质量控制、受热不均可能是腌制大
头菜中有酵母残存的主要原因。本研究从腌制大头
菜分离得到的腐败微生物主要是芽孢菌和酵母，可
作为低盐腌制大头菜的防腐保鲜处理中的目标菌，
为下一步进行灭菌工艺和防腐剂的筛选结合应用研
究提供指导方向。
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