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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):181-186
收稿日期： 2015-10-27
基金项目：四川省教育厅理工科重点项目（14ZA0211）
作者简介：王川，男，博士，研究方向：资源微生物，生物反应器；E-mail ：watpc57944@163.com
内生菌是一种几乎存在于所有植物，且不引起
植物外在病害症状的微生物。已有的研究表明，一
些药用植物中的内生菌可产生与宿主相同或相似的
活性成分［1］，因此内生菌可能具有与植物大致相同
的代谢途径和相应的酶类，这就使内生菌成为了开
发药用植物功能基因的新资源。绿原酸是多种药用
植物中的活性成分，在绿原酸合成途径中，有两步
羟基化反应，分别是肉桂酸羟基化生成对香豆酸和
香豆酰奎尼酸羟基化生成绿原酸，由肉桂酰羟基化
酶（C4H）和香豆酰 3- 羟基化酶（C3H）催化，这
两种酶均属于植物细胞色素 P450 体系，是合成绿原
酸途径的限速酶［2］。细胞色素 P450 广泛存在于动
植物及细菌、真菌中，P450 催化的反应广泛而复杂，
包括羟化、环氧化、去烷基化、磺化等氧化反应和
产绿原酸内生菌细胞色素 P450 基因的克隆和功能研究
王川1  李丽1  魏丕伟1  黄非2
（1. 四川理工学院生物工程学院，自贡  643000 ；2. 四川大学生命科学学院，成都  610064）
摘 要 ： 以一株产绿原酸的内生枯草芽孢杆菌为基础，对其绿原酸途径的关键酶基因进行克隆和功能研究。克隆该内生菌
的细胞色素 P450 基因并进行原核表达，对重组蛋白进行肉桂酸羟基化酶（C4H）酶活测定。结果显示，从内生菌中克隆了 4 个细
胞色素 P450 酶系基因并进行了原核表达，其中 P-4 重组蛋白具有 C4H 活性，产生的香豆酸与 LC-MS 检测的结果一致，该酶的最
适温度范围较宽，产物香豆酸对该酶有抑制作用。该内生菌可能利用其细胞色素 P450 酶系作为 C4H 的同工酶从而将产物导入绿
原酸合成途径。
关键词 ： 绿原酸 ；细胞色素 P450 ；C4H ；表达 ；活性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.026
Cloning and Function of Gene for Cytochrome P450 from a Chlorogenic
Acid-producing Endophytic Bacterium
WANG Chuan1  LI Li1  WEI Pi-wei1  HUANG Fei2
（1. College of Bioengineering，Sichuan University of Science & Engineering，Zigong 643000 ；2. College of Life Sciences，Sichuan
University，Chengdu 610064）
Abstract:  Based on a chlorogenic acid-producing endophytic Bacillus subtilis，cloning and function of a key gene  in  the synthetic 
pathway of chlorogenic acid was studied. The cytochrome P450 gene of the endophyte was cloned and expressed in prokaryotic vector，and the 
cinnamate 4-hydroxylase（C4H）activity of the recombinant proteins were determined. Four cytochrome P450 genes were cloned and expressed 
in prokaryotic vector，and the recombinant protein P-4 presented C4H activity. The coumarate produced by the C4H activity was the same as 
the result measured by LC-MS. The activity of P-4 existed in a broad optimal temperature and was inhibited by product coumarate. It is supposed 
that，taking cytochrome P450 as isozyme of C4H，the endophyte led the product coumarate to the synthetic pathway of chlorogenic acid.
Key words:  chlorogenic acid ；cytochrome P450 ；C4H ；expression ；activity
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异构化、脱水等还原反应，在植物的次生代谢物的
合成方面有非常重要的功能［3-5］。
目前对植物 P450 的研究较多，而对原核生物
P450 的研究还处在起步阶段，报道较少，本研究以
一株分离自金银花的产绿原酸的内生枯草芽孢杆菌
为基础，从该内生菌中克隆出细胞色素 P450 的几种
同工酶基因，并进行基因的表达和功能研究，旨在
了解该内生菌的绿原酸代谢途径特点，为该内生菌
的进一步利用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  材料  内生枯草芽孢杆菌 RP1（GenBank 登
录号：KF053071）由本实验室分离并保存，大肠杆
菌 BL21（DE3）、pET28a 质粒、E. coli JM109  化学
感受态细胞。
1.1.2  试剂  胶回收试剂盒，Omega ；内切酶 Nhe I、
Sac I，T4 连接酶，Fermentas ；pMD19-T vector，EX 
Taq 及 PCR 试剂，TaKaRa ；IPTG，Amresco ；Taq 酶
及试剂、BCA蛋白定量试剂盒、质粒小量提取试剂盒，
Tiangen ；Ni-His 亲和层析柱，Merk ；引物由上海英
潍捷基公司（invitrogen）合成。
TEGN缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0），5 
mmol/L EDTA（pH8.0），5%  甘油，50 mmol/LNaCl。
Binding buffer ：0.5 mol/L NaCl，200 mmol/L Tris-HCl，
5 mmol/L 咪唑 pH 7.9。Wash buffer ：0.5 mol/L NaCl，
200 mmol/L Tris-HCl，60 mmol/L 咪唑 pH 7.9。Elute 
buffer ：0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1mol/L 
咪唑 pH7.9。
1.1.3  仪器  PCR 仪，电泳仪（Biorad）。
1.2  方法
1.2.1  内生菌 P450 基因的克隆  内生菌枯草芽孢杆
菌RP1基因组DNA提取采用DNA提取试剂盒提取。
由于在枯草芽孢杆菌中没有 C3H 和 C4H 的同名或
同源基因的报道，因此通过比对几种植物中 C3H和
C4H 的活性中心保守片段，确定了枯草芽孢杆菌的
4 个功能近似的单氧化酶基因，在此基础上设计引
物如表 1。
PCR 反应条件如下：94℃ 变性 5 min；94℃ 30 s，
56℃ 30 s，72℃ 2 min，5 个循环；94℃ 30 s，53℃ 30 s，
72℃ 2 min，5 个循环；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 
2 min，20 个循环；72℃ 10 min ；16℃保温。扩增产
物经琼脂糖凝胶电泳检测后以胶回收试剂盒回收。
回收片段连接 pMD19-T 载体，连接产物转化 E. coli
JM109 感受态细胞，以菌落 PCR 筛选，阳性子送上
海华津生物公司测序。
1.2.2  P450 基因原核表达载体的构建  测序正确的
阳性子以质粒提取试剂盒提取质粒，将质粒与载体
pET28a 分别以 Nhe I 和 Sac I 双酶切过夜，酶切产物
以 T4 连接酶连接后转化 E. coli JM109 感受态细胞，
以菌落 PCR 筛选阳性子并进行双酶切验证，构建 4
个 P450-pET28a 原核表达载体。
1.2.3  P450 基因的表达和纯化  提取阳性子质粒
转化 E. coli BL21（DE3）细胞，转化子接种于 LB
液体培养基，30℃培养至 OD600 ≈ 0.4-0.6，以 250 
μmol/L IPTG 诱导并在 18℃培养 12 h，菌液经 TEGN
缓冲液重悬后以溶菌酶破碎 30 min，取上清进行
SDS- PAGE 电泳检测重组蛋白表达情况。重组蛋白
以镍亲和层析柱进行纯化，依次以 Binding buffer，
Wash buffer 和 Elute buffer 洗脱，纯化蛋白经 SDS-
PAGE 检测后以 20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）加 5%
甘油透析过夜，以 BCA蛋白定量试剂盒测定含量。
1.2.4  P450 重组蛋白的酶学性质  对纯化的 4 个
P450 重组蛋白进行 C4H 活性测定，C4H 活性测
定按文献［4］进行略有改动，测定肉桂酸羟基化后
NAPDH 在 340 nm 下的吸光值变化，2 mL 反应体系
表 1 引物序列
名称 序列（5-3）
引物 1 Sense GCTAGCATGAATGAGCAGATTCCACATGACA
Anti-sense GAGCTCTTAACTTTTCCGTCTGATTCCGCTC- 
ATCACA
引物 2 Sense GCTAGCATGAATGTGTTAAACCGCCGGCAA- 
GCCTTG
Anti-sense GAGCTCTTAAATTTTCACACGGAAGCTCTTT- 
AATC
引物 3 Sense GCTAGCATGAATCAATCCATTAAATTGTTTAG
Anti-sense GAGCTCTTATGCCCCGTCAAACGCAACGTG- 
AAGTGA
引物 4 Sense GCTAGCATGAATGTGTTAAACCGCCGGCAA- 
GCCTTGCAG
Anti-sense GAGCTCTTACATTTTCACACGGAAGCTCTTT
2016,32(6) 183王川等：产绿原酸内生菌细胞色素 P450 基因的克隆和功能研究
如下：50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），20 μmol/L 肉桂
酸，20 μmol/L NADPH，5 μL 纯化蛋白，以 10 μL 水
为空白对照，加入酶后立即测定 OD340 值，30℃反
应 30 min 后测定 OD340 值。将在该测定条件下每分
钟催化反应消耗 1 μmol NADPH 所需要的酶量定义
为 1个酶活性单位。
米氏常数的确定：设置不同肉桂酸浓度（2、5、
10、20、25、35 和 50 μmol/L）下反应测定 OD340 变 
化，以双倒数作图法确定酶促反应的 Km 值和 Vmax。
酶促反应的影响因素：上述反应体系分别置于
不同温度、不同 pH，以及加入不同体积的纯化蛋白
或不同浓度的香豆酸，测定相应酶活力，确定酶促
反应的最适温度、最适 pH，以及酶浓度和产物浓度
对酶促反应的影响。
2 结果
2.1  内生菌RP1的P450基因的克隆
从内生枯草芽孢杆菌 RP1 中提取基因组，以该
基因组 DAN 为模板，以引物 1，2，3，4 通过 PCR
扩增获得了内生枯草芽孢杆菌 RP1 的 4 个相应的目
标基因（图 1），分别为 P-1，P-2，P-3 和 P-4。测序
结果表明 4 个目标基因大小分别为 1 294 bp（P-1），
1 109 bp（P-2），1 217 bp（P-3）和 1 190 bp（P-4），
符合预期片段大小。GenBank 比对结果显示，4 个
目标基因均属于细胞色素 P450 家族。其中 P-1 与
Bacillus subtilis 的细胞色素 P450（Cytochrome P450）
有 99%相似性。P-2 基因与 Bacillus subtilis 的细胞色
素 P450 YjiB（Cytochrome P450 YjiB）有 99% 相似
性。P-3 基因与 Bacillus subtilis 的细胞色素单氧化酶
（monooxygenase）有 99% 相似性，P-4 基因 Bacillus
subtilis 的 细 胞 色 素 P450 YjiB（Cytochrome P450 
YjiB）有 98% 相似性，这表明目标基因克隆成功，
以上 4 个基因的 GenBank 登录号分别为 KC561925，
KC561926，KC561927，KC561928。
2.2  内生菌P450同工酶基因的原核表达和纯化
将各 P450 同工基因片段和表达载体 pET28a 构
建成重组表达载体，经 Nhe Ⅰ和 Sac Ⅰ双酶切验证，
得到分别与载体 pET28a 和各基因片段大小相符的两
条带（图 2），表明各 P450 同工基因的重组表达载
体构造成功。
bp
2000
1000
M P-1 P-2 P-3 P-4
M：DNA marker ；P-1，P-2，P-3，P-4 ：引物 1、2、3、4 的扩增产物
图 1 内生菌细胞色素 P450 基因克隆
bp
2000
1000
M P-1 P-2 P-3 P-4
M：DNA marker ；P-1，P-2，P-3，P-4 ：4 种克隆基因的酶切产物
图 2 重组质粒 pET28a-P450 酶切鉴定
将连接成功的表达载体转化大肠杆菌 BL21，经
IPTG 诱导后，以 SDS-PAGE 电泳检测，结果（图 3）
显示，在诱导条件下，4个 P450 同工基因的表达载
体均获得了符合预期分子量大小的重组蛋白，而对
应的非诱导条件和 pET28a/BL21 空白裂解液，均未
出现目的重组蛋白，这表明重组蛋白表达成功，4
种 P450 同工酶蛋白均可进行可溶性表达。进一步对
4种同工蛋白进行镍亲和层析纯化，结果（图 4）显
示纯化成功，对 4种重组蛋白经 BCA 蛋白定量分别
为 342 μg/mL（P-1）、403 μg/mL（P-2），331 μg/mL
（P-3），375 μg/mL（P-4），纯化的蛋白用于酶活 
测定。
2.3  P450重组蛋白的酶学性质
对 4 种 P450 重组蛋白的酶活性测定结果表明，
反应体系中加入 P-1、P-2 和 P-3 三种重组蛋白后的
OD340 没有变化，因而没有 C4H 活性。而 P-4 重组
蛋白显示出了 C4H 活性，其 Km 值和 Vmax 分别为 5.6 
μmol/L 和 2.08 μmol/min，为米氏酶。P-4 重组蛋白酶
的最适合温度的范围比较广，在 25-40℃之间（图 5），
最适 pH为 7.5，耐受酸碱的能力较弱（图 6）。酶促
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反应随酶浓度先增加后降低，在酶浓度达到一定程
度后，反应速度趋于稳定（图 7）。反应产物对香豆
酸对酶促反应有反馈抑制作用，在对香豆酸低浓度
时抑制作用较弱，产物达到一定浓度（100 μmol/L）
能大大降低酶活力（图 8）。P-4 蛋白序列经比对为
属于枯草芽孢杆菌细胞色素 P450 家族，与枯草芽
孢杆菌的 P450YjiB 有 98% 相似性，以上活性测定
结果表明内生枯草芽孢杆菌 RP1 可能通过属于 P450
酶系的 P-4 蛋白的 C4H 活性进行绿原酸合成途径的
肉桂酸羟基化反应，P-4 基因可能是植物的 C4H 基
因的同工酶基因。
3 讨论
在植物中，绿原酸主要由苯丙氨酸通过苯丙烷
途径产生，其中苯丙烷途径的两步羟基化反应分别
由属于植物细胞色素 P450 体系的肉桂酰羟基化酶
（C4H）和香豆酰 3- 羟基化酶（C3H）催化，这两
种酶具有功能上的相关性，是苯丙烷途径合成绿原
酸的限速酶，目前对细胞色素 P450 的研究多集中
在对植物来源的 P450 的克隆和表达，而对细菌来源
的 P450 的研究较为缺乏。本研究以一株分离自金银
kD
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
N-P-1 I-P-1 N-P-2 I-P-2 N-P-3 I-P-3 N-P-4 I-P-4 N M
M：蛋白分子量标准；N：BL21/ pET28a 空载体对照；N-P-1，N-P-2，N-P-3，
N-P-4 ：P-1，P-2，P-3，P-4 四种重组蛋白的非诱导表达；I-P-1，I-P-2，I-P-
3，I-P-4 ：P-1，P-2，P-3，P-4 四种重组蛋白的诱导表达
图 3 四种重组蛋白不同条件的表达
kD
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
I-P-1 P-P-2 I-P-2 P-P-3 I-P-3 P-P-4 I-P-4 P-P-4M
M：蛋白分子量标准；P-P-1，P-P-2，P-P-3，P-P-4 ：P-1，P-2，P-3，P-4 重
组蛋白的纯化产物；I-P-1，I-P-2，I-P-3，I-P-4 ：P-1，P-2，P-3，P-4 重组
蛋白的诱导表达产物
图 4 重组蛋白 P450 的纯化
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
⴨ሩ䞦⍫% ⑙ᓖć20 30 40 50 55 60453525
图 5 重组蛋白 P-4 的最适温度
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
⴨ሩ䞦⍫%
6.5 7.5 8.5 9.5 1098765 5.5
pH
图 6 重组蛋白 P-4 的最适 pH
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
⴨ሩ䞦⍫%
20 30 40 50 55453525100 5 15 䞦փ〟μL
图 7 酶浓度对重组蛋白 P-4 活性的影响
2016,32(6) 185王川等：产绿原酸内生菌细胞色素 P450 基因的克隆和功能研究
花的产绿原酸的内生枯草芽孢杆菌 RP1 为对象，通
过以枯草芽孢杆菌上的 4 个单氧化酶基因为基础设
计引物，克隆的 4 个基因均属于枯草芽孢杆菌细胞
色素 P450 家族，对 4个基因的原核表达产物也符合
预期蛋白大小。其中重组蛋白 P-4 具有肉桂酸 4- 羟
基化酶（C4H）的活性，该酶的最适温度范围较宽，
从 25℃到 40℃的活力都维持在较高的水平，这个结
果与已报道的一些植物的C4H的性质相似［6，7］。同时，
通过添加不同浓度的酶和产物香豆酸，表明重组蛋
白 P-4 的 C4H 活性能够被产物反馈抑制，这个结果
也与多数报道中的植物 C4H 相一致［7，8］。在一些
植物中，苯丙烷途径的苯丙氨酸解氨酶（PAL）和
C4H 共同构成一个调控复合体，在植物遇到环境胁
迫时能被诱导协同表达，在这个调控系统中，香豆
酸也是催化第一步反应的苯丙氨酸解氨酶的抑制剂，
因此苯丙烷途径受 PAL，C4H 活性的双重调控［9-11］。
由于 C4H 产生的香豆酸可以进入各分支途径，产生
各种活性物质，因此内生菌采用与植物相似的策略，
通过产物浓度对苯丙烷途径前两步酶的调控，能更
好的分配碳流，以应对环境的胁迫。
原核生物的 P450 是一个多功能酶系，能够催
化羟化、氧化、脱水等多种反应，该内生枯草芽孢
杆菌正是以 P450 酶系的 P-4 作为 C4H 的同工酶，
通过其 C4H 活性进行苯丙烷途径的肉桂酸羟基化
反应产生香豆酸，最终产生绿原酸，这符合在 RP1
发酵液中检测到的肉桂酸和香豆酸的结果。但另外
的 3 个 P450 酶是否具有 C3H 活性，需要进一步实
验进行验证。本课题组在以往的研究中，已确定了
该内生菌通过组氨酸解氨基酶（HAL）双功能活性
中的苯丙氨酸解氨基酶活性来使产物进入苯丙烷途
径［12］，本研究结果则证实，内生菌进一步利用细胞
色素 P450 家族的酶作为同工酶进行绿原酸合成的
C4H反应。
从以上研究结果来看，从产绿原酸的内生枯草
芽孢杆菌中克隆得到的两个基因都具有绿原酸合成
途径的关键酶（PAL 和 C4H）基因活性，产生的相
应催化产物（肉桂酸和香豆酸）也与对内生菌发酵
液的 LC-MS 检测结果一致，这说明该内生菌的绿原
酸合成途径可能与植物的相似。内生菌基因组远比
植物小，相比植物庞大的基因组以及大量的备用基
因资源，内生菌可供利用的资源极其有限，利用同
工酶和多功能酶的形式，内生菌就可以在专用酶分
化较少的情况下，合成一些次生代谢产物以应对环
境变化的胁迫。这可能是由于和植物长期共生的内
生菌通过基因水平的传递，从植物中获取了相应的
基因功能片段［13，14］，是内生菌长期和植物共生进化
而来的策略。
4 结论
通过对一株产绿原酸的内生枯草芽孢杆菌的
P450 基因的克隆和功能研究，表明该内生菌能利用
其细胞色素 P450 酶系作为 C4H 的同工酶从而形成
绿原酸合成的前导物——对香豆酸。
这种方式是内生菌扩大基因功能的一种策略，
同时也表明该内生菌可能具有和植物相似的绿原酸
合成途径。
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100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
⴨ሩ䞦⍫%
0 20 40 60 80 100俉䉶䞨⎃ᓖμmol·L-1120 140 160 180 200
图 8 产物香豆酸浓度对重组蛋白 P-4 活性的影响
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（责任编辑  李楠）