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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
节瓜（Benincasa hispida Cogn. var. chieh-qua How）
又名毛瓜，是华南地区重要特色蔬菜，主要分布在
广东、广西、海南等地，类型品种丰富，在不断地
传播演变过程中，农艺性状逐渐变异，形成了许多
地方性品种。因此开展节瓜种质资源分类鉴定与遗
传多样性分析，对于种质指纹鉴别、育种亲本选择
及系统发育进化研究具有重要意义。我国对节瓜种
质资源研究甚少，基于分子水平的遗传多样性研究
收稿日期 ：2014-01-23
基金项目 ： 广州市珠江科技新星项目（2013086），广东省自然科学博士启动基金项目（10451064001006063），国家自然科学青年基金
（31311643）
作者简介 ：赵芹，博士，副研究员，研究方向 ：蔬菜遗传育种与分子生物学 ；E-mail ：zhaoqin0802@126.com
节瓜 ISSR-PCR 反应体系的建立与正交优化
赵芹 谢大森 罗少波 彭庆务 李明珠 李海达
（广东省农业科学院蔬菜研究所，广州 510640）
摘 要 ： 旨在开展节瓜种质资源分类鉴定与遗传多样性研究。通过正交试验设计与单因素分析相结合的方法，对节瓜
ISSR-PCR 反应体系 5 个因素（模板 DNA 浓度、dNTP 浓度、Mg2+ 浓度、引物浓度与 Taq 聚合酶浓度）在 4 个水平上进行优化分
析，建立了节瓜稳定可靠且具丰富多态性的最佳反应体系，进而对引物退火温度进行梯度试验分析。结果表明，20 μL 节瓜 ISSR-
PCR 最佳反应体系为 70 ng 模板 DNA、0.2 mmol/L dNTP、1.2 mmol/L Mg2+ 浓度、0.96 μmol/L 引物、0.8 U Taq DNA 聚合酶和 2.0 μL
10×buffer ；引物 IS807 最佳退火温度为 53℃。以此为基础，利用 4 条引物对 4 份节瓜种质进行最佳反应体系稳定性验证，证明该
体系稳定可靠、扩增谱带清晰、多态性丰富且重复性较好。
关键词 ： 节瓜 ISSR-PCR 正交优化 梯度 PCR 退火温度
Establishment and Optimization of an ISSR-PCR Reaction System for
Chieh-qua Using Othogonal Design
Zhao Qin Xie Dasen Luo Shaobo Peng Qingwu Li Mingzhu Li Haida
（Vegetable Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640）
Abstract: It was to identify and classify chieh-qua germplasm resources. The main factors affected ISSR reaction was tested to optimize
ISSR amplification system. In this research, the orthogonal design and single-factor gradient method were used to establish and screen chieh-qua
ISSR-PCR system for 4 levels of 5 factors（DNA template, dNTPs, Mg2+ concentration, primer, and Taq DNA polymerase）respectively, and then
annealing temperatures were proposed by gradient PCR based on the optimal reaction system established. The results showed that the optimal
ISSR-PCR system mixture（20 μL）including 70 ng template DNA, 0.2 mmol/L dNTPs, 1.2 mmol/L Mg2+ concentration, 0.96 μmol/L primer, 0.8
U Taq DNA polymerase and 2.0 μL 10×buffer. The suitable annealing temperature of primer IS807 was 53℃. Four primers were applied to four
chieh-qua materials for testing and verifying stability of the established reaction system, which showed that the ISSR reaction system was proved
to be stable, credible and of clear bands and rich polymorphism.
Key words: Chieh-qua ISSR-PCR Orthogonal optimization Gradient PCR Annealing temperature
鲜有报道。李文嘉等［1］对 27 份节瓜种质的成熟期、
丰产性、瓜形、抗病性和单瓜重等农艺性状进行了
分析，宋世威等［2］利用 RAPD 技术分析了 15 份节
瓜材料遗传多样性，但由于节瓜种质同名异物或同
物异名现象非常普遍，研究材料类型与数量不足，
代表面较窄，多以栽培种为种代表，研究结论具有
一定局限性。
ISSR（Inter-simple sequence repeat） 是 1994 年
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期90
Zietkiewicz 等［3］基于 SSR（simple sequence repeat）创
建的一种新型微卫星类分子标记技术，其基本原理
是在 SSR 的 3 或 5 端加锚 1-4 个随机碱基作为引物，
扩增两个相近且方向相反的 SSR 序列之间的一段
DNA 序列［4］。作为显性标记，结合了 SSR 和 RAPD
的优点，操作简单与灵敏度高，成本低廉，稳定性
和多态性高，重复性好［5，6］，在蔬菜遗传学如系统
发育进化、遗传结构分析、种质资源鉴定、遗传图
谱构建以及分子标记辅助育种等方面广泛应用［7-13］，
但在节瓜上的研究应用尚未见报道。ISSR 易受不同
物种及反应体系与反应程序的多种因素干扰，因此
需对最佳反应条件进行探索，获得重现性高与稳定
可靠结果，建立合适 ISSR-PCR 反应体系。鉴于正
交试验设计具有均衡分散、综合可比、伸缩性强、
效应明确及内在规律强等特性，可最快找到最优水
平组合［14］，而单因素试验可分析不同浓度梯度的单
一影响因子对 ISSR 反应的影响，找出最佳浓度，可
对正交优化组合进一步微调。为更好对节瓜种质资
源进行收集保存与分类鉴定，本研究利用正交试验
与单因素设计相结合的方法，从影响 ISSR 反应体系
的 5 种因素 4 个水平进行优化分析，以此为基础，
对引物退火温度进行梯度检测分析，建立节瓜 ISSR-
PCR 最佳反应体系，旨在为后续节瓜种质资源的科
学利用和分子标记辅助育种提供可靠的技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供 试 材 料 供 试 材 料 为 节 瓜 种 质 12-2-3、
A125-2、H6-2、A95-1、T-1，为广东省农业科学院
蔬菜研究所保存。试验材料于 2012 年 9 月在温室内
播种，待幼苗长至 2-3 片真叶，采集叶片保存于 -70℃
冰箱备用。
1.1.2 仪器与试剂
1.1.2.1 主要仪器 纳米紫外可见分光光度计（Nan-
oDrop 2000 spectrophotometer）、PCR 仪（ABI Veriti
96 well thermal cycler）、GeneGeniusBio Imaging System
凝胶成像系统（Bio-Rad 公司）、Eppendorf centirfuge
5417R 台式高速离心机（Eppendorf 公司）。
1.1.2.2 主要试剂 ISSR 引物序列由广州英骏生物
技术公司合成，经过引物初步筛选试验，确定 IS807
（5-AGAGAGAGAGAGAGAGT-3）为本试验固定引
物，其它 4 条引物 IS835（5-AGAGAGAGAGAGAG-
AGYC-3）、IS826（5-ACACACACACACACACC-3）、
IS808（5-AGAGAGAGAGAGAGAGC-3）、IS889
（5-DBDACACACACACACAC-3）为验证引物 ；Taq
DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker 均购自广州鼎国
生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 节瓜基因组 DNA 提取及质量检测 取冷冻
保存节瓜叶片 0.1 g 左右，改良 CTAB 法［15］提取总
DNA，溶于少量灭菌双蒸水中。1% 琼脂糖凝胶电泳
分析与纳米紫外分光光度计检测 DNA 浓度与纯度，
并将浓度稀释至 30 ng/μL，-20℃保存备用。
1.2.2 原初扩增体系与扩增程序 以 IS807 为体系
优化引物，12-2-3 材料的基因组 DNA 为模板。原初
反应体系为 20 μL 反应体积，包括 10×PCR buffer
（不含 Mg2+）、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物
与模板 DNA。原初扩增程序为 ：94℃预变性 4 min ；
94℃变性 30 s，50℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，共
40 个循环 ；72℃延伸 7 min，4℃保存。所有反应体
系在 ABI 梯度 PCR 仪中进行，扩增产物利用 1.5%
琼脂糖凝胶中电泳分析，凝胶成像系统拍照保存。
1.2.3 PCR 正交试验设计与单因素处理 针对影响
ISSR-PCR 的 5 个主要因素（模板 DNA 浓度、dNTP
浓度、Mg2+ 浓度、引物与 Taq DNA 聚合酶），采用
L16（4
5）正交试验设计［16］，进行 4 个水平的筛选分
析，共计 16 个处理，每个处理设置 2 次重复。各反
应成分的因素水平及正交试验见表 1。
单因素试验是以正交试验结果初步选出最佳体
系为基础，在其他因子保持不变的情况下，对 5 种
因子设置 8 个递变梯度（表 2），每个处理 2 次重复，
分析不同浓度对节瓜 ISSR-PCR 反应影响，筛选出
最佳扩增条件，对正交试验最佳体系调整，建立适
合节瓜的最佳 ISSR-PCR 反应体系。
参照何正文等［17］的方法，通过直观分析，根
据谱带的明暗和杂带的多少对 PCR 扩增结果进行打
分。采用新复极差法（SSR 法），对 16 个处理的条
带亮度和数量进行人工计算分析，分析各单因子对
体系扩增的影响程度。
2014年第9期 91赵芹等：节瓜 ISSR-PCR 反应体系的建立与正交优化
表 2 节瓜 ISSR-PCR 反应单因素梯度浓度
试验因子 浓度梯度
模板 DNA（ng/μL） 10 30 50 70 90 120 150 180
dNTPs 浓度（mmol/L） 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 0.24 0.28 0.32
Mg2+ 浓度（mmol/L） 0.20 0.40 0.60 0.80 1.20 1.60 2.00 2.40
引物浓度（μmol/L） 0.08 0.24 0.40 0.64 0.80 0.96 1.20 1.60
Taq DNA 聚合酶（U） 0.24 0.40 0.64 0.80 0.96 1.20 1.44 1.60
1.2.4 最佳退火温度的确定 在确定的最佳反应体
系基础之上，对退火温度进行梯度试验优化筛选最
佳退火温度。在 PCR 梯度扩增仪上 48-59℃之间设
置 12 个退火温度梯度（梯度差为 1℃），每个梯度
设 2 次重复，其它反应程序和体系组合均与正交试
验确定的最佳反应体系相同。
1.2.5 ISSR-PCR 反应体系的稳定性检测 选择另外
4 条引物 IS835、IS826、IS808 和 IS889 扩增 4 个节
瓜样品 DNA（A125-2、H6-2、A95-1 和 T-1），对优
化确定 ISSR-PCR 反应体系稳定性进行检测，每个
引物 2 次重复。
2 结果
2.1 ISSR-PCR反应体系的正交优化
正交组合的 ISSR-PCR 体系扩增结果（图 1）显
示，16 个处理在扩增出的谱带特异性及多态性、亮
度和清晰度均存在明显差别，说明不同处理间，
DNA 模 板、dNTP、Mg2+、 引 物 和 Taq DNA 聚 合 酶
浓度的不同对扩增结果存在很大影响，对节瓜 ISSR-
PCR 反应体系的筛选优化是十分必要的。综合分析
发现，组合 1、2、3、4、5、6、9、10、11 与 13 中，
主带不明显且多态性低 ；组合 14 与 15 条带微弱且
背景模糊 ；组合 7、8 与 16 主带较清晰但多态性略
低 ；组合 12 条带多态性最高，条带之间界限较为分
明，条带强度也较高。
在正交试验结果分析中，把电泳结果的条带数
表 1 节瓜 ISSR-PCR 反应因素 L16（45）正交试验设计
编号 模板 DNA（ng/μL）（A） dNTPs（mmol/L）（B） Mg2+（mmol/L）（C） 引物（D）（μmol/L） Taq DNA 聚合酶（U）（E）
1 30 0.08 0.4 0.24 0.4
2 60 0.12 0.4 0.48 0.8
3 90 0.16 0.4 0.72 1.2
4 120 0.20 0.4 0.96 1.6
5 120 0.08 0.8 0.72 0.8
6 90 0.12 0.8 0.96 0.4
7 60 0.16 0.8 0.24 1.6
8 30 0.20 0.8 0.48 1.2
9 60 0.08 1.2 0.24 1.2
10 30 0.12 1.2 0.72 1.6
11 120 0.16 1.2 0.48 0.4
12 90 0.20 1.2 0.96 0.8
13 90 0.08 1.6 0.48 1.6
14 120 0.12 1.6 0.24 1.2
15 30 0.16 1.6 0.96 0.8
16 60 0.20 1.6 0.72 0.4
䟽༽1M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16䟽༽2M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
M ：DL2000 DNA Marker ；1-16 ：不同正交处理
图 1 节瓜 ISSR-PCR 正交设计处理结果（引物为 IS807）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期92
量最多、清晰度高和背景低的最佳组合记为 16 分，
最差记为 1 分。分数统计结果（表 3）显示，不同
处理的条带数和总得分均不同。将 16 个处理 2 次重
表 3 节瓜 ISSR 正交优化组合扩增结果
序号 组合
条带数
总赋值（平均值）
明亮 亮 暗
1 A1B1C1D1E1 0 0 1 1，1（1）
2 A2B2C1D2E2 1 1 0 8，5（6.5）
3 A3B3C1D3E3 0 2 0 7，8（7.5）
4 A4B4C1D4E4 2 2 0 13，12（12.5）
5 A4B1C2D3E2 2 0 0 10，10（10）
6 A3B2C2D4E1 1 0 0 2，2（2）
7 A2B3C2D1E4 2 0 2 12，11（11.5）
8 A1B4C2D2E3 2 1 3 15，15（15）
9 A2B1C3D1E3 0 1 3 3，3（3）
10 A1B2C3D3E4 1 0 1 4，4（4）
11 A4B3C3D2E1 1 0 1 5，7（6）
12 A3B4C3D4E2 3 2 1 16，16（16）
13 A3B1C4D2E4 1 0 2 6，6（6）
14 A4B2C4D1E3 2 0 2 11，13（12）
15 A1B3C4D4E2 1 0 3 9，9（9）
16 A2B4C4D3E1 2 3 1 14，14（14）
复的分数用 SPSS13.0 软件进行极差分析，分析结果
见表 4。16 个反应体系中，组合 12 分数最高且明亮
带和亮带最多。
通过新复极差法分析了 5 个主要影响因子对体
系扩增的影响程度，极差越大说明该因素对体系扩
增的影响越大。由表 4 可知，各因子影响程度顺序
为 dNTP（B）>Taq 酶（E）>Mg2+（C）> 引 物（D）
>DNA 模板（A）。
综上所述，组合 12 扩增条带最为理想，为正
交试验的最佳组合，即在 20 μL 体系中含 Mg2+ 1.2
mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、Taq 酶 0.8 U、引物 0.96
μmol/L、DNA 模 板 90 ng、10×Buffer 2.0 μL。 后 续
的单因素优化筛选试验以该组合为基础进一步微调
优化。
2.2 模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增浓度的影响
以正交试验结果组合 12 为基础，对模板 DNA
浓度进行梯度筛选。由图 2 可知，模板 DNA 浓度
不同，扩增结果也存在一定差异。模板 DNA 浓度
在 10-180 ng/μL 范围内，均能扩增出条带，低于 30
ng/μL 时，扩增产物少，多态性较低，信号较弱 ；70
ng/μL 时则能得到比较清晰一致的扩增产物，多态性
高且较稳定 ；在 90-180 ng/μL 范围内虽有扩增条带，
但随着模板 DNA 浓度增加主条带多态性降低，非特
异条带增多，背景弥散模糊。因此节瓜 ISSR 研究中，
20 μL 反应体系最佳模板 DNA 浓度为 70 ng/μL。
表 4 节瓜 ISS-PCR 正交优化试验极差分析结果
水平
A B C D E
总分 平均分 总分 平均分 总分 平均分 总分 平均分 总分 平均分
1 29.0 7.25 20 5.0 27.5 6.875 27.5 6.875 23.0 5.75
2 35.0 8.75 24.5 6.125 38.5 9.75 33.5 8.375 41.5 10.375
3 31.5 7.875 24.0 6.0 29.0 7.25 35.5 8.875 37.5 9.375
4 40.5 8.125 57.5 14.375 41.0 10.25 39.5 9.875 34.0 8.50
极差 11.5 1.5 37.5 9.375 13.5 3.375 12.0 3.0 18.5 4.625
2014年第9期 93赵芹等：节瓜 ISSR-PCR 反应体系的建立与正交优化
2.3 dNTP浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响
dNTP 为 ISSR-PCR 反 应 原 料， 浓 度 过 高 导 致
DNA 合成错配增高，浓度较低则扩增条带少且弱，
甚至会因 dNTP 过早消耗使产物单链化。图 3 显示，
dNTP 浓度在 0.04-0.32 mmol/L 范围内，均能扩增出
条带，但在低于 0.12 mmol/L 时，PCR 产率很低，条
带很弱 ；在 0.16-0.20 mmol/L 范围内，条带逐渐明
亮、多态性增高、分辨率增强 ；超过 0.24 mmol/L
虽然条带清晰明亮，但非特异性扩增出现且较浪费
dNTP 原料，因此确定节瓜 ISSR-PCR 扩增反应中适
宜 dNTP 浓度为 0.20 mmol/L。
2.5 引物浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响
引物浓度对扩增反应影响显著，浓度太低时，
与 DNA 模板结合位点较少，不能有效扩增，浓度
太高则会导致非特异产物及引物二聚体生成。图 5
显示，浓度低于 0.4 μmol/L 时无扩增产物 ；浓度为
0.64-0.8 μmol/L 时扩增效率低且不清晰，升高至 0.96
μmol/L 时，条带数量最多，谱带最清晰稳定 ；但当
引物浓度大于 1.2 μmol/L 时，条带数量减少，亮度
下降。本研究认为节瓜 ISSR-PCR 反应体系引物浓
度为 0.96 μmol/L 最佳。
M ：DL2000 标准分子量 ；1-8 ：10、30、50、70、90、120、150 和 180 ng/μL
图 2 模板 DNA 浓度对 ISSR-PCR 扩增效果的影响（引物
为 IS807）
M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
M：DL2000 标准分子量；1-8：0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 和 0.32
mmol/L
图 3 dNTP 浓度对 ISSR-PCR 扩增效果的影响（引物为
IS807）
M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
2.4 Mg2+浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响
Mg2+ 是 Taq DNA 酶激活剂，影响引物退火、模
板与 PCR 产物的解链温度、引物二聚体的形成等。
Mg2+ 浓度过低使酶催化活性降低，过量则导致非特
异扩增。图 4 显示，Mg2+ 浓度较低时扩增产物无或
较 弱（0.20-0.60 mmol/L）；浓 度 为 0.8-1.6 mmol/L
时，扩增条带较为清晰，但随浓度增大，背景弥散，
当 Mg2+ 浓度超过 2.0 mmol/L 时，酶活性过高导致非
特异性带增多，背景弥散模糊。因此确定节瓜 20 μL
反应体系中最佳 Mg2+ 浓度为 1.6 mmol/L。
M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
M ：DL2000 标准分子量 ；1-8 ：0.20、0.40、0.60、0.80、1.2、1.6、2.0 和 2.4
mmol/L
图 4 Mg2+ 浓度对 ISSR-PCR 扩增效果的影响（引物为
IS807）
M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
M ：DL2000 标准分子量 ；1-8 ：0.08、0.24、0.40、0.64、0.8、0.96、1.2 和 1.6
μmol/L
图 5 引物浓度对 ISSR-PCR 扩增效果的影响（引物为
IS807）
2.6 Taq DNA聚合酶浓度对ISSR-PCR扩增效果的
影响
图 6 显示，Taq DNA 酶浓度变化对扩增效果影
响有一定差异。Taq 酶单位用量在 0.08-1.6 U 中均
能扩增出清晰稳定条带，随着酶用量增加，条带多
态性增加且亮度加强，以至非特异条带增多呈弥散
现象 ；低于 0.4 U 时，谱带较弱，条带数目略少 ；升
至 1.6 U 时，谱带渐弱，非特异性条带增多导致背景
弥散。综合试验效果与经济费用考虑，20 μL 反应体
系中 Taq DNA 酶用量 0.8 U 为宜。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期94
M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
M：DL2000 标准分子量对照；1-8：0.24、0.40、0.64、0.80、0.96、1.20、1.44
和 1.60 U
图 6 Taq DNA 聚合酶浓度对 ISSR-PCR 扩增效果的影响
（引物为 IS807）
2.7 不同退火温度对ISSR-PCR反应体系的影响
以 组 合 12（ 模 板 DNA 浓 度 为 70 ng） 对 引 物
IS807 退火温度进行梯度筛选。结果（图 7）显示，
退火温度由 48℃升到 59℃范围内均能扩增出谱带，
但退火温度为 48-51℃时，由于退火温度过低，特
异性较差，主条带缺失且较弱，背景模糊 ；随着退
火温度升高（52-54℃），引物与模板的特异性增强，
主带多态性增多，亮度增强，53℃时最佳。退火
温度为 55-58℃时，谱带多态性降低，条带亮度变
暗，至 59℃时已基本扩增不出条带，因此确定引物
IS807 最佳退火温度为 53℃。
M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12
M ：DL2000 标 准 分 子 量 ；1-12 ：48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、
54℃、55℃、56℃、57℃、58℃和 59℃
图 7 退火温度对 ISSR-PCR 扩增效果的影响（引物为
IS807）
2.8 ISSR-PCR反应体系的稳定性检测
根据筛选出的最优体系（正交试验设计组合
12、模板 DNA 浓度为 70 ng），随机选择 4 条引物
对最终确定的节瓜 ISSR-PCR 反应体系稳定性进行
检测。结果（图 8）显示，所选 4 条 ISSR 引物对
4 份节瓜种质均能扩增出清晰明朗、重复性好的谱
带，且在不同节瓜材料中表现出丰富的多态性，表
明 优 化 确 立 的 节 瓜 ISSR-PCR 反 应 体 系 是 稳 定 可
靠，可用于后续的节瓜种质分类鉴定与遗传多样性
分析。
M 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
M 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16
1-16 ：分别为引物 IS835、IS826、IS808、IS889 对 4 份样品的扩增结果
图 8 四条 ISSR 引物对优化的 ISSR-PCR 反应体系的验证
3 讨论
ISSR-PCR 反应体系是一个多因子协同控制的综
合反应，受多种因素的综合影响，为了获得重复性
和可靠性较高的 ISSR 体系，提高分析准确性，需对
不同试验条件下 PCR 反应体系进行优化。ISSR-PCR
体系已在多种蔬菜中建立，但节瓜 ISSR-PCR 反应
体系尚未有报道。通常使用的优化试验设计的方法
有单因子试验和正交试验。单因素试验优化可设置
较多的水平梯度，以得到比较精确的单因素最优水
平，但具有耗费时间、成本高，不能反映各因素间
的互作关系等缺点。正交试验设计在了解各因素之
间的内在规律，快速找到最优水平组合的试验体系
方面，是一种值得借鉴的方法。两者结合使用，可
以排除各因素间互作对最终体系的影响，快速选出
反应最佳组合。徐奭等［18］、孙正海等［19］、隋晓青等［20］
利用正交试验设计与单因素相结合方法分别建立了
银杏、滑叶藤及克氏针茅的 ISSR-PCR 最佳反应体系。
模板 DNA 浓度、dNTP、Mg2+、Taq 酶浓度与引
物是影响 ISSR-PCR 扩增产率及稳定性的 5 个重要
因素。模板 DNA 适宜浓度变化范围较大，浓度太高，
非特异性扩增加强，图谱背景弥散，浓度过低则扩
增谱带无或较少较弱［21］。dNTP 浓度过高易导致非
特异性扩增，浓度过低则影响合成效率，甚至会因
dNTPs 过早消耗完而终止反应［22］。Mg2+ 是 Taq 酶催
化剂，浓度过高易导致非特异性扩增，背景加强，
2014年第9期 95赵芹等：节瓜 ISSR-PCR 反应体系的建立与正交优化
浓度过低则降低扩增效率［23］，而 dNTP 中的磷酸基
团也能定量与 Mg2+ 结合，降低实际参加反应的 Mg2+
浓度［24］。Taq DNA 聚合酶浓度过高，易造成经济上
的浪费，且产生非特异性扩增导致背景模糊，浓度
过低则产物合成效率下降［25］。引物浓度不宜过高，
否则易引起非特异扩增与引物二聚体形成，浓度过
低，则与模板 DNA 结合位点减少，引起扩增条带减
弱及背景弥散［26］。
李雪等［27］ 利用 L16（4
5）正交优化大蒜 ISSR-
PCR 反应体系，认为 dNTPs 浓度、引物浓度及 Taq
酶是 5 个影响因子中最重要的 3 个因子 ；而谢运海
等［28］在 4 个水平上对影响水曲柳 ISSR-PCR 扩增效
果的 5 个因子进行优化，认为 Taq 酶、引物与 Mg2+
是最具影响力的 3 个因子 ；刘芸君等［29］对岩白菜
采用 5 因子 4 水平进行 ISSR-PCR 正交优化设计，发
现 dNTPs 浓度、Mg2+ 浓度与模板 DNA 浓度对反应
体系影响最大。而本研究发现，dNTP>Taq 酶 >Mg2+
依次为影响节瓜 ISSR-PCR 最显著的 3 个因子。这
些差异可能是植物物种不同造成的。基于建立的最
优体系，利用 4 条 ISSR 引物对 4 份节瓜种质检测扩
增，扩增谱带清晰明亮、多态性高且重复性好，证
明本研究建立的反应体系可用于后续的种质鉴定与
遗传分析，同时为冬瓜属内其他种的相关研究提供
一定依据。
4 结论
本研究利用 L16（4
5）正交试验设计结合单因素
试验方法，对影响节瓜 ISSR-PCR 反应的主要因素
进行优化筛选分析，建立节瓜最适反应体系 ：20 μL
反应体系包括模板 DNA 70 ng，dNTP 0.20 mmol/L，
Mg2+ 1.2 mmol/L，引物 0.96 μmol/L，Taq DNA 聚合酶 0.8
U，10×buffer 2.0 μL。反应引物 IS807 反应的程序为
94℃预变性 4 min ；94℃变性 30 s，53℃退火 45 s，
72℃延伸 2 min，共 40 个循环；72℃延伸 7 min，4℃
保存。利用 4 条引物对 4 份节瓜种质检测，验证了
该反应体系的稳定性与可靠性。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）