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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii，ES）是一
种周生鞭毛、革兰氏阴性无芽胞杆菌，为条件致病
菌，新生儿特别是早产儿和免疫力低下的人作为易
感染人群，易导致脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结
肠炎［1］。流行病学调查发现，阪崎肠杆菌主要通过
婴儿配方奶粉传播导致感染，死亡率高达 50% 以上，
FAO/WHO 已经将其列为 A 类危险致病微生物［2］。
近年来，阪崎肠杆菌感染事件国内外相继报道，已
引起世界各国重视，其中较多的是婴儿配方奶粉
收稿日期 ：2012-08-08
基金项目 ：贵州省卫生厅优秀医学青年科技人才基金项目（gzwkj2010-2-002）
作者简介 ：周鹤峰，男，硕士，副教授，研究方向 ：医药生物技术 ；E-mail ：hfztim@163.com
阪崎肠杆菌胶体金试纸条的制备及初步应用
周鹤峰1　邵敏1　李长福2　葛正龙2
（1. 遵义医学院珠海校区生物工程系，珠海 519041 ；2. 遵义医学院生物化学教研室，遵义 563003）
摘 要 ： 制备阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii，ES）胶体金快速检测试纸并对其性能进行评价。通过柠檬酸三钠法制备
胶体金颗粒，标记抗阪崎肠杆菌特异性的单克隆抗体，采用双抗夹心法，将标记的胶体金复合物喷涂于试纸的结合垫，另一单抗
和二抗（羊抗鼠 IgG 抗体）分别包被在硝酸纤维素膜的检测线（T）和控制线（C）上，制备出检测阪崎肠杆菌胶体金试纸条，进
行敏感性、特异性、稳定性、重复性试验，借助于简单的增菌过程，在 6 h 内即可检测出样品中阪崎肠杆菌的含量，灵敏度达到
1×104 CFU/mL，与常见的食源性致病菌无交叉反应。结果显示该试纸具有简单、灵敏、特异、稳定、快速等优点，可用于 ES 的检测。
关键词 ： 阪崎肠杆菌 单克隆抗体 胶体金 快速检测
Preparation and Primary Application of Enterobacter sakazakii
Colloidal Gold Test Strip
Zhou Hefeng1 Shao Min1 Li Changfu2 Ge Zhenglong2
（1Department of Bioengineering，Zunyi Medical College Zhuhai Campus，Zhuhai 519041 ；2Department of Biochemistry，Zunyi Medical
College，Zunyi 563003）
Abstract:  To develop and test its performance of colloidal gold immunochromatographic test strip for rapid detection of Enterobacter
sakazakii（ES）. The colloidal gold particles were prepared by the sodium citrate reduction method. Purified ES monoclonal antibodies were
labelled with the colloidal gold particles. The gold-labeled antibody was coated on the gold conjugate pad using the immune double sandwich
method. The another mAb of ES was coated on the surface of nitrocellulose filter membrane（NC）as the test line（T line）, while the
secondary antibody（goat anti-rabbit IgG antibody）was coated on the surface of NC as the control line（C line）. Then the test strip was
assembled with sample pad, absorbing pad, and dorsal shield. Its sensitivity, specificity, stablility and reproducibility were evaluated. It can
detect the sample content of ES by means of a simple enrichment process. This whole time will take 6 h. The test strip’s sensitivity reached
1×104 CFU/mL, and displayed perfect specificity without cross reactions with food-borne pathogens. All these results showed that the strip was
simple, sensitive, specific, stable, and rapid for detection of ES.
Key words:  Enterobacter sakazakii Monoclonal antibody Colloidal gold Rapid detection
污染［3］。
目前，阪崎肠杆菌的检测主要依赖传统细菌学
分离培养方法、分子生物学等检测手段［4］，我国已
于 2005 年颁布了 ES 分离与计数检验的行业标准，
但上述方法都存在检测周期长、操作繁琐等不足，
很难在实际快速检测中得到广泛推广和应用。免疫
胶体金层析技术（GICA）具有简单、快速、准确、
不需贵重仪器设备和专业技术人员操作等优点，近
年来在多个领域得到了较广泛的应用，但将胶体金
2013年第2期 173周鹤峰等 ：阪崎肠杆菌胶体金试纸条的制备及初步应用
免疫层析试纸条用于阪崎肠杆菌的检测目前国内外
未见报道。本研究利用课题组前期筛选出的杂交瘤
细胞株制备了阪崎肠杆菌单克隆抗体，采用辛酸 -
硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，双抗夹心法制备胶
体金试纸条，并进行初步检测试验，旨在为今后开
发商品化的快速检测试纸条产品奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）、牛
血清白蛋白（BSA）购自美国 Sigma 公司 ；柠檬酸三
钠、Tween-20 购自上海精析化工科技有限公司 ；硝
酸纤维素（NC）膜购自美国 Millipore 公司 ；羊抗鼠
IgG（二抗）购自上海生工生物工程有限公司 ；阪崎
肠杆菌（ATCC 51392）购自广东环凯微生物科技有
限公司 ；阪崎肠杆菌单克隆抗体为本实验室自制 ；
快速增菌液购自北京陆桥科技有限公司 ；其他试剂
均为国产分析纯。
1.1.2 主要仪器 SXCL-3 型数显加热磁力搅拌器、
超声仪、漩涡混匀仪 WH-3 均购自巩义市予华仪器
有限责任公司 ；H-600 透射电镜购自日本日立公司 ；
冷冻离心机购自美国 Thermo Electron ；D U640 紫外
光谱扫描仪购自 BECKMAN 公司。
1.2 方法
1.2.1 ES 单克隆抗体制备及效价检测 培养的阪
崎肠杆菌离心收集菌体，加 1% 的甲醛灭活，计
数，PBS 稀释至 2×108 CFU/mL 作为免疫原，按 0.5
mL/只菌液量腹腔免疫 BALB/c 小鼠，待小鼠血清效
价达到要求后，常规方法进行细胞融合、筛选及亚
克隆，取培养上清与常见的致病菌进行交叉反应试
验检测其特异性。将特异性较强的杂交瘤细胞株通
过小鼠体内诱生腹水法制备 ES 单抗，辛酸 - 硫酸铵
法对单抗进行纯化，单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴
定抗体的亚型，间接 ELISA 法检测其亲和力及效价。
1.2.2 胶体金的制备 利用柠檬酸三钠法制备 40
nm 胶体金［5］，具体方法 ：加热 100 mL 0.01% 的氯
金酸溶液至沸腾后，迅速用广口试管加入 1% 的柠
檬酸三钠溶液 1 mL，颜色稳定后继续煮沸 10 min，
冷却，4℃保存备用。利用透射电镜和紫外光谱扫描
仪分析胶体金的性状。
1.2.3 标记条件的选择 标记条件包括 ：最佳标记
量以及最佳标记 pH 值，二者均利用 Mey 氏稳定性
试验确定［6］，具体方法 ：在酶标板孔中分别加入胶
体金 100 μL，依次加入 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3
和 3.5 μg 的抗阪崎肠杆菌单克隆抗体，混匀 10 min
后各加入 10% NaCl 溶液 20 μL，于 10 min 后肉眼观
察反应结果，第一个保持不变颜色孔的抗阪崎肠杆
菌单克隆抗体加入量即为最少稳定量，最少稳定量
增加 10% 左右为实际标记量 ；取三支 1.5 mL 离心管
各装胶体金 1 mL，用 0.1 mol/L HCl 和 K2CO3 分别调
pH 为 7.2、8.2 和 9.2，加入最佳标记抗体量，对比
标记效果。
1.2.4 免疫胶体金制备［7］ 取 10 mL 胶体金于三
角瓶中，用 K2CO3 调 pH 为最佳标记条件，加入最
佳标记抗体量，搅拌反应 30 min，得免疫胶体金，
8 000 r/min 离心 30 min，用 1 mL PBS 复溶免疫胶体
金备用。将制备好的免疫胶体金喷涂在玻璃纤维膜
上制成胶体金垫。
1.2.5 层析 NC 膜的制备 将羊抗鼠二抗（C 线）和
阪崎肠杆菌单克隆抗体（T 线）蛋白分别划在 NC 膜
上，二者的浓度分别为 0.5 mg/mL 和 1 mg/mL，制成
层析 NC 膜。
1.2.6 试纸条的组装及结果判定 胶体金试纸条由
样品垫、金标垫、吸收垫、NC 膜和 PVC 底板组成，
按顺序组装试纸条。取 50 μL 样品加于试纸条样品
垫上，5 min 后 T 线和 C 线均出现红色条带时为阳
性 ；只有 C 线显色为阴性 ；C 线不显色，无论 T 线
是否显色，试纸条的检测结果无效。
1.2.7 试纸条性能的评价
1.2.7.1 试 纸 条 灵 敏 度 的 检 测 将 浓 度 为 1×106
CFU/mL 的 ES 灭活菌悬液用 PBS 作倍比稀释，进行
敏感性试验，每个稀释度重复两次，并设 PBS 为阴
性对照，以检测到的最低浓度确定为该试纸条的灵
敏度。
1.2.7.2 试纸条特异性检测 分别将灭活的 16 种菌
（表 2）用 PBS 稀释至 1×106 CFU/mL，PBS 作为阴
性对照，进行交叉反应试验，根据试纸条的检测结
果判断其特异性。
1.2.7.3 重复性试验 随机抽取３批自制的试纸条
检测 3 份阳性菌液及阴性对照菌液，每个样品重复
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期174
检测 10 次，进行批内重复试验和批间重复试验。
1.2.7.4 试纸条稳定性试验 试纸条加上干燥剂并
用塑料袋密封后分别于 4℃和常温保存，每隔 1 周
取出对相同阳性与阴性样本进行检测，观察其特异
性及灵敏度的变化。
2 结果
2.1 单克隆抗体的鉴定
经 ELISA 筛选共获得了 5 株能稳定分泌单克隆
抗 体 的 杂 交 瘤 细 胞 株（1H7、2H9、2B12、4H4 和
5A5），交叉反应结果显示 1H7 和 2B12 的特异性较强。
采用抗体亚类试剂盒测定，1H7 和 2B12 产生
的单抗的抗体 Ig 亚类分别为 IgG1 和 IgG2a。间接
ELISA 法测定 mAb 的相对亲和常数分别为 1.23×109
L/mol 和 2.68×109 L/mol，效价分别为 1∶1×107 和
1∶2×107，表明制备的单抗与阪崎肠杆菌的亲和力
较高。
2.2 胶体金质量的鉴定
肉眼观察所制备的胶体金溶液清澈透明，呈深
红色，利用紫外光谱扫描仪分析胶体金颗粒，由图
1 可以看出，胶体金最大吸收波长在 538 nm，代入
回 归 方 程 y=0.786x+505.53（y ：Amax ；x ：粒 径 大
小）［8］，可得胶体金溶液的平均粒径分布在 40 nm
左右。透射电镜图显示胶体金颗粒大小均匀，大部
分颗粒呈现圆形，无多角形（图 2）。
浓缩在 NC 膜上与抗原结合后，pH8.2 时标记的显色
较其他两种明显（图 4）。
600500400 450 550
Wavelengthnm
O
D
2
1
0
538
图 1 胶体金紫外扫描图
100nm
图 2 胶体金颗粒电镜观察结果（20 000×）
2.4 组装试纸条
根据示意图流程组装试纸条（图 5）所示，1 为
PVC 底板，2 是将 PVC 底板的中间的离型纸弃掉，
离上边缘 17 mm 处贴上硝酸纤维（NC）膜，3 是将
吸水纸压住 NC 膜 1 mm，4 中的红色结合垫喷涂有
免疫胶体金，压住 NC 膜 1 mm，宽度是 7 mm，5 中
的最下面贴有样品垫，压住结合垫 2 mm，检测时用
于过滤和吸收样品，6 中的几条胶体金试纸条是 5
经过切条机切割成的成品胶体金试纸条，整个胶体
金试纸条的长度以及各个部分的尺寸可以根据不同
1 2 3 4 5 6 7 8
1 ：0 μg/100 μL ；2 ：0.5 μg/100 μL ；3 ：1 μg/100 μL ；4 ：1.5 μg/100 μL ；5 ：2
μg/100 μL ；6 ：2.5 μg/100 μL ；7 ：3 μg/100 μL ；8 ：3.5 μg/100 μL
图 3 抗体最佳标记量的确定
1 2 3
图 4 最佳 pH 值的确定
1 ：pH7.2 ；2 ：pH8.2 ；3 ：pH9.2
2.3 标记条件的选择
根据 Mey 氏稳定性试验，当抗体标记量为 2.5
μg/100 μL（6 号）时颜色趋于稳定，所以实际标记
量为 2.75 μg/100 μL（图 3）；在 pH7.2、8.2 和 9.2 三
种环境标记的抗体颜色无明显区别，而金标抗体经
2013年第2期 175周鹤峰等 ：阪崎肠杆菌胶体金试纸条的制备及初步应用
的项目调整，以适用不同的层析条件和速度。 试纸条对比检测效果无明显差异，特异性与敏感性
无变化。
1 2 3 4 5 6
图 5 试纸条组装流程图
表 1 试纸条灵敏度试验结果
Sample NO. Concentration of ES（CFU/mL） Test result of test strip
1 1×106 +
2 1×105 +
3 5×104 +
4 1×104 +
5 5×103 -
6 1×103 -
1 2 3 4 5 6
图 6 试纸条的灵敏度
2.5.2 特异性检测结果 应用组装试纸条对浓度为
1×106 CFU/mL 的 16 种菌进行交叉反应试验，结果
均为阴性（表 2），表明该试纸条具有较好的特异性。
2.5.3 试纸条重复性试验结果 分别用不同批次试
纸条检测，批内与批间结果均无差异，且检测线和
质控线条带清晰，表明试纸条的重复性良好。
2.5.4 试纸条稳定性试验结果 制备的试纸条在
4℃保存 6 个月后和常温保存 4 个月后，与新制备的
表 2 试纸条特异性检测结果
Strain Cross reactivity result
阪崎肠杆菌 +
阴沟肠杆菌 -
大肠杆菌 O157 ：H7 -
产气肠杆菌 -
金黄色葡萄球菌 -
副溶血性弧菌 -
福氏志贺氏菌 -
宋氏志贺氏菌 -
单核细胞增生李斯特菌 -
甲型副伤寒沙门氏菌 -
乙型副伤寒沙门氏菌 -
伤寒沙门氏菌 -
化脓链球菌 -
嗜热链球菌 -
枯草芽孢杆菌 -
婴儿双歧杆菌 -
保加利亚乳杆菌 -
2.5 试纸条性能检测结果
2.5.1 灵敏度检测结果 由表 1 和图 6 可看出，5
号 和 6 号 均 为 阴 性，1 号、2 号、3 号、4 号 为 阳
性，其中 4 号为弱阳性，点样的菌液浓度为 1×104
CFU/mL，表明该试纸条对阪崎肠杆菌的最低检测浓
度为 1×104 CFU/mL。
两条带为阳性 ；一条带为阴性
3 讨论
胶体金免疫层析技术因其操作简单，方便快速，
灵敏度高，无需专业人员和仪器设备等特点，在生
物医学领域显现出越来越广泛的应用前景。
胶体金是指氯金酸在还原剂的作用下还原并聚
集形成一定大小的金颗粒，并由于静电作用而形成
稳定胶体状态，化学还原法中最常见的还原剂为柠
檬酸三钠［9］。金颗粒的粒径大小受还原剂用量的影
响，试验中摸索还原剂用量，利用柠檬酸三钠制备
胶体金溶液具有可重复性，制备的胶体金颗粒有利
于结合抗体，同时有助于自身以及金标抗体的稳定，
适用于胶体金的标记，但要制备出质量较好的胶体
金溶液，较为干净的器皿也是必不可少的。
标记条件是胶体金免疫层析方法最为关键的一
步，其中 pH 值是免疫胶体金形成的关键［10］，在略
高于蛋白质等电点的 pH 值的条件下，蛋白质能与
胶体金表面带有的正电荷牢固结合成免疫胶体金 ；
而抗体蛋白的标记量决定着整个成品的灵敏度，由
于胶体金结合抗体蛋白是一定的，如果抗体量少则
不能最大可能的逮捕住抗原，导致灵敏度下降 ；反
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期176
之抗体多于其饱和标记，一则浪费抗体，二则游离
的抗体会跟抗原结合，同样也会导致灵敏度下降。
近年来，各种菌体的胶体金检测试制条相继出
现，但灵敏度并不统一。本试验对阪崎肠杆菌的最
低检测浓度为 1×104 CFU/mL，此灵敏度可以满足日
常阪崎肠杆菌的筛选工作，而且检测方法简单、时
间短，可以定性的判断阪崎肠杆菌的含量范围。
4 结论
本试验通过对 pH 值和抗体蛋白的标记量等条
件进行摸索，得出 40 nm 胶体金最适蛋白标记量
为 27.5 μg/mL， 最 佳 标 记 pH 为 8.2， 胶 体 金 T 线
包被多抗浓度为 0.5 mg/mL，二抗包被浓度为 0.625
mg/mL。
制备出检测 ES 胶体金试纸条，借助于简单的
增菌过程，在 6 h 内即可检测出样品中是否含有阪
崎肠杆菌，检测下限为 1×104 CFU/mL ；与常见的大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、链球菌、
副溶血性弧菌、志贺氏菌等均无交叉反应，该试纸
条为 ES 的检测提供了一种简单、灵敏、快速的方式。
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（责任编辑 马鑫）