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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):177-182
收稿日期 ：2014-12-24
基金项目 ：由天津市科技支撑计划重点项目（13ZCZDNC00600）
作者简介 ：朱慧明，女，硕士，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：zhm15903855271@163.com
通讯作者 ：杨洪江，男，博士，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：hongjiangyang@tust.edu.cn
高产铁载体假单胞菌的筛选及其对铁氧化物的利用
朱慧明1  张彦2  杨洪江1
（1. 天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457 ；2. 天津双联科鑫生物科技有
限公司，天津 300403）
摘 要 ： 筛选高产铁载体的微生物，研究铁载体的抑菌作用和对不溶性未定型铁氧化物（poorly crystalline iron hydroxides，
PCIH）的利用。CAS 法筛选高产铁载体菌株，采用琼脂扩散法和生长抑制测定铁载体的抑菌作用，利用 16S rRNA 基因序列比对
鉴定分离菌株，并根据分离菌株的生长情况，确定铁载体对不溶性 PCIH 的利用。从土壤样品中共筛选到 172 株产铁载体的菌株，
高产铁载体菌株 13 株，其中仅有菌株 Z158 的发酵液对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌具有抑菌作用，
抑菌率分别为 51.3%、50.2%、37.1% 和 28.0%。比对该菌株的 16S rRNA 基因序列，确定 Z158 属于 Pseudomonas aeruginosa。当不
溶性的 PCIH 作为唯一可利用的铁源时，菌株 Z158 培养 24 h 的生物量比无铁条件下提高了 46.1%。铜绿假单胞菌 Z158 分泌的铁
载体能够抑制病原菌的生长，同时还能获取不溶性未定型铁氧化物 PCIH 中的铁元素。
关键词 ： 铁载体 ；铜绿假单胞菌 ；抑菌 ；未定型铁氧化物
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.025
Screening of Pseudomonas Strains Producing High-yield Siderophore
and Its Utilization of Iron Hydroxides
Zhu Huiming1 Zhang Yan2 Yang Hongjiang1
（1. College of Biotechnology in Tianjin University of Science and Technology，Key Laboratory of Industrial Microbiology of Ministry of
Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，Tianjin 300457 ；2. Tianjin Shuanglian Kexin Biotechnology Co.，Ltd，
Tianjin 300453）
Abstract: The aim of this study is to isolate the microorganisms producing high-yield siderophore, investigate antimicrobial activity of
siderophore against pathogenic bacteria, and study the effect of siderophore on the utilization of insoluble poorly crystalline iron hydroxides
（PICH）. CAS method was used for isolating microorganisms producing high-yield siderophore. Agar diffusion method and growth inhibition
assay were used to test antimicrobial activities of siderophore. Sequence alignment of 16S rRNA gene was used for strain identification. Bacterial
growth was measured to investigate the utilization of insoluble PCIH by siderophore. Totally, 172 siderophore-producing strains were isolated
from soil samples, including 13 potentially strong siderophore producers（PSSP）. The analysis of antimicrobial activities of siderophore showed
that only the supernatant of Z158 culture had a pronounced inhibiting effect on the growth of Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Proteus
vulgaris, and Vibrio parahemolyticus, and the inhibition efficiency was 51.3%, 50.2%, 37.1%, and 28.0%, respectively. Homology analysis of
16S rRNA gene sequence identified strain Z158 as Pseudomonas aeruginosa. Moreover, with insoluble PICH as sole iron source, the biomass
of Z158 increased by 46.1% at 24 h after incubation. In conclusion, the siderophore secreted by P. aeruginosa Z158 could inhibit the growth of
pathogenic bacteria and acquire iron element from insoluble PCIH.
Key words: siderophore ；Pseudomonas aeruginosa ；antimicrobial activity ；poorly crystalline iron hydroxides
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9178
铁元素不仅参与维持微生物细胞内多相体系的
渗透平衡，还是微生物代谢过程中多种酶反应的必
要成分，铁元素的缺乏能够限制微生物的生长。在
中性和碱性条件下，铁元素主要以不溶的矿物质形
式存在，难以满足微生物的正常生长。在可溶性铁
极度缺乏的环境中，微生物通过合成和分泌铁载体
获取铁元素。铁载体是一类特异性螯合 Fe3+ 的金属
配体，与 Fe3+ 结合的官能团和中心结构具有多样性，
主要包括氧肟酸型、儿茶酚型和多羟基羧酸型［1］。
铁载体对 Fe3+ 具有较高亲和力，与 Fe3+ 形成
稳定的络合物，在任何 pH 值下对不溶性铁矿物质
的溶解度都有显著地影响。有研究报道，假单胞菌
Pseudomonas sp. 和 P. mendocin 在铁元素缺乏下，能
够从不溶性的赤铁矿（Hematite）中获取铁元素维
持自身的生长［2，3］。假单胞菌产生的铁载体，不能
被本属以外的其它微生物利用，因此能够抑制其它
微生物的生长，减少植物根部病原菌的数量 ；同时，
铁载体铁离子络合物也可作为一种铁源被植物利用，
促进植物的生长，这些特点使假单胞菌在植物的生
物防护中能够发挥重要作用［4］。
为了进一步挖掘微生物资源，本研究从环境中
分离了高产铁载体菌株，分析了铁载体对 4 种常见
致病菌的抑制作用，同时还分析了铁载体溶解不溶
性未定型铁氧化物（Poorly crystalline iron hydroxides，
PCIH）的能力，旨在为生防菌的候选菌株，用于植
物细菌性感染的防治和促进植物的生长。
1 材料与方法
1.1 材料
Luria-Bertani（LB）培养基用于细菌的常规培养；
Modified Sucrose-Aspartate 培 养 基（MSA）、Modified
King B 培 养 基（MKB）、Succinate medium（SM）［5］
和 Arginine medium（AM）［6］，主要用于细菌铁载体
的合成 ；Chrome Azurol S 溶液（固体 CAS 则需额外
添加 10 g/L 琼脂）［7］，用于检测铁载体。
未定型铁氧化物（Poor crystalline iron hydroxid-
es，PCIH） 的 制 备 ：0.02 mol/L Fe（NO3）3， 快 速
加入 1 mol/L NaOH 至 pH 值为 7.0，室温下搅拌 24
h，离心，水洗除去大量的 Na+ 和 NO3
- 后，真空冷
冻干燥 24 h。使用前加入到培养基中，115℃灭菌
25 min［8］。
1.2 方法
1.2.1 高产铁载体菌株的筛选 取蓟运河土壤梯度
稀释，稀释液涂布在 MSA 平板上，待菌落长出后覆
盖一层 CAS 蓝色培养基，观察菌落周围颜色变化，
15 min 内与 CAS 发生颜色变化的菌株被定义为 PSSP
（Potentially strong siderophore producers）；而 颜 色 变
化不完全或者颜色变化时间超过 12 h 的菌株被定义
为 BSP（Borderline siderophore producers）［9］， 将 菌
落周围颜色发生变化的菌株划线纯化。挑单菌落于
液体 MSA 培养基中，30℃、200 r/min 培养 24 h 后，
10 000 r/min 离 心 5 min， 取 等 体 积 无 细 胞 上 清 与
CAS 溶液混合，室温下静置 1 h，测定 OD680
［10］。用
铁载体活性单位（Siderophore units，SU）表示铁载
体的产量，SU=［（Ar-As）/Ar］×100%，Ar 是未接
种的培养基与等体积 CAS 混合 OD680，As 是菌株上
清与等体积 CAS 混合 OD680 ；并对细菌产铁载体能
力进行划分，As/Ar 从 1.0-0 之间以 0.2 为间隔，每
减小 0.2 增加一个“+”，一般产铁载体能力较高的
细菌其 As/Ar 低于 0.5［11］。
1.2.2 琼脂扩散法测定 PSSP 菌株对常见致病菌的抑
菌情况 采用琼脂扩散法［12］测定 PSSP 菌株的抑菌
效果，具体步骤是对 PSSP 菌株单菌落打孔，连同
培养基一起取出放置在事先涂布有金黄色葡萄球菌、
藤黄微球菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌的 MKB
平板上，37℃培养 12-24 h，测定抑菌圈大小。
1.2.3 菌株的分子鉴定铁载体 按照文献提供的方
法提取菌株的基因组 DNA［13］，并以此为模板利用
通 用 引 物 27F 和 1492R 扩 增 16S rRNA 片 段，PCR
产物纯化后进行序列测定，将得到的序列递交于
GenBank，通过 Blast 检索，在 GenBank 中的已知序
列中进行同源性分析，确定与分离菌株同源程度最
高 的 序 列 ；同 时 利 用 Ribosomal Database Project Ⅱ
软件 Classifer，对分离的菌株进行进一步分类分析 ；
利用 MEGA5.0 中 Neighbor-Joining 方法构建系统进
化树，确定菌株的进化地位。
1.2.4 液体混合法测定铁载体对常见致病菌的抑
菌情况 在 MSA 培养基中加入 FeCl3，使培养基中
Fe3+ 的终浓度分别为 0、0.5、1、5、10、100、200
2015,31(9) 179朱慧明等：高产铁载体假单胞菌的筛选及其对铁氧化物的利用
μmol/L，30℃、200 r/min 培养，每个浓度 3 个平行，
24 h 后测定菌株的生长和铁载体产量 SU。
Z158 在 Fe3+ 终 浓 度 为 0 和 100 μmol/L 条 件 下
的发酵液上清以 20% 的体积加入到已接种指示菌的
液体 MKB 培养基中，同时以只接种指示菌的液体
MKB 培养基为对照，每组 3 个平行，16 h 后测定指
示菌的生长状况 OD600
［11］。
1.2.5 不 同 培 养 基 对 菌 株 Z158 铁 载 体 产 量 的 影
响 MKB 培养基、MSA 培养基、SM 培养基和 AM
培养基，4 种常用于铁载体产生的培养基，同时以
LB 培养基作对照培养 Z158，每组 3 个平行，24 h
后测定 Z158 在不同培养基中铁载体产量 SU。
1.2.6 菌株 Z158 对不溶性未定型铁氧化物的利用
实验 每升培养基中添加 1 g 8- 羟基喹啉，充分混
匀后加入 500 mL 氯仿萃取 8- 羟基喹啉，上层无色
透明溶液即是无铁 SM 培养基［14］。在无铁 SM 培养
基中分别加入 3 种不同形式的铁源，即 0.1 g/L 不溶
性 PCIH 粉末、终浓度为 1 μmol/L Fe3+ 和终浓度为 1
μmol/L EDTA-Fe3+，同时以无铁培养基为对照，每组
3 个平行，12 h 和 24 h 时测定 Z158 生长情况和铁载
体产量。
本实验使用到的玻璃器皿均用浓盐酸溶液过夜
浸泡，然后去离子水清洗 3 遍。实验中避免使用铁
制器械，接种采用铂金丝接种针。
2 结果
2.1 高产铁载体菌株的筛选
利 用 MSA-CAS 平 板 从 土 壤 样 品 中 共 分 离 到
172 株产生铁载体的菌株，PSSP（Potentially strong
siderophore producers）菌株有 13 株，BSP（Borderline
siderophore producers）菌株有 159 株。进一步用液
体 CAS 方法定量测定了分离菌株的铁载体产量，发
现 BSP 菌 株 的 SU 值 均 在 60% 以 下， 与 MSA-CAS
平板上 BSP 菌株的颜色变化缓慢一致 ；13 株 PSSP
菌株产生铁载体的能力均为 ++++，其中菌株 Z13 铁
载体产量最大，SU=74.6%（表 1）。
表 1 分析 PSSP 菌株产铁载体的水平
菌株 菌落形态 铁载体活性单位 /% 产铁载体能力
Z13 乳白色不透明大菌落 74.6 ++++
Z43 白色粘稠不透明大菌落 62.7 ++++
Z86 浅乳黄色不透明圆形小菌落 67.1 ++++
Z91 白色粘稠不透明大菌落 61.0 ++++
Z142 浅黄不透明粘稠圆形大菌落 63.1 ++++
Z158 扁平透明的浅绿色菌落 70.5 ++++
Z159 白色湿润透明小菌落 61.4 ++++
Z165 乳白色梭形不透明大菌落 64.2 ++++
Z166 乳白色圆形不透明大菌落 63.1 ++++
Z167 扁平不透明的浅绿色菌落 63.2 ++++
Z169 乳白色湿润透明小菌落 61.4 ++++
Z171 白色粘稠不透明小菌落 61.2 ++++
Z172 白色粘稠不透明大菌落 71.3 ++++
2.2 PSSP菌株对常见致病菌的抑制作用
采用琼脂扩散法分析分离菌株的抑菌能力，结
果显示，13 株 PSSP 菌株中，10 株对普通变形杆菌
有抑制作用，2 株对金黄色葡萄球菌有抑制作用，1
株对副溶血性弧菌有抑制作用，1 株对藤黄微球菌
有抑制作用。其中菌株 Z158 对金黄色葡萄球菌、藤
黄微球菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌 4 种指
示菌都有明显的抑制作用，抑菌圈大小分别为 15.0
mm、13.8 mm、10.1 mm 和 8.9 mm。根据抑菌数据，
选择菌株 Z158 作进一步分析。
菌株 Z158 在含有 0 μmol/L 和 100 μmol/L Fe3+ 的
培养基中铁载体产量分别为 70.8% 和 19.9%，将两
种不同铁载体含量的无细胞上清分别与 4 种致病菌
分别混合培养，结果显示低铁载体含量上清几乎无
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9180
抑制作用，高铁载体含量上清对金黄色葡萄球菌、
藤黄微球菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌的抑菌
率分别为 51.3%、50.2%、37.1% 和 28.0%（图 1）。
是典型模式菌株，能产生对 Fe3+ 高亲和力的脓青素
（Pyoverdine）；从印度果阿邦分离到的 P. aeruginosa
4EA 可产生 pyochelin 和 pyoverdine 两种铁载体。综
合以上结果，鉴定 Z158 属于铜绿假单胞菌。
2.4 不同培养基对菌株Z158铁载体产量的影响
菌株 Z158 在 5 种含有不同碳氮源和微量元素
的培养基中的生长和铁载体产量不同，从表 2 可知，
Z158 在营养丰富的 LB 培养基上生长最好，但铁载
体含量最低，说明 LB 适合菌株生长却不适合铁载
体的产生 ；SM、MSA 和 AM 培养基都适合 Z158 的
铁载体产生，综合 OD600 和 SU，我们选择 SM 培养
基作为菌株 Z158 最适产铁载体的培养基。
表 2 不同培养基对 Z158 生长状况和铁载体产量的影响
培养基 生物量 铁载体活性单位 /%
SM 1.1 72.0
MSA 0.9 69.2
AM 0.8 49.7
MKB 1.8 39.0
LB 2.0 2.9
铁载体在不同培养基中的产量不同，可能是培
养基中 Fe3+ 浓度的差异造成的。在 SM 培养基中添
加不同浓度的 Fe3+，分析铁载体的产量。结果如图 3
所示，随着培养基中 Fe3+ 浓度的增加，菌株 Z158 的
铁载体产量下降，当 Fe3+ 浓度达到 5 μmol/L 时，SU
降低至 17.2% ；同时我们还观察到，菌株 Z158 的
铁载体在随着 Fe3+ 浓度增加而减少时培养基的颜色
也发生变化，随着 Fe3+ 浓度的增加黄绿色变浅，当
80
60
40
20I
nh
ib
iti
on
e
ffi
ci
en
cy
/%
0
Staphylococcus
aureus
Micrococcus
luteus
Proteus
vulgaris
Vibrio
parahemolyticus
SU=70.8% SU=19.9%
图 1 菌株 Z158 不同含量的铁载体对致病菌的抑菌率
2.3 菌株Z158的分子鉴定
根据材料与方法所述，扩增菌株 Z158 的 16S
rRNA 基 因 片 段， 测 序 后 得 到 扩 增 的 基 因 片 段 长
度 为 1 418 bp， 上 传 至 GenBank 获 得 的 登 录 号 为
KP322019。 通 过 Blast 检 索， 与 GenBank 中 的 已
知 序 列 进 行 比 对， 发 现 与 Pseudomonas aeruginosa
ALK319 同源程度为 100%。为了进一步对分离菌
株 进 行 分 类， 利 用 16S rRNA 专 业 网 站 Ribosomal
Database Project Ⅱ提供的工具 Classifier，对 Z158 的
序列进行分析，鉴定该分离菌株与铜绿假单胞菌
的同源程度为 100%。构建 Z158 系统进化树（图
2），Z158 与 P. aeruginosa ATCC15692、P. aeruginosa
PAO1、P. aeruginosa 4EA 和 P. aeruginosa ALK319 的
同源程度高，遗传差异小 ；其中 P. aeruginosa PAO1
P. aeruginosa PAO1
P. aeruginosa ATCC 15692
P. aeruginosa ALK319
100 P. aeruginosa Z158
P. aeruginosa 4EA
P. fluorescens sp-f
P. entomophila L48
P. putida KT244085
79
92
97
54
P. fluorescens 29L
P. chlororaphis zong1
P. fluorescens CCTCC AB92001
P. brassicacearum J12
0.003
图 2 Z158 系统进化树 图 3 Fe3+ 浓度对铁载体产量的影响
cell density siderophore production
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
100
80
60
40
20
0
0 0.5 1.0 5.0
Fe3+/μmol·L-110.0 100.0 200.0Biomass/
O
D
60
0
Si
de
ro
ph
or
e
un
its
/%
2015,31(9) 181朱慧明等：高产铁载体假单胞菌的筛选及其对铁氧化物的利用
Fe3+ 浓度为 5 μmol/L 以上时，培养基颜色为白色且
不再发生变化。
2.5 菌株Z158对不溶性未定型铁氧化物（PCIH）
的利用
铁载体的功能之一是螯合环境中的不溶性铁，
为微生物和植物生长所利用。我们在实验室制备了
未定型铁化合物 PCIH，分析菌株 Z158 的生长状况。
结果如图 4 所示，菌株 Z158 在含有 0 μmol/L Fe3+、
1 μmol/L Fe3+、1 μmol/L EDTA-Fe3+ 和 PCIH 培养基中，
培养 12 h 时 OD600 分别是 0.28、0.56、0.53 和 0.34 ；
24 h 时 OD600 分别为 0.24、0.62、0.59 和 0.36。结果
显示，不溶性 PCIH 能够明显促进菌株 Z158 的生长，
菌株 Z158 合成分泌的铁载体能够通过溶解螯合作
用，从不溶性铁化合物中获取铁元素。
制备无铁培养基时，残留的微量 8- 羟基喹啉会
影响 CAS 反应的颜色，造成检测铁载体存在误差。
研究显示，铜绿假单胞菌产生的铁载体在 400 nm 左
右具有特异吸收峰。我们对发酵液的上清进行全波
长扫描发现，在 402 nm 处也存在特异吸收峰。因
此通过测定 OD402 初步分析发酵液中铁载体的含量。
结果如图 5 所示，在含有 PCIH 培养基中，铁载体
含量较高，仅次于含有 1 μmol/L EDTA-Fe3+ 的培养基。
3 讨论
土壤中含有多种微生物能合成铁载体，本研究
筛选到的 172 株产铁载体菌株，其中 PSSP 菌株有
13 株，BSP 菌株有 159 株。进一步用液体 CAS 方法
定量测定分离菌株的铁载体产量，发现 PSSP 菌株的
0.8
0.4
0.5
0.6
0.7
0.3
0.2
0.1
B
io
m
as
s/
O
D
60
0
0
control Fe3+ EDTA-Fe3+ PCIH
12 h 24 h
图 4 菌株 Z158 在不同铁源下的生物量
0.8
0.4
0.5
0.6
0.7
0.3
0.2
0.1S
id
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on
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O
D
40
2
0
control Fe3+ EDTA-Fe3+ PCIH
12 h 24 h
图 5 菌株 Z158 在不同铁源下的铁载体产量
SU 值均在 60% 以上。Pseudomonas.fluorescens sp-f 是
目前发现的铁载体产量最大的假单胞菌株，SU 值高
达 90.0%［11］，但菌株的 SU 值和对致病菌的抑制效
果不具有线性关系，也就是说即使 SU 值很大，也
有可能无抑菌作用［15］。例如，从稻田中筛选的能有
效地抑制 Sarocladium oryza 的生长，但 SU 只有 70%
左右［16］。文献报道铁载体的抑菌机制主要是 ：（1）
病原菌自己不产生铁载体或产生量小，不能与铁结
合或结合能力很弱 ；（2）生防菌可以利用病原菌产
生的铁载体，而病原菌不能利用生防菌产生的铁载
体［17］。而且假单胞菌属分泌 pyoverdine 铁载体，该
铁载体不能被本属以外的其他菌株吸收利用，使得
假单胞菌在生物防控方面具有很大的优势。本研究
筛选到的 13 株 PSSP 菌株，只有 P. aeruginosa Z158
产生的铁载体对 4 种常见致病菌都有抑制作用。
铁是微生物正常生长所需要的一种重要微量
元素，当铁营养供给不足，微生物的生长也受到限
制，因此可通过微生物的生长情况反映微生物对不
同形式铁源的利用效果［2］。当铁以不溶性矿物质形
式存在时，微生物产生的铁载体对不溶性铁矿物质
中铁的溶解度和溶解速率极其重要［18］。交替单胞
菌 Alteromonas haloplanktis 产生的铁载体在 pH 4.0、
ICC=12.9 μmol/L 时，使针铁矿和 PCIH 的溶解速率
增大至 9.5 nmol/h/m2 和 3.4 nmol/h/m2［8］；门多萨假
单胞菌 Pseudomonas mendocina 在无铁对照、天然含
铁的高岭土和 30 μmol/L EDTA-Fe3+ 中的 OD600 逐渐
增加，但每个细胞分泌的铁载体产量却逐渐降低［19］。
本研究中，菌株 Z158 在 PCIH 为唯一铁源的培养条
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9182
件下，产生高于无铁对照的铁载体量促进 PCIH 中
的铁元素的溶解，使 12 h 和 24 h 下 OD600 比无铁条
件分别升高了 26.6% 和 46.1%，说明 Z158 产生的铁
载体能促进不溶性 PCIH 中的铁溶解，进而为自身
生长利用。
4 结论
本研究筛选到的 P. aeruginosa Z158 产生的铁载
体可促进不溶性铁化合物的溶解，能够为自身和一
些植物的生长提供铁营养，同时还能抑制致病菌的
生长，菌株 Z158 可作为潜在的生防菌株用于植物疾
病防控和促进植物的生长。
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（责任编辑 李楠）