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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
芽胞杆菌属（Bacillus）属于细菌界（Bacteria），
厚壁菌门（Firmicutes），杆菌纲（Bacilli），芽胞杆
菌目（Bacillales），芽胞杆菌科（Bacillaceae），是一
类好氧或兼性厌氧、产芽胞的革兰氏阳性杆状细菌。
芽胞杆菌可以产生多种多样的活性物质，在工业、
农业、医学、环境等领域有着重要的经济价值。由
于芽胞杆菌的重要应用价值，研究其分类地位对其
应用有着更重要的研究意义。芽胞杆菌属内包含着
许多生理生化特征迥异的类群，传统的方法很难区
分一些相似性很近的菌种。1963 年，Able 等 ［1］首
次提出证据表明细胞脂肪酸可以成功地鉴定细菌。
收稿日期 ：2012-12-27
基金项目 ：国家“973”项目前期研究专项（2011CB111607），农业部“引进国际先进农业科学技术”重点项目（“948”项目）（2011-G25）
作者简介 ：刘国红，女，博士研究生，研究方向 ：芽胞杆菌分类及其功能 ；E-mail ：liuguohong624@sina.com
通讯作者 ：刘波，男，博士，研究员，研究方向 ：农业微生物技术 ；E-mail ：liubofaas@163.com
芽胞杆菌属种类脂肪酸鉴定的可靠性研究
刘国红1，2  刘波1  林乃铨2
（1. 福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003 ；2. 福建农林大学，福州 350002）
摘 要 ： 选取 10 种芽胞杆菌模式菌株，分别进行不同重复检测次数的脂肪酸鉴定。从脂肪酸鉴定结果、相似指数 SI、脂肪
酸含量和聚类分析 4 个角度研究了芽胞杆菌属种类脂肪酸鉴定的可靠性。通过脂肪酸鉴定，10 种芽胞杆菌可以准确地鉴定到种。
鉴定指数 SI 与脂肪酸含量具有相关性，与重复检测次数无关，可得出脂肪酸鉴定指数重复性较好。芽胞杆菌属种类的脂肪酸组成
和含量基本无变化或者变化很小，聚类分析发现重复检测次数对芽胞杆菌的种分类地位无影响。研究结果表明芽胞杆菌脂肪酸鉴
定具有较好的可靠性。
关键词 ： 芽胞杆菌 脂肪酸 可靠性 Sherlock MIS 系统
Reliability Study on the Genus Bacillus Species Based on Fatty
Acid Identification
Liu Guohong1，2 Liu Bo1 Lin Naiquan2
（1. Institue of Agricultural-Resource Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350003 ；2. Fujian Agriculture and
Forest University，Fuzhou 350002）
Abstract:  In this study, 10 type Bacillus species were selected and carried out a different repeats of fatty acid respectively using Sherlock
MIS system. From the identitication results, similarity index（SI）, fatty acid content and clustering analysis, it was showed that all species
were accurately identified as species level, SI had a good reproducibility, the fatty acid content was little changed in each pepetition, and was
no effection on the taxonomic status of Bacillus species by clustering analysis. Finally, the results were determined that the Bacillus fatty acid
identification had a good reliability.
Key words:  Bacillus Fatty acid Reliability Sherlock MIS system
Kaneda［2］将 22 株芽胞杆菌分为 6 个群，Kämpfer［3］
证明脂肪酸生物标记具有遗传稳定性，可以作为芽
胞杆菌属种类分类鉴定的一种有效手段。Sikorski
等［4］研究 B. simplex 在以色列“进化谷”中的系统
发育关系，模拟了进化谷的生态环境，分析结果证
明微生物系统发育包含多种脂肪酸成分、基因和细
胞膜变化。
Sherlock MIS 系统是美国 MIDI 公司成功开发的
一套微生物鉴定自动化系统，该系统操作安全、简
单、快速，试验成本也相对较低。单人在 5 d 内可
以完成 200 株以上菌的提取分析工作。它主要根据
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期148
不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸的类型和含量
具有种的特异性、指示性和遗传稳定性等特性能对
微生物进行全自动鉴定和分析。菌种的脂肪酸含量
相对比较稳定，不会受外界环境的影响。该系统备
有图谱识别软件和迄今为止微生物鉴定系统中最大
的数据库资源，包括嗜氧菌 1 100 余种，厌氧菌 800
余种，酵母菌和放线菌约 300 种，共计超过 2 200 种。
本研究运用 Sherlock MIS 微生物鉴定系统，首次探
讨了芽胞杆菌脂肪酸鉴定的可靠性，旨在为脂肪酸
在芽胞杆菌分类鉴定方面的可靠性和稳定性提供科
学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 选取 10 种芽胞杆菌标准菌株作为
供试菌株，研究芽胞杆菌脂肪酸鉴定的可靠性，供
试菌株具体信息，见表 1。
表 1 供试菌株信息
序号 菌株原始编号 库存菌株编号 拉丁文名 中文名称
1 CCUG 28519 FJAT-8754 Bacillus amyloliquefaciens 解淀粉芽胞杆菌
2 CCUG 28524 FJAT-8755 Bacillus atrophaeus 矮缩芽胞杆菌
3 CCUG 7412 FJAT-8757 Bacillus badius 栗褐芽胞杆菌
4 CCUG 26016 FJAT-8779 Bacillus pumilus 短小芽胞杆菌
5 CCUG 1817 FJAT-8774 Bacillus megaterium 巨大芽胞杆菌
6 CCUG 28525 FJAT-8765 Bacillus flexus 简单芽胞杆菌
7 CCUG 7422 FJAT-8771 Bacillus licheniformis 地衣芽胞杆菌
8 CCUG 7414 FJAT-8760 Bacillus cereus 蜡状芽胞杆菌
9 DSM 2408 FJAT-8775 Bacillus mycoides 蕈状芽胞杆菌
10 CCUG 163 FJAT-8784 Bacillus subtilis 枯草芽胞杆菌
1.1.2 试剂及器材 TSB 培养基及培养管购自美国
BD 公司。气相色谱仪为安捷伦的 7890。
1.1.3 脂肪酸提取溶液 溶液 I ：NaOH 45 g，甲醇
150 mL， 超 纯 水 150 mL ；溶 液 II ：6.0 mol/L HCl，
325 mL，甲醇 275 mL ；溶液 III ：己烷 200 mL，甲
基三丁基乙醚 200 mL ；溶液Ⅳ ：NaOH 10.8 g，超纯
水 900 mL。
1.2 方法
对 10 种芽胞杆菌分别进行不同重复次数的脂肪
酸提取分析。按照 MIDI 公司微生物鉴定系统的操
作步骤［5］，新鲜待测菌株按四区划线接种至新鲜的
TSB 培养基，28℃培养 24 h。刮取 20 mg 菌体，置
于试管，加入 1 mL 溶液Ⅰ，100℃水浴 30 min。冰
浴中迅速冷却后加入 2 mL 溶液Ⅱ，混匀后 80℃水
浴 10 min。迅速冷却，加入 1.25 mL 溶液 III。震荡
10 min，吸弃下层溶液。然后加入 3 mL 溶液Ⅳ及几
滴饱和 NaCl 溶液，震荡 5 min。静置，待溶液分层后，
吸取上层液体于 GC 样品管中待测。
脂肪酸成分检测采用美国 Agilent 7890 N 型气相
色谱系统，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及
氢火焰离子化检测器 ；通过细菌细胞脂肪酸成分进
行细菌鉴定的分析软件采用 Sherlock MIS4.5（Micro-
bial Identification System）和 LGS4.5（Library Genera-
tion Software）（均为美国 MIDI 公司产品）。在下述
色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检
样本 ：二阶程序升高柱温，170℃起始，每分钟升温
5℃，升至 260℃，而后再每分钟升温 40℃，升至
310℃，维持 90 s ；汽化室温度 250℃、检测器温度
300℃ ；载气为氢气（2 mL/min）、尾吹气为氮气（30
mL/min）；柱前压 68.95 Kpa ；进样量 1 μL，进样分
流比 100∶1。
利用林营志等［6］编写的软件处理芽胞杆菌的脂
肪酸文件后提取出脂肪酸数据，然后利用生物统计
软件 SPSS16.0 进行统计分析，脂肪酸树状图采用欧
式距离进行构建，脂肪酸成分分布图采用 Excel 进
行构建。
2 结果
2.1 芽胞杆菌种类脂肪酸鉴定结果的可靠性分析
为了确定 MIDI 鉴定结果的重复性是否可靠，对
每种菌分别进行了不同重复次数鉴定。表 2 为模式
2013年第6期 149刘国红等 ：芽胞杆菌属种类脂肪酸鉴定的可靠性研究
菌株按 MIDI 推荐的方法进行的鉴定结果，10 种芽
胞杆菌均准确的鉴定到了种。10 种芽胞杆菌脂肪酸
检测重复性较好，鉴定结果第一匹配值都准确。以
上分析结果说明 MIDI 鉴定系统的准确性和重复性
表 2 芽胞杆菌的 MIDI 检测鉴定结果
种名 重复次数 相似系数（SI） 鉴定结果
准确鉴定（是 / 否）
属 种
B. amyloliquefaciens 1 0.807 B. amyloliquefaciens 是 是
2 0.755 B. amyloliquefaciens
B. atrophaeus 1 0.769 B. atrophaeus 是 是
2 0.946 B. atrophaeus
3 0.858 B. atrophaeus
B. badius 1 0.291 B. badius 是 是
2 0.253 B. badius
B. pumilus 1 0.770 B. pumilus 是 是
2 0.762 B. pumilus
B. megaterium 1 0.710 B. megaterium 是 是
2 0.687 B. megaterium
B. flexus 1 0.505 B. flexus 是 是
2 0.595 B. flexus
3 0.552 B. flexus
B. licheniformis 1 0.666 B. licheniformis 是 是
2 0.611 B. licheniformis
3 0.730 B. licheniformis
B. cereus 1 0.672 B. cereus 是 是
2 0.559 B. cereus
3 0.697 B. cereus
4 0.725 B. cereus
5 0.729 B. cereus
B. mycoides 1 0.435 B. mycoides 是 是
2 0.508 B. mycoides
3 0.499 B. mycoides
4 0.459 B. mycoides
B. subtilis 1 0.782 B. subtilis 是 是
2 0.783 B. subtilis
3 0.767 B. subtilis
4 0.764 B. subtilis
5 0.749 B. subtilis
6 0.764 B. subtilis
7 0.771 B. subtilis
8 0.741 B. subtilis
较好。
2.2 芽胞杆菌种类脂肪酸鉴定相似指数SI的可靠
性分析
不同重复次数得到的芽胞杆菌脂肪酸鉴定相似
性指数（表 2）显示，10 种芽胞杆菌的脂肪酸鉴定
相似性指数 SI 除了栗褐芽胞杆菌（B. badius）基本
都在 0.5 以上，栗褐芽胞杆菌的 SI 值低于 0.3。
利 用 SPSS16.0 统 计 分 析 可 知，SI 与 脂 肪 酸
17∶0 iso、17∶0 anteiso、15∶0 anteiso 的含量成正相
关，与 14∶0、16∶0、12∶0 iso、19∶0 iso、16∶1
ω11c、13∶0 anteiso、17∶1 anteiso a、18∶0 iso、
12∶0、17∶1 iso ω10c、13∶0 iso、16∶1 ω7c
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期150
alcohol、Summed Feature 4 和 Summed Feature 3 的含
量成负相关性，后几种的脂肪酸含量很小且只有少
数菌株含有。SI 与 17∶0 iso 的 SD（标准差）成正相
关，与 17∶1 anteiso a 的 SD 负相关，17∶1 anteiso a
仅存在栗褐芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌群中且含量占
很小比例，SI 与脂肪酸重复检测没有很大的相关性。
2.3 芽胞杆菌种类脂肪酸鉴定脂肪酸成分的可靠
性分析
10 种芽胞杆菌分别进行了不同重复次数的脂
肪酸鉴定，检测到的脂肪酸含量和组成统计，见表
3。10 种芽胞杆菌共检测出 28 种的脂肪酸标记，包
含 25 种已知和 3 种 Summed Feature 型脂肪酸。主要
脂 肪 酸 为 17∶0 iso、16∶0、16∶0 iso、15∶0 iso、
15∶0 anteiso 和 17∶0 anteiso， 含 量 范 围 2%-60%
之间。由图 1 可以看出，10 种芽胞杆菌重复检测得
到的脂肪酸颜色标记基本相同，即芽胞杆菌种类重
复鉴定得到的脂肪酸组成和含量基本相同。
栗褐芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌的各种脂肪酸含
量的 SD<0.5，说明每次脂肪酸检测的变化范围很小。
地衣芽胞杆菌的脂肪酸含量的 SD 基本 <0.5，巨大
芽胞杆菌的 SD 基本 <5，短小芽胞杆菌的 SD<0.5，
简单芽胞杆菌的 SD<0.8，枯草芽胞杆菌的 SD<1，
蜡状芽胞杆菌的 SD<1，解淀粉芽胞杆菌的 SD<1.5，
矮缩芽胞杆菌的 SD<2。结果表明，芽胞杆菌种类的
脂肪酸组成和含量不受检测重复次数的影响，具有
很高的可靠性。
15:0 iso
18:0 iso
16:1 wllc
18:1 w9c
16:1 w7c alcohol
17:1 anteiso a
19:0 iso
17:0 iso
15:0 anteiso
12:0 anteiso a
15:1 w5c
12:0 iso
15:0 2OH
17:0 anteiso
18:00 w5c
14:0 iso
Feature 4
14:00
15:0 iso 3OH
16:00 iso
Feature 3
17:1 iso w10c
17:1 iso w5c
17:00
Feature 2
13:0 iso
13:0 anteiso
16:0 iso
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
B. atrophaeus_1
B. atrophaeus_2
B. atrophaeus_3
B. flexus_3
B. licheniformis_3
B. megaterium_2
B. pumilus_2
B. subtilis_8
B. badius_2
B. cereus_5
B. mycoides_4
B. mycoides_3
B. mycoides_2
B. mycoides_1
B. cereus_4
B. cereus_3
B. cereus_2
B. cereus_1
B. badius_1
B. subtilis_7
B. subtilis_6
B. subtilis_5
B. subtilis_4
B. subtilis_3
B. subtilis_2
B. subtilis_1
B. pumilus_1
B. megaterium_1
B. licheniformis_2
B. licheniformis_1
B. flexus_2
B. flexus_1
B....
B....
图 1 芽胞杆菌脂肪酸组成分布图
2013年第6期 151刘国红等 ：芽胞杆菌属种类脂肪酸鉴定的可靠性研究
表
3

芽
胞
杆
菌
不
同
重
复
次
数
的
脂
肪
酸
成
分
PLFAName
17
p
0 iso
18
p
1 w9c
12
p
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14
p
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p
0
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p
0
16
p
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p
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p
1 w5c
18
p
0
15
p
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17
p
1 iso w5c
13
p
0 anteiso
17
p
1 anteiso a
18
p
0 iso
12
p
0
17
p
0 anteiso
14
p
0
17
p
1 iso w10c
13
p
0 iso
16
p
1w7c alcohol
15
p
0 iso
15
p
0 anteiso
15
p
0 2OH
Feature 4
Feature 3
Feature 2
B
. a
m
yl
ol
iq
u-
ef
ac
ie
ns
12
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6
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0
1.
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.1
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0
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9
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36
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M
ea
n
11
.8
5
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0
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.6
2
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2
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SD
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B
. a
tr
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s
8.
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1.
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1.
00
12
.2
3
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.8
3
0
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0
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75
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1.
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13
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20
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4
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1.
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M
ea
n
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SD
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B
. b
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2.
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11
0.
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33
0.
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6.
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0.
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1.
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0.
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7
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0.
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20
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.1
6
0.
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0.
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.5
5
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0.
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0.
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0.
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0.
28
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.5
2
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40
1.
40
0.
20
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63
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0.
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9
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1.
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0.
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0.
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0.
10
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70
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25
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27
0.
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0.
55
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.9
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.9
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36
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0
M
ea
n
12
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0.
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SD
0.
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78
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0.
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0
0
表
3
续
表
2013年第6期 153刘国红等 ：芽胞杆菌属种类脂肪酸鉴定的可靠性研究
2.4 芽胞杆菌属种类脂肪酸的聚类可靠性分析
为了验证芽胞杆菌属种类脂肪酸分类鉴定手段
的稳定性，又对 10 种芽胞杆菌不同重复检测次数的
脂肪酸含量和组成进行了聚类分析。利用生物统计
软件 SPSS16.0，采用欧式距离构建芽胞杆菌的脂肪
酸聚类图。由图 2 可以看出，不同重复次数的 10 种
芽胞杆菌以种为单位均聚在一起，同时相同类群的
芽胞杆菌属种类也聚为一类，如蜡状芽胞杆菌类群
（蜡状芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌）和枯草芽胞杆菌类
群（枯草芽胞杆菌、矮缩状芽胞杆菌、简单芽胞杆菌、
地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌）。由此说明，脂肪
酸可以作为芽胞杆菌属种类分类的一种手段。
B. subtilis_3
B. subtilis_6
B. subtilis_4
B. subtilis_7
B. subtilis_1
B. subtilis_2
B. subtilis_5
B. subtilis_8
B. atrophaeus_1
B. atrophaeus_2
B. atrophaeus_3
B. flexus_2
B. flexus_3
B. flexus_1
B. licheniformis_1
B. licheniformis_2
B. licheniformis_3
B. amyloliquefaciens_1
B. amyloliquefaciens_2
B. megaterium_1
B. megaterium_2
B. mycoides_1
B. mycoides_4
B. mycoides_3
B. mycoides_2
B. cereus_3
B. cereus_5
B. cereus_1
B. cereus_4
B. cereus_2
B. pumilus_1
B. pumilus_2
B. badius_1
B. badius_2
29
32
30
33
27
28
31
34
3
4
5
14
15
13
16
17
18
1
2
19
20
21
24
23
22
10
12
8
11
9
25
26
6
7
Label Num
0 5 10 15 20 25
图 2 芽胞杆菌脂肪酸聚类分析图
3 讨论
芽胞杆菌属大多数种类是重要的微生物资源，
在各个领域皆有重要的科学价值和经济价值。由于
芽胞杆菌种类繁多，许多种相似性非常高，很难用
分子手段准确地鉴定到种。因此，这就需要一种新
的分类鉴定方法来研究芽胞杆菌属的分类鉴定。
芽 胞 杆 菌 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 具 有 很 高 的 可 靠
性。Abel 等［1］ 早在 1963 年就指出脂肪酸可用于
细菌鉴定，随后也有很多学者从事于脂肪酸鉴定
研究，也有不少研究者认为它可靠性不高，鉴定
结果不稳定。但没有人系统地研究芽胞杆菌属种
类的脂肪酸鉴定可靠性。因此，本研究选取了不
同属的 10 种芽胞杆菌，利用 Sherlock MIS 系统进
行不同重复次数的脂肪酸检测，对芽胞杆菌脂肪
酸检测的可靠性进行了分析研究。本研究从脂肪
酸的鉴定匹配结果、SI 指数、含量和聚类分析数
据发现，脂肪酸用于芽胞杆菌分类鉴定有着较高的
可靠性，并且与前人的研究结果具有较高的一致
性。刘波［7］出版的《微生物脂肪酸生态学》，主要
以本实验室分离鉴定的芽胞杆菌种类为例，分析了
脂肪酸鉴定结果的准确性，研究发现脂肪酸可以
作为芽胞杆菌快速鉴定的手段［8］，与本研究结果
一致。张晓霞等［9］利用脂肪酸成分对不动杆菌进
行分类鉴定，结果表明通过脂肪酸也可以准确地
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期154
将不动杆菌鉴定到种。吴愉萍等［10］也将 Sherlock
MIS 系 统 应 用 于 土 壤 细 菌 鉴 定 的 研 究， 结 果 表
明该系统可以将分离菌株准确的鉴定到种，甚至可
以进行种下分化鉴定分析。Whittaker［11］研究证明脂
肪酸分析可以快速灵敏的鉴定 Francisella tularensis。
芽胞杆菌脂肪酸鉴定指数的可靠性高。MIDI 手
册说明，当 SI 值 <0.30 时，认为该菌株不存在于数
据库中，但软件会给出一个最相关的菌株。若 SI 值
在 0.30-0.50 之间，且第一选择和第二选择的 SI 差
值 >0.10，则表明鉴定可能成功，但是第一选择所列
的菌种为非典型菌株。当 SI 值 >0.50 以上，且第一
选择和第二选择的 SI 差值 >0.10，则认为鉴定成功，
鉴定结果为第一选择所列的种名。根据 MIDI 鉴定结
果发现 10 种芽胞杆菌的鉴定指数基本在 0.50 以上，
第一与第二匹配间的 SI 差值 >0.10，或者仅有一个
匹配，表明供试菌株皆准确地鉴定到了种。栗褐芽
胞杆菌的脂肪酸鉴定相似性指数低于 0.30，但仍准
确地鉴定到了种，表明不需要 SI 值达到 0.50 以上就
可以准确鉴定种。黄朱梁等［12］用 Sherlock MIS 微生
物自动鉴定系统鉴定了从贻贝中分离的蜡状芽胞杆
菌，并用生理生化鉴定和 PCR 鉴定验证了该方法的
准确性。
芽胞杆菌脂肪酸组成和含量具有很高的可靠性。
10 种芽胞杆菌的脂肪酸含量重复检测的 SD（标准误
差范围）很小，受重复检测次数的影响很小，利用
生物统计软件进行聚类分析也证明脂肪酸用于芽胞
杆菌鉴定具有很高的准确性和可靠性。邝玉斌等［13］
通过气相色谱对 10 种芽胞杆菌模式菌株的细胞脂肪
酸组分及其含量进行分析，研究表明脂肪酸组分是
芽胞杆菌种类分类的重要指征。Diogo 等［14］研究发
现利用脂肪酸利用区分 Legionella 属大部分种类，利
用脂肪酸成分建立准确的该属细菌自动鉴定系统。
4 结论
选取的 10 种芽胞杆菌标准菌株均可准确地鉴
定到种，相似指数（SI）与脂肪酸含量具有相关性，
与重复检测次数无关，脂肪酸含量基本无变化或者
变化很小，聚类分析发现重复检测次数对芽胞杆菌
的种分类地位无影响，表明芽胞杆菌脂肪酸鉴定具
有较高的可靠性。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）