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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
DBY（DDX3Y，DEAD box on the Y）基因是精
子发生中起关键性作用的基因之一，在动物繁殖育
种中起着重要作用［1，2］。它位于哺乳动物 Y 染色体
的 AZFa 区［3，4］，是 AZFa 区最主要的候选基因。编
码一个 ATP 依赖性 RNA 解螺旋酶，属于 DEAD（天
冬氨酸 -谷氨酸 -丙氨酸 -天冬氨酸序列）盒蛋白家
族的成员，参与细胞的各种过程，包括剪接，核
糖 体 合 成 和 RNA 降 解 等［5］。 人 的 DBY 基 因 位 于
USP9Y 基因下游 45 kb 处，含有 17 个外显子，其编
收稿日期 ：2012-12-28
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（31072005）
作者简介 ：肖红梅，女，博士研究生，副教授，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：lhtdyx@126.com
通讯作者 ：李金泉，男，教授，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：lijinquan_nd@126.com
绒山羊 DBY 基因的 BAC 筛选与序列分析
肖红梅1  肖旭2  刘志红3  李金泉3
（1. 内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特 010018 ；2. 内蒙古师范大学基础教育学院，呼和浩特 010020 ；
3. 内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018）
摘 要 ： 绒山羊是我国一种独特的生物资源，是经过长期的自然选择和人工选育而成的目前世界上产绒量最高、绒纤维品
质最好的品种，所以提高绒山羊的繁殖力，对经济的发展有着非常重要的意义。运用 PCR 技术，对绒山羊 Y 染色体上控制精子生
成的 DBY 基因进行 BAC 文库筛选、克隆、鉴定、测序，得到 240 bp 的 DBY 基因片段。与 GenBank 收录的其他物种进行序列比对，
结果显示，与绵羊序列的同源性达 96%，与坡鹿、水牛的同源性达 93% ；与猪鹿、瘤牛和牛的同源性分别达 92% 和 91% ；而与人
和黑猩猩及小鼠的序列无同源性，共编码 52 个氨基酸。物种间 NJ 的聚类结果与其在系统分类学的地位相一致。
关键词 ： 绒山羊 DBY BAC 序列分析
Screening and Sequence Analysis of Cashmere Goat DBY
Xiao Hongmei1 Xiao Xu2 Liu Zhihong3 Li Jinquan3
（1. College of Life Science，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018 ；2. College of General Education，Inner Mongolia
Normal University，Hohhot 010020 ；3. College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018）
Abstract:  Cashmere goat is a unique biological resource in China. After a long period of natural selection and artificial breeding,
Cashmere goat has best fiber quality and higher cashmere yields at present in the world. Therefore, the high reproductive rate of Cashmere goat
is essential for developing economy. In this experiment, 240 bp gene fragment was obtained, though screening from Cashmere goat BAC library,
cloning, and identifying DBY gene controlling spermatogenesis on the Y chromosome by PCR. Then the sequence of Cashmere goat was compared
with other species from GenBank. The results showed Cashmere goat has homology of 96% with Ovis aries, homology of 93% with Cervus eld
and Bubalus bubalis. The homology is up to 92% and 91% with Axis porcinus, Bos indicus and Bos teurus, respectively, no homology with the
human, chimpanzee and mouse. The sequence fragment encodes 52 amino acids. The clustering consequence of species NJ consistent with the
taxonomic status.
Key words:  Cashmere goat DBY BAC Sequence analysis
码的 mRNA 在睾丸组织中特异表达，主要见于精子
和粗线期的精母细胞中，DBY 的缺失可导致生精细
胞的严重减少甚至完全缺乏，显示的病理性表型为
生精细胞生长障碍，而且在 AZFa 区中 DBY 的缺失
率比 USP9Y 高［6-8］。Kleiman 等［9］通过无精症患者
组织检查发现 ：精子发生障碍时，DBY 基因转录物
表达不足。因此，DBY 基因微缺失在 AZFa 区缺失
类型中极具代表性。Foresta 等［8］在对精子生成障碍
患者进行睾丸活检时发现，DBY 缺失的患者表现为
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期90
I 型唯支持细胞综合征和小睾丸症，即仅有支持细
胞而无精原细胞。同时在对小鼠体的同源基因 DBY
研究也同样发现，DBY 的缺失导致小鼠精子发生障
碍［10，11］，证明了 DBY 对睾丸精子发生的重要作用。
但迄今为止，DBY 基因在生殖细胞发育中的具
体作用还不清楚。为此，国内外的一些专家对哺乳
动物 DBY 基因进行了研究，但由于 Y 染色体结构
复杂，存在大量的重复序列，难于组装，所以研究
的物种很少，大量集中于对人的研究，而对绒山羊
的研究尚未见报道。因此，本试验对绒山羊 Y 染色
体 DBY 基因进行了筛选与测序，旨在为进一步研究
DBY 基因在绒山羊 Y 染色体上的定位、分析其在精
子发生中的作用机理以及基因进化提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
绒山羊 BAC 文库由内蒙古农业大学动物遗传育
种实验室提供，血液采集于鄂尔多斯羊场随机选取
的 10 头绒山羊（5 公，5 母）的颈静脉血。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的制备 选 100-120 μL 抗凝血加
双蒸水至 1.5 mL，充分混匀，冰浴 10 min 后 12 000
r/min 离心 1 min，弃上清，向下层沉淀中加 100 μL
双蒸水使之充分 悬浮， 煮 沸 10 min， 立 即 冰 浴 5
min，以 12 000 r/min 离心 5 min，取上清于另一个离
心管即可用于 PCR 检测，于 -20℃保存备用。
1.2.2 引物设计 以 GenBank 收录的牛的 DBY 序列
为模板，应用软件 Primer 设计引物并由上海生物工
程有限公司合成。上游引物序列 ：5-tcatctgttggaacttt-
tc-3 ；下游引物序列 ：5-atctccttggttttagcc-3。
1.2.3 PCR 扩增条件 以建库的内蒙古绒山羊基
因组为模板，通过正交拉丁设计方法确定 DBY 基
因最佳的 20 μL PCR 反应体系为 ：上下游引物（10
pmol/μL）各为 0.5 μL，绒山羊基因组 DNA 模板（30
ng/μL）1.1 μL，10×buffer 2 μL，dNTP 2.1 μL，Taq
DNA 聚合酶 0.3 μL，超纯水 13.5 μL。PCR 反应循环
程序 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 45 s，58℃退火
45 s，72℃延伸 45 s，32 个循环；72℃延伸 5 min，4℃
保存。PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 超级池的筛选 根据已确定的扩增条件，以
绒山羊基因组 BAC 文库的超级池 DNA 为模板，加
一个阳性对照（以已扩增出的基因组为模板）、一个
阴性对照（以灭菌超纯水为模板）和一个绒山羊的
雌性基因组对照，进行 PCR 反应，用 1.5% 琼脂糖
凝胶电泳检测 PCR 产物，筛出 DBY 基因所在的二
级池编号。
1.2.5 二级池筛选 以超级池筛选出的阳性二级池
DNA 为模板，通过 PCR 反应（反应条件同筛选阳性
超级池的条件）筛选 DBY 基因所在的板池、行池、
列池，并加阴阳性对照。PCR 产物用 1.5% 琼脂糖
凝胶电泳检测，获得二级池的板池、行池、列池的
阳性克隆编号。
1.2.6 阳性克隆、测序 依照二级池的 PCR 筛选结
果，确定 DBY 基因阳性克隆在 BAC 文库中的位置，
从 -80℃冰箱中取出冻存的菌样，挑取文库中的目的
菌落，在含有氯霉素（12.5 μg/mL）的 LB 平板上划线，
37℃恒温培养，得到包含 DBY 基因的阳性单克隆并
鉴定。然后把 PCR 产物纯化、回收，连接到 T 载体
上，并将连接产物转化到大肠杆菌中，通过蓝白斑
筛选，将阳性克隆进行划线培养并进行菌体 PCR 阳
性检测。对检测得到的阳性克隆菌液培养过夜，将
菌液送交上海生工进行测序。
1.2.7 系统进化树的构建 利用 Mega5 软件，根据
与山羊同源物种的 DBY 基因序列建立物种间的 NJ
系统树（Neighbour-joining tree），进行进化分析。
2 结果
2.1 超级池筛选
以稀释 10 倍的超级池 DNA 为模板 54℃扩增，
扩增产物用 1.5% 琼脂糖凝胶进行检测，在凝胶成
像系统下观察 PCR 扩增情况，结果如图 1 所示。从
凝胶电泳图可以看出，通过 PCR 扩增得到阳性二
级池有两个，分别为 S21（泳道 5）和 S24（泳道
8），经过多次检验，最终确定 S21 为所需条带。其
条带单一而且明亮并与雌性对照条带大小不同。扩
增的片段大小为 240 bp 左右。
2.2 二级池筛选
将 阳 性 二 级 池 S21 稀 释 10 倍 后， 取 4 μL 做
PCR 模板，扩增二级池。PCR 反应条件同超级池。
扩增产物用 1.5% 琼脂糖凝胶进行检测，结果如图 2
2013年第7期 91肖红梅等 ：绒山羊 DBY 基因的 BAC 筛选与序列分析
所示。
300
bp
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1718 19 2021 22 2324
M ：1000 bp ladder marker ；1-21 ：BAC 文库基因组模板 ；22 ：阴性对照 ；
23 ：阳性对照 ；24 ：雌性对照
图 1 DBY 超级池筛选
100
bp
bp
100
M 1 2 43 5 6 19 20 21 22 23 24
M 28 29 30 313225 2627 33 34 35 36 37 38 39 40 4142 4344 45 464748
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
M ：1000 bp ladder marker ；1-16 ：为 S29 池的行池 ；17-20 ：S29 池的 4 列池 ；
21-26 ：S29 池的 6 列池 ；27-46 ：S29 池的板池 ；47 ：阴性 ；48 ：阳性
图 2 DBY 二级池筛选
根据 S21 池行、列、板池的定位结果，得到
DBY 基因在基因组 BAC 文库中的位置为行池 D、4
列池 3、6 列池 6、板池 5，定位于 405D22。
2.3 菌体PCR鉴定
从文库中找到 405D22 的阳性克隆，在 1 mL 的
LB 培养基（加有氯霉素 12.5 μg/mL）中，37℃恒温
培养 24 h，之后做菌体 PCR 鉴定。为得到更好的克
隆结果排除假阳性，菌落 PCR 时，做了 3 个平行的
菌落，结果（图 3）显示，所得到的菌体 PCR 产物
条带很清晰，且与目的条带大小一致，可鉴定出获
得的单克隆为阳性。然后选取条带最清晰的菌，进
行后续的胶回收工作。
M 1 2 3 4 5
100
bp
M ：1000bp ladder marker ；1-3 ：405D22 菌体 PCR 产物 ；
4 ：阴性对照 ；5 ：阳性对照
图 3 DBY 菌体 PCR 鉴定
2.4 PCR产物回收、菌体重组质粒鉴定
将菌体 PCR 产物（图 4）切胶回收、纯化后，
用紫外 - 可见分光光度计检测 DNA 纯度，OD 值
（A260/A280）为 1.87，胶回收效果较好，可用于亚克
隆鉴定。
M21
300
bp
1，2 ：胶回收 PCR 产物 ；M ：1000 bp ladder marker
图 4 胶回收电泳检测
2.5 克隆鉴定
将回收的菌体 PCR 产物用 pEASY-T1 载体连接，
转化后，37℃培养过夜，挑取单克隆划线，做菌体
PCR 鉴定阳性克隆，结果如图 5 所示，菌体 PCR 产
物条带与目的基因条带一致，清晰可见，说明转化
成功，可用于亚克隆测序。
M 1 2
100
bp
M ：1000bp ladder marker ；1，2 ：菌体 PCR 产物
图 5 DBY 克隆鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期92
2.6 DBY克隆测序
经序列测序，得到引物扩增基因组产物片段长
度为 240 bp，序列碱基组成如图 6 所示。该序列中
A+T 和 G+C 含量分别为 70% 和 30%，A+T 的含量
相对较高。与 GenBank 收录的其他物种序列进行比
对 ：与绵羊 DBY 基因的同源性为 96% ；与坡鹿、水
牛的同源性达 93% ；与猪鹿、瘤牛和牛的同源性分
别达 92% 和 91% ；而与人和黑猩猩及小鼠的序列无
同源性。此片段长为 240 bp，包括长为 186 bp 的内
含子和 54 bp 的外显子，共编码 52 个氨基酸。筛选
出的 BAC 为 Y 染色体基因组片段。
行池 16 个，4 列池 4 个，6 列池 6 个，共有 288 个
行池、180 个列池、360 个板池，含有 27×104 个克
隆［12］，因此精确的定位对于获得正确的阳性克隆至
关重要。本研究在 BAC 文库的定位 PCR 筛选过程中，
由于文库具有 11.8 倍的覆盖率，所以首先必须保证
合适浓度的筛库工作液，其次要有优化的扩增体系
和扩增条件，因此需要对扩增的体系和条件进行大
量的摸索工作，得到最优化体系。但由于在设计引
物时，没有山羊的模板序列，选用 GenBank 收录的
牛 DBY 基因序列设计引物，引物的特异性不强，在
进行 PCR 扩增时，体系难以建立，所以在筛库中，
基因难以定位。为了加快筛库速度，提高效率，采
用正交拉丁方优化体系，并经过验证，方法可行。
通过优化的扩增体系和条件所得的阳性克隆经测序
为目的克隆。而且此研究获得的 Y 染色体 DBY 基
因片段填补了山羊该基因序列空白。通过序列比对，
DBY 基因在牛科动物中具有一定的保守性，而与其
他物种的保守性很差，尤其与人和黑猩猩及小鼠的
序列无同源性，而人和小鼠之间 DBY 却有较高的相
似性［6］。NJ 系统进化树得出山羊、绵羊、水牛等物
种间在 NJ 系统进化树中所反映的亲缘关系同其在分
类学中的位置基本一致［13］。Foresta 等［6］在对人类
Y 染色体 AZFa 区基因进行研究时发现 DBY 有 17 个
外显子，编码一个 ATP 依赖的 RNA 解旋酶，属于
DEAD BOX（Asp-Glu-Ala-Asp）家族。但本研究所
得的片段中编码序列无天冬氨酸编码，与其有差异。
这可能是由于克隆片段的编码序列太短，基因序列
不完整造成的，也可能是由于山羊和人及小鼠的同
源性差，编码序列不同的缘故。因此，山羊的 DBY
基因的结构、进化及功能还有待进一步研究。后续
将对获得的 405D22 BAC 测序，并对测序序列进行
生物信息学分析。并以此 BAC 末端序列为模板设计
引物，进行绒山羊 Y 染色体其他 BAC 的筛选，获得
山羊 Y 染色体功能区序列，逐步构建 Y 染色体序列
的 contig。
4 结论
首次获得山羊 Y 染色体 DBY 基因片段 240 bp，
共编码 52 个氨基酸 ；其与绵羊、牛的同源性较高，
而与人、黑猩猩及小鼠无同源性 ；经鉴定筛选出的
㔥㖺Ovis ariesኡ㖺Capra hircus
⢋Bos taurus
⌠ഭඑ咯Cervus eldi siamensis
㔵⭨එ咯Cervus eldi thamin⥚咯Axis porcinus≤⢋Bubalus bubalis
䟾⢋Bison bisonⱔ⢋Bos indicus
0.1
TCATCTGTTGGAACTTTTCTTTCAAGTAAATATACTTACTTTCTT
TAGTCTGTTAAGTCAATAAAAGTTCATTTTCAAAGGTAGTTCTT
AAATTATAGAGGGGATTTTATTGTCACAGACTCTAGAATTGAAT
AGAAAAAGATTTTAATCTTTGAGCTTAATTTATAAATTGTACTT
AATTCTTAGGAAAATGGAAGGCATGGACGCCGTAAACAGTATC
CAATCTCCTTGGTTTTAGCC
图 6 DBY 碱基序列
图 7 哺乳动物偶蹄目 DBY 基因 NJ 系统进化树
2.7 进化分析
从构建的 NJ 系统进化树（图 7）可看出，首先
山羊和绵羊、野牛和瘤牛的亲缘关系最近，分别属
于哺乳动物偶蹄目、牛科羊亚科和牛亚科 ；其次是
泰国坡鹿和缅甸坡鹿的亲缘关系较近，属于偶蹄目
的鹿科、鹿亚科 ；最后，它们与属于猪科的猪鹿、
牛科的水牛聚为一类，亲缘关系相对较远。
3 讨论
本实验室构建的绒山羊细菌人工染色体 BAC 文
库保存在 720 个 384 孔板中，每个超级池由 20 个
384 孔板组成。以超级池为单位提取文库 DNA，分
别得到超级池 DNA 36 个，二级池 DNA 1 656 个，每
一个超级池含有二级池 DNA 46 个，其中板池 20 个，
2013年第7期 93肖红梅等 ：绒山羊 DBY 基因的 BAC 筛选与序列分析
405D22 基因组 BAC 为山羊 Y 染色体 BAC。
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（责任编辑 马鑫）