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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
冬虫夏草（Ophicordyceps sinensis）是冬虫夏草
菌寄生在蝙蝠蛾科幼虫上形成的昆虫和子座的复合
体，其形成和成熟过程中伴随着多种其它微生物的
生长，这些微生物可产生多种功效性成分，能有效
提升冬虫夏草的保健和医药功能，在野生冬虫夏草
的形成过程中起着重要的作用［1，2］。
近年来，关于冬虫夏及其微环境中微生物的
研究已有大量文献报道，但主要集中在真菌方面
的研究。目前已经解决了冬虫夏草无性型方面的
问 题， 并 有 10 多 种 功 能 真 菌 被 开 发 利 用， 如 中
收稿日期 ： 2014-03-05
基金项目 ：国家微生物资源平台专项（NIMR2014-4），青海省科技计划项目（2012-N-142，2012-N-153），中国食品发酵工业研究院科技发
展基金（博士基金）项目（2012KJFZ-BS-01）
作者简介 ：李辉，硕士，工程师，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：lihui@china-cicc.org
通讯作者 ：程池，男，教授级高级工程师，博士生导师，研究方向 ：食品工业微生物菌种资源管理与鉴定评估 ；E-mail ：cheng100027@163.com
野生冬虫夏草伴生细菌群落结构及多样性分析
李辉1  刘洋1  白飞荣1  姚粟1  扎西·才吉2  程池1
（1. 中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015 ；2. 玉树藏族自治州三江源药业有限公司，玉树 810003）
摘 要 ： 采用基于 PCR 扩增的变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术，研究 8 种不同地理来源野生冬夏草中伴生细菌的群
落结构，通过优势条带切胶测序分析，确定了不同来源冬虫夏草伴生优势细菌的种属信息，分析结果表明冬虫夏草中细菌群落多
样性丰富，不同来源冬虫夏草的细菌多样性指数（H’）、丰度（D）和均匀度（J）均有所不同，且伴生细菌群落相似性与样品产地
间的距离远近呈一定的正相关。本研究还发现了冬虫夏草样品中的 4 种共有细菌 Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、
Geobacillus pallidus 和 Methylovirgula ligni，为进一步研究伴生细菌在冬虫夏草生长发育中所起的作用奠定了基础。
关键词 ： 冬虫夏草 16S rRNA V3 区 DGGE 细菌群落
Analysis of Bacterial Community Structure and Diversity in Wild
Ophicordyceps sinensis
Li Hui1 Liu Yang1 Bai Feirong1 Yao Su1，2 Zahi Nagi2 Cheng Chi1
（1. Chinese Research Institute of Food and Fermentation Industries Chinese industrial culture collection center，Beijing 100015 ；2. Yushu
Tibetan Autonomous Prefecture of Sanjiang Source Pharmaceutical Co Ltd，Yushu 810003）
Abstract: The bacterial community structure of eight wild Ophicordyceps sinensis were investigated using PCR-DGGE.DNA sequencing
was proceeded to obtain dominant bacterial population information in different samples. The result of DGGE profile showed that all the samlples
contained abundant bacterial community, different samples have some differences among the Shannon-winner index, Richess and evenness,
significant differences were observed between samples from distinct locations. Flavihumibacter petaseus, Sphingomonas aestuarii, Geobacillus
pallidus and Methylovirgula ligni were commonly detected in all samples, which laid a foundation for further studying on the roles of bacteria
during the formation process of Ophicordyceps sinensis.
Key words: Ophicordyceps sinensis 16S rRNA V3 DGGE Bacterial community
国 金 孢 霉（Chrysosporium sinense）、 蝙 蝠 蛾 被 孢
霉（Mortierella hepiali）、 中 国 拟 青 霉（Paecilomyces
sinensis）、 蝙 蝠 蛾 柱 霉（Scytalidium hepiali）、 中 国
弯 颈 霉（Tolypocladium sinense ） 和 蝙 蝠 蛾 拟 青 霉
Paecilomyces hepiali 等［3，4］。
然而，冬虫夏草存在着很多重要的细菌资源有
待去认识和开发利用。基于目前对野生冬虫夏草中
伴生细菌群落结构的研究比较缺乏的状况，本研究
采用 PCR-DGGE 技术对不同来源的野生冬虫夏草半
生细菌群落结构进行研究，旨在确定不同来源冬虫
2014年第10期 197李辉等：野生冬虫夏草伴生细菌群落结构及多样性分析
夏草中的群落差异和共有细菌菌群，旨为冬虫夏草
伴生细菌资源的挖掘与保护奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
样品 1-7 分别采集于我国冬虫夏草代表性产区
青海玉树州、果洛州，四川康定、阿坝和雅拉雪山，
以及云南白马雪山的高原草甸，样品 8 购买自玉树
藏族自治州虫草交易市场（产地标注尼泊尔），详见
表 1。
表 1 冬虫夏草样品来源表
序号 样品编号 样品来源 采样时间
1 YSZD 青海治多县 2013 年 5 月 27
2 QHGL 青海果洛州 2013 年 5 月 27
3 YSHX 青海玉树县哈秀乡 2013 年 5 月 28
4 YSGQ 青海玉树县郭钦乡 2013 年 5 月 28
5 SCKD 四川康定 2013 年 6 月 10
6 SCYL 四川雅拉雪山 2013 年 6 月 12
7 YNBM 云南白马雪山 2013 年 5 月 18
8 NBR 尼泊尔 2013 年 6 月 4
1.2 方法
1.2.1 样品前处理 取 8 种不同来源的冬虫夏草各
一支，用无菌水冲洗后晾干，依次用 70% 乙醇，次
氯酸钠溶液（2.5% 有效 Cl-），70% 乙醇分别浸泡 3
min，5 min，30 s，最后无菌水淋洗 5-7 次，在无菌
条件下晾干［5］。
1.2.2 总 DNA 提取 取经灭菌处理后的冬虫夏草样
品，按照文献［6］中的方法提取样品的总 DNA。
1.2.3 16S rRNA 基因 V3 可变区的 PCR 扩增 用通
用引物对 341f-GC 和 534r 进行 16S rRNA 基因 V3 可
变区片段的扩增。341f-GC ：5-CGCCCGCCGCGCCC-
CGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGA-
GGCAGCAG-3（40 个 碱 基 GC 夹 ）；534r ：5-ATT-
ACCGCGGCTGCTGG-3。PCR 反 应 50 μL 体 系 包
括 10×PCR buffer（不含 Mg2+）5.0 μL，dNTPs（2.5
mmol/L）4 μL，Taq 酶（2.5 U/μL）1.2 μL，模板各 1
μL，上下游引物 10 mmol/L 各 1 μL，无菌双蒸水补
齐至 25 μL。PCR 反应程序如下 94℃预变性 5 min 后
进入循环，94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延
伸 45 s，35 个循环，72℃再次延伸 10 min 。
1.2.4 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳（DGGE） 样 品 的 16S
rRNA 基因 V3 可变区片段的扩增产物通过 DGGE 分
析系统进行分离。丙烯酰胺凝胶浓度为 8%，变性梯
度为 40%-60%。60℃恒温，80 V 下电泳 16 h，电泳
完毕后用 SYBR green I（1×TAE，1∶10 000）染色
45 min，通过凝胶成像系统（英国 UVI）分析电泳
结果。
1.2.5 群落多样性分析 使用 Quantity One 软件对
DGGE 胶图进行计算 ；利用 Shannon-Wiener 多样性
指数、丰度（S）和 Pielou 均匀度指数比较各个样品
的细菌群落多样性计算。
Shannon-Wiener 指数（H’）计算公式 ：
H=- ∑ PilogPi
Pielou 指数（J）计算公式 ：
J= （1- ∑ Pi2）/（1-1/S）
其中，S 为 DGGE 条带数量，Pi 为第 i 条带灰
度占该泳道总灰度的比率。
1.2.6 DGGE 条 带 的 回 收、 重 新 扩 增、 克 隆、 转
化和序列测定 在波长为 354 nm 紫外线下，切取
DGGE 凝胶上的主要条带，溶于 50 μL 无菌去离子
水中，4℃过夜溶解。重扩增，扩增产物连接到载体
pEASY-T1（TRANS）， 转 入 E.coli 感 受 态 细 胞， 在
LB 固体培养基上 37℃筛选培养 16 h，挑取白色转
化子用含有氨苄青霉素抗性的 LB 液体培养基 37℃
震荡培养 8 h。T-载体通用引物进行菌液 PCR，经琼
脂糖凝胶电泳检测后，每个样品 3 个阳性克隆交由
生工生物工程（上海）有限公司完成测序。
1.2.7 16S rRNA 基因 V3 可变区序列分析 所测得的
16S rRNA 基因 V3 可变区序列用 DNASTAR 软件去除
载体序列和 GC 夹子后，将有效序列在 NCBI 上进行
比对，以其中同源性最高的序列为参考序列，相似
性≥ 97% 的序列视为同一序列型（Sequence type）。
2 结果
2.1 16S rRNA基因V3可变区的PCR扩增
8 种冬虫夏草样品经 PCR 扩增获得 16S rRNA
基因 V3 可变区的序列片段条带大小约为 200 bp，条
带均单一明亮（图 1）。
2.2 不同来源冬虫夏草的DGGE图谱分析及细菌
多样性分析
PCR 扩增产物 DGGE 后获得 8 种冬虫夏草的伴
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期198
生细菌 DGGE 指纹图谱（图 2），每条泳带代表一种
冬虫夏草的细菌 DGGE 指纹图谱，不同位置的条带
代表不同种属细菌，条带的荧光强度则反应了该细
菌的丰富度，条带信号越亮，表示该种属细菌的相
对数量越多。如图 2 表明，8 种不同来源冬虫夏草
的细菌群落结构存在明显差异，并呈现出不尽相同
的优势菌条带，同时不同来源样品中还存在 5 种共
有的细菌群落。
8 种冬虫夏草的丰度、Shannon-Wiener 多样性指
数和 Pielou 均匀度指数如表 2，图 3-图5 所示。8 种
样品的丰度在 14-25 之间，平均为 20，说明冬虫夏
草样品含有丰富的伴生细菌。从物种多样性上来看，
8 种样品的多样性指数在 2.36-3.103 之间，具有较
高的物种多样性，物种多样性变化趋势与丰度相同，
来自尼泊尔的样品具有最高的细菌物种多样性和丰
度。8 种样品的均匀度，从趋势上看不同于物种多
样性和丰富度，来源于玉树郭钦的样品具有最高的
均匀度。
2.3 不同来源冬虫夏草的细菌群落结构相似性分
析
在 DGGE 图谱中，不同样品的共有条带数目，
可以反应不同样品之间细菌群落相似性。通过计算
群落相似性系数并构建聚类树，可以得到不同来源
冬虫夏草的细菌群落结构的聚类关系。从图 6 可以
看出来源于青海治多县和果洛州样品，以及来源于
玉树哈秀和郭钦的样品均聚为一个分支，相似性系
数分别为 80.5% 和 73.1%，其他样品间的相似性系
数在 45%-68% 之间，细菌群落结构相似性与样品
产地的远近具有一定的正相关性。
2.4 不同来源冬虫夏草的优势细菌群落结构比较
分析
为进一步研究不同冬虫夏草样品中细菌的群落
组成，DGGE 电泳后对其中 12 个优势条带进行切胶、
回收、克隆、测序（表 3）。测序结果经 GenBank 数
M 1 2 3 4 5 6 7 8 CK
M ：100 bp Ladder Marker，1-8 ：8 种不同来源冬虫夏草原草的 PCR
扩增产物，CK ：空白
图 1 16S rRNA 基因 V3 可变区 PCR 扩增产物在 1% 琼脂
糖凝胶中的电泳图谱
1 2 3 4 5 6 7 8
B1
B2
B3
B4
B5
B8
B6
B7 B9
B10
B12
B11
1
1 2 3 4 5 6 7 8
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
181920
21
22
23
24
25
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
181920
21
22
23
24
25
1-8：分别表示来源于青海治多县，青海果洛，青海玉树县郭钦，玉树县哈秀，
四川康定，四川雅拉雪山，云南白马雪山，尼泊尔的冬虫夏草样品。胶中数
字 B1-B12 代表切胶测序条带
图 2 八种不同来源冬虫夏草样品伴生细菌 DGGE 分离图
谱及分析示意图
表 2 八种不同来源冬虫夏草样品的丰度（s）、Shannon-
Wiener 指数和 Pielou 指数列表
样品编号 Simpson 指数（s） Shannon-Wiener 指数 Pielou 指数
YSZD 14 2.36 0.895
QHGL 17 2.689 0.949
YSHX 23 2.968 0.947
YSGQ 20 2.901 0.968
SCKD 16 2.588 0.933
SCYL 24 3.013 0.948
YNBM 22 2.973 0.962
NBR 25 3.103 0.964
Simpson 指数指每个样品的 DGGE 条带数量 ；Shannon-Wiener 指数，数值
越高，物种多样性越丰富 ；Pielou 指数，反映细菌群落均匀度，数值越大，
均匀度越好
0
YSZD QHGL YSHX YSGQ SCKD SCYL YNBM NBR
5
10
20
30
25
15
Si
m
ps
on
ᤷᮠ٬
图 3 8 种不同来源冬虫夏草样品的 Simpson 丰富度指数分析
2014年第10期 199李辉等：野生冬虫夏草伴生细菌群落结构及多样性分析
异（表 3），但也存在一些共有的细菌种类。在所
有样品中均检测到 Methylovirgula ligni、Aeribacillus
pallidus、Flavihumibacter petaseus 和 Pedobacter
panaciterrae 这 4 个种。
3 讨论
基 于 PCR 扩 增 的 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳（PCR-
DGGE）技术无需对样品中微生物进行培养，直接研
究其基因指纹图谱，具有检测限低、易操作、可重
复性强等优点，已广泛应用于复杂环境样品中微生
物群落结构的研究［7-9］。冬虫夏草是一个十分复杂
的微生态环境，对其的研究会受到很多既定因素的
影响，而 PCR-DGGE 技术能克服传统培养方法的局
限性，在分析冬虫夏草伴生细菌微生物群落结构中
具有十分重要的意义。
本研究首次将 PCR-DGGE 技术应用于 8 种不同
地理来源野生冬虫夏草伴生细菌群落结构研究，通
过优势条带切胶测序分析，确定了不同来源冬虫
夏草中伴生的优势细菌种属信息，结果表明冬虫夏
草中存在丰富的细菌群落多样性，不同来源冬虫
夏草的细菌多样性指数（H’）、丰度（D）和均匀
度（J）均有所不同，样品之间伴生细菌群落相似性
与样品产地的距离远近呈正相关，不同样品既存在
细菌种类和丰度上的差异，也存在一些共有的细菌
种 类， 其 中 Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas
aestuarii、Geobacillus pallidus 和 Methylovirgula ligni
是不同来源冬虫夏草中共有的伴生细菌。本研究证
明，PCR-DGGE 技术是一种快速有效地研究冬虫夏
草伴生细菌菌群结构的技术。
与传统方法相比，PCR-DGGE 技术可对未培养
微生物进行检测，极大地拓展了对冬虫夏草伴生细
菌多样性的研究。本研究中共检测到 Methylovirgula、
拜 叶 林 克 氏 菌（Beijerinckia）、 空 气 芽 孢 杆 菌
（Aeribacillus）、噬菌弧菌（Bacteriovorax）、假单胞菌
（Pseudomonas）、土地杆菌（Pedobacter）、肉食杆菌
（Carnobacterium）、Flavihumibacter、Sphingopyxis9 个
属内的 12 种细菌，其中除肉食杆菌（Carnobacterium）、
假单胞菌（Pseudomonas）已有报道［10，11］从冬虫夏
草寄主肠道中分离到外，其他属均为首次检测到。
值得注意的是，本研究从 8 种不同来源的冬
YSZD QHGL YSHX YSGQ SCKD SCYL YNBM NBR
2.2
2.0
2.4
2.6
3.0
3.4
3.2
2.8
Si
m
ps
on
ᤷᮠ٬
图 4 八种不同来源冬虫夏草样品的 Shannon-Wiener 多样
性指数分析
图 5 八种不同来源冬虫夏草样品的 Pielou 均匀度指数分析
图 6 不同冬虫夏草样品细菌群落结构相似性的聚类结果
0.45 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
SCKD
QHGL
YSZD
SCYL
YNBM
NBR
YSHX
YSGQ
0.98
0.96
0.94
0.92
0.90
Pi
el
ou
ᤷᮠ٬
0.88
0.86
0.84
YSZD QHGL YSHX YSGQ SCKD SCYL YNBM NBR
据库比对后，序列相似性均大于 97%，比对结果显
示 8 种冬虫夏草样品中中存在 Methylovirgula、拜叶
林克氏菌（Beijerinckia）、空气芽孢杆菌（Aeribacil-
lus）、噬菌弧菌（Bacteriovorax）、假单胞菌（Pseudo-
monas）、土地杆菌（Pedobacter）、肉食杆菌（Carno-
bacterium）、Flavihumibacter、Sphingopyxis 等 9 个 属
优势细菌，分属于变形菌门（Proteobacteria）、拟杆
菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）3 个
类群，其中变形菌门组成最高为 50%，拟杆菌门次
之为 33.3%，厚壁菌门占 16.7%。
8 种不同样品中的优势细菌种类存在明显的差
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期200
虫 夏 草 样 品 中 均 检 测 到 Flavihumibacter petaseus、
Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus 和
Methylovirgula ligni 四种伴生细菌，这些细菌资源是
否普遍存在于冬虫夏草中，在其形成过程中是否起
着某种特定的促生作用，还需要进一步研究证实。
另外，本研究基于 PCR-DGGE 建立了冬虫夏草
伴生细菌菌群结构分析方法，但还需要进一步广泛
收集不同的冬虫夏草测试样品，以获得更丰富的研
究数据，并结合传统的分离纯化方法获得伴生细菌
资源，为合理的开发和利用冬虫夏草伴生细菌资源
打下基础。
4 结论
野生冬虫夏草伴生细菌群落多样性丰富，其样
品产地间的距离远近与伴生细菌群落结构相似性呈
一定的正相关，不同冬虫夏草样品中包含 4 种共有
的伴生细菌类群，这是国内外首次利用非培养方法
针对野生冬虫夏草伴生细菌群落多样性进行的研究，
具有重要的理论研究与实践指导价值。
参 考 文 献
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19.
（责任编辑 李楠）
表 3 优势条带切胶测序比对分析结果
条带 亲缘关系最近的种 相似度（%） 归属类群 占优势的样品 *
B1 Methylovirgula ligni 99.22 Proteobacteria YSZD、QHGL
B2 Beijerinckia derxii subsp. venezuelae 97.69 Proteobacteria YSZD、QHGL、SCYL、YNBM、NBR
B3 Aeribacillus pallidus 99.41 Firmicutes YSZD、QHGL、YSHX、YSGQ、SCKD、SCYL
B4 Bacteriovorax stolpii 98.24 Proteobacteria YSHX、SCYL
B5 Pseudomonas azotoformans 98.15 Proteobacteria YSHX、YSGQ
B6 Pedobacter steynii 98.83 Bacteroidetes YSGQ
B7 Pedobacter nyackensis 98.64 Bacteroidetes YSGQ
B8 Carnobacterium maltaromaticum 100 Firmicutes SCYL、YNBM、NBR
B9 Pseudomonas kilonensis 99.33 Proteobacteria SCYL、YNBM、NBR
B10 Flavihumibacter petaseus 98.22 Bacteroidetes 全部样品
B11 Pedobacter panaciterrae 99.33 Bacteroidetes 全部样品
B12 Sphingopyxis italica HE648058 100 Proteobacteria NBR
* 占优势的样品 ：指 DGGE 图谱中该条带肉眼明显可见的样品