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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
传 染 性 法 氏 囊 病 又 称 甘 博 罗 病（Gumboro
disease），是雏鸡一种高度接触性传染病，能引起
雏鸡的免疫抑制，破坏法氏囊中 B 细胞形成，以法
氏囊肿大、肾损害为主要特征。该病的病原体是传
染 性 法 氏 囊 病 病 毒（infectious bursal disease virus，
IBDV），属于双链 RNA 病毒。 IBDV 基因组由 A（3.2
kb）、B（2.8 kb）两个双链 RNA 节段构成。A 编码
VP2 蛋白（37-40 kD）、VP4 蛋白（32-35 kD）、VP3
蛋白（24-29 kD）和 VP5 蛋白（16.5-17 kD）。B 编
码 VP1 蛋白（90 kD）。其中 VP1、VP2、VP3 和 VP4
收稿日期 ：2013-05-13
作者简介 ：胡巍，男，博士，副教授，研究方向 ：病原微生物分子生物学 ；E-mail ：sdhuwei@sdut.edu.cn
鸡法氏囊病毒多表位抗原的表达及免疫特性分析
胡巍  于妮娜  张海红  刘文
（山东理工大学生命科学学院，淄博 255049）
摘 要 ： 为进行传染性法氏囊病病毒（IBDV）多表位抗原的原核表达和免疫特性分析，应用重叠延伸 PCR 技术扩增合成由
病毒 VP2 和 VP3 蛋白多个表位序列构成的重组抗原基因，并将抗原基因与原核表达载体 pBVIL1 重组，表达多表位融合抗原，通
过与标准抗血清反应和动物免疫分别检测表达抗原的免疫反应性和免疫原性。结果显示，经 42℃诱导后，含重组载体的大肠杆菌
表达了 31 kD 的抗原蛋白，Western blot 鉴定出现阳性条带，免疫小鼠后，抗血清的滴度为 1∶6 400。说明原核表达载体构建成功，
大量表达的多表位融合抗原具有 IBDV 抗原反应性。
关键词 ： 传染性法式囊病毒 多表位抗原 原核表达 免疫反应性 免疫原性
Expression and Immune Characteristic Analysis of Multi-epitope
Antigen of Infectious Bursal Disease Virus
Hu Wei Yu Ni’na Zhang Haihong Liu Wen
（School of Life Sciences，Shandong University of Technology，Zibo 255049）
Abstract:  To express multi-epitope antigen of infectious bursal disease virus（IBDV）and analyze its immune characteristics, the multi-
epitope recombinant gene resulting from VP2 and VP3 sequences was designed and amplified by PCR synthetic technology, and was cloned into
pBVIL1 plasmid. The multi-epitope antigen was expressed by temperature induction at 42℃ with fusion and its immune reactivity was detected
by IBDV standard antiserum, and the immunogenicity was evaluated using the titre of antiserum from mice. The results showed that multi-
epitope fusion antigen was expressed with 31 kD molecular weight, its immune reactivity was confirmed using standard antisera through western
blot assay and the antiserum titer was 1∶6 400 with ELISA method after mice immunization. It was concluded that the prokaryotic expression
vector was constructed successfully and the multi-epitope antigen possessed the IBDV antigenic properties, which could be provided for pathogen
diagnosis and genetic engineering vaccine research.
Key words:  Infectious bursal disease virus（IBDV） Multiple epitopes antigen Prokaryotic expression Immunogenicity Immun-
oreactivity
蛋白为结构蛋白，VP2 和 VP3 含量较高约占 51% 和
40%，含有决定 IBDV 群的抗原表位 ；VP2 上构象依
赖性抗原区至少包括 3 个独立的抗原位点，分别能
被不同的中和性单抗所识别 ；VP3 也含有群特异性
的抗原决定簇，具有一定的免疫保护性，但是由其
抗原决定簇诱导产生的抗体只有微弱的病毒中和能
力，VP3 具有稳定 VP2 抗原表位的作用，VP4 蛋白
具有蛋白水解酶样功能，剪切多聚蛋白 pVP2-VP4-
VP3 释放出 pVP2、pVP3 和自身［1-3］。
自 20 世纪 80 年代中期以来，世界许多国家和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期166
地区都报道了超强毒株和变异株的存在，这些超强
毒株引起鸡的病死率接近 80%，变异株、超强毒株
毒力变化的分子基础引起禽病学家的关注。研究发
现 IBDV 的抗原变异主要集中在病毒 VP2 蛋白的 2
个亲水区内，即 212-224 位氨基酸和 314-324 位氨
基酸，这种突变又常改变病毒的中和特性从而导致
变异株逃避疫苗的免疫保护作用［3］。
IBDV 变异株、超强毒株出现给该病的防制带来
巨大困难，常规低毒、中等毒力活疫苗和灭活疫苗
难以有效控制该病，迫切需要研制开发新型疫苗［4-6］。
有效抗原及表位的预测和筛选是疫苗研究的基
础。本研究在抗原表位预测基础上［7］，筛选 IBDV
毒株 Cu1 VP2、VP3 蛋白的多个抗原表位组合成多
表位抗原基因序列，通过重叠延伸 PCR 扩增目的基
因，构建原核表达载体进行表达，并对表达产物的
免疫原性和免疫反应性进行初步分析，旨在为病原
体诊断抗原的制备以及表位型基因工程疫苗的研究
提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌菌株 HB101 为本实验室保存。表达载
体 pBVIL1 为军事医学科学院疫苗与工程研究室凌
世淦教授惠赠，相关内容见参考文献［8］。
PCR 扩增试剂为 MBI 公司产品，PCR 回收纯化
和质粒提取纯化试剂盒均购自北京博大泰克生物工
程公司，基因测序由生工生物工程（上海）公司完
成。DNA 限制性内切酶和连接酶为宝生物工程（大
连）公司产品。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠和羊
抗鸡抗体购自中杉生物技术公司。小鼠为昆明鼠，
购自山东大学医学部。传染性法氏囊（标准）抗血
清购自北京兰伯瑞生物技术有限公司。弗氏佐剂为
Promega 公司产品。大肠杆菌培养基为 LB 培养基。
其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 IBDV 多表位抗原基因的序列设计及 PCR 扩
增目的基因 从 GenBank 数据库中搜索到 IBDV 毒
株 Cu1 的多聚蛋白 VP234 基因序列和氨基酸序列
（登录号 D00867），利用表位分析软件 Goldkey 进行
表位预测［7］，选取 VP2 和 VP3 中 10 个表位组合成
长度为 492 bp 的多表位抗原基因（图 1）。
GACGACACCCTGGAGAAGCACACTCTCAGGTCAGAGACCTCGACCTACCAGAGCAAT
F7 F6 F5
GGGAACACATGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACATAGTGACCTCCAAAAGT
F4
GGTGGTCAGGCAGGGGATCAGATGCTGAGTGAGAGGGACCGTCTTGGCATCAAGACC
F3 F2
GTCTGGCCAACAAGGGAGTACACTGACTTTCGTGAATTCCCTCACAATCCACGCGACT
F1
GGGACAGGCCACAAGCAGGCAGCAAGTCGCAAAGGGCCAAGTACGGGCGGGGCCCC
R1 R2
ACACCAGAGGAAGCACAGAGGGAAAAAGACACACGGATCTCAAAGAAGATGGAGAC
R3
CATGGGCATCGACCCAAACGAGGACTATCTAGGACGTGGCCCAAACCAAGAACAGAT
R4 R5
GAAAGATCTGATGAAGCATCGCAATCCCAGGCGGGCTCTACCAAAGCCCAAGCCAAA
R6
ACCCAATGCTCCAACACAGAGACCCCCTGGTCGGCTG
R7
7 对引物在多表位抗原基因序列中对应的位置分别用下划线和阴影
区分，在开始位置下方标注引物名称。通用引物及 F7/R7 中与通
用引物互补的序列未显示
图 1 多表位抗原基因序列及 PCR 引物与基因序列的对应
位置
根据设计的 IBDV 多表位抗原序列，设计 8 对
引物（表 1），采用重叠延伸 PCR 技术扩增目的基因，
前一轮产物是后一轮反应的模板，最后一对通用引
物（F 通和 R 通）末端引入 Xho I 和 Xba I 两个酶切位
点（引物 F 通和 R 通中下划线部分）和一个连接臂序
列（引物 F 通和 R 通中阴影部分）。PCR 反应条件为 ：
95℃ 5 min ；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个
循环 ；72℃ 10 min。8 轮扩增后的目的基因增加了
两个酶切位点和连接臂序列，长度为 532 bp。
1.2.2 表达载体构建及阳性克隆的鉴定 从过夜培
养的含 pBVIL1 质粒的大肠杆菌 HB101 中提取质粒
载体，目的基因和质粒分别经 Xho I 和 Xba I 双酶
切，回收后用 T4 DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌
HB101。经抗性筛选（Amp+），含重组质粒的阳性克
隆用菌体 PCR 鉴定和测序鉴定。
1.2.3 目的蛋白诱导表达与 Western blot 鉴定 经测
序鉴定的阳性克隆按 1∶100 接种在 LB 液体培养基
（Amp+）中，37℃培养到对数期，42℃诱导表达蛋
白。进行 Western blot 鉴定，一抗为传染性法氏囊（标
准）抗血清，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鸡抗体，
DAB 显色。
菌 体 超 声 破 碎 后 收 集 包 涵 体 蛋 白 进 行 SDS-
PAGE 胶 制 备 电 泳 纯 化 目 的 蛋 白， 测 定 OD280nm、
OD260nm 值，计算蛋白浓度（mg/mL）=OD280nm×1.47-
2013年第9期 167胡巍等 ：鸡法氏囊病毒多表位抗原的表达及免疫特性分析
OD260nm×0.7。
1.2.4 小鼠免疫及抗血清滴度测定 将纯化的抗原
蛋白与弗氏佐剂混合免疫小鼠，共免疫 3 次（每只
小鼠 2.5 μg 抗原蛋白）。第 3 次免疫后的第 7 天采血，
经眼球取血，收集抗血清。采用 ELISA 法测定抗体
滴度，免疫前的鼠血清作为阴性对照。一抗为免疫
血清，二抗为 1∶5 000 稀释的辣根过氧化物酶标记
的羊抗鼠抗体。TMP 法显色，测定 OD450nm 值。
2 结果
2.1 多表位抗原基因的PCR扩增合成
经过 8 轮 PCR 反应，序列长度逐渐延长得到
IBDV 多表位抗原基因（图 2）。每轮 PCR 产物电泳
条带位置均与预期扩增片段分子量大小一致（表 1），
第 8 轮 PCR 产物为 532 bp 的多表位抗原基因。
2.2 目的基因原核表达载体构建和鉴定
多表位抗原基因与表达载体重组，转化 HB101
菌株，在固体培养基（Amp+）上过夜培养后进行克
隆菌体 PCR 鉴定，鉴定结果出现目的基因条带（图
略），初步判断为阳性克隆。将该克隆进行目的基因
的序列测定，结果与设计的多表位抗原基因序列相
同，证明筛选出的克隆为含有目的基因重组载体的
阳性克隆。
2.3 目的蛋白诱导表达与Western blot鉴定
阳性克隆培养物经 42℃诱导后 SDS-PAGE 检测
显示，与 IL1 融合的抗原蛋白得到高效表达，融合
的抗原蛋白分子量约为 31 kD，经制备电泳纯化后
的蛋白浓度约为 0.24 mg/mL。Western blot 结果（图
3）表明，目的蛋白可与 IBDV 标准血清反应，在
31 kD 处呈现特异条带，与 SDS-PAGE 的分析结果一
致，说明表达出的抗原蛋白具有免疫反应性。
表 1 PCR 扩增目的基因的引物序列及扩增片段长度
引物 引物序列（5-3） 扩增片段长度（bp）
F1
R1
GTGAATTCCCTCACAATCCACGCGACTGGGACAGGCCACAAGCAGGCAGC
GGTGTGGGGCCCCGCCCGTACTTGGCCCTTTGCGACTTGCTGCCTGCTTG
88
F2
R2
CAAGACCGTCTGGCCAACAAGGGAGTACACTGACTTTCGTGAATTCCCTC
TTGAGATCCGTGTGTCCTTTTCTCTTTGTGCCTCTTCTGGTGTGGGGCCC
164
F3
R3
GGGGATCAGATGCTGAGTGAGAGGGACCGTCTTGGCATCAAGACCGTCTG
GTCCTCGTTTGGGTCGATGCCCATGGTCTCCATCTTCTTTGAGATCCGTG
239
F4
R4
GAGTCTACATAGTGACCTCCAAAAGTGGTGGTCAGGCAGGGGATCAGATG
TCTTTCATCTGTTCTTGGTTTGGGCCACGTCCTAGATAGTCCTCGTTTGG
316
F5
R5
GAGCAATGGGAACACATGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACATAG
TTGGTAGAGCCCGCCTGGGATTGCGATGCTTCATCAGATCTTTCATCTGT
392
F6
R6
GAGAAGCACACTCTCAGGTCAGAGACCTCGACCTACCAGAGCAATGGGAA
GGGTCTCTGTGTTGGAGCATTGGGTTTTGGCTTGGGCTTTGGTAGAGCCC
468
F7
R7
GGT GGT GGA TCT GACGACACCCTGGAGAAGCACACT
ACC TCC ACC ACT CAGCCGACCAGGGGGTCTCTGTGT
516
F 通
R 通
GC CTCGAG GGT GGT GGA TCT
GC TCTAGA ACC TCC ACC ACT
532
2000
bp
1000
750
500
250
100
1 2 3 4 5 6 7 8 M
1-8 ：8 轮 PCR 扩 增 的 产 物， 所 用 的 引 物 依 次 为 F1/R1、F2/R2、F3/R3、
F4/R4、F5/R5、F6/R6、F7/R7、F 通 /R 通 ；M ：DL2000 DNA Marker
图 2 多表位抗原基因的 PCR 扩增
116
kD
66.2
45
35
25
18.4
14.4
1 2 3 M
1 ：蛋白印迹结果 ；2 ：纯化目的蛋白 ；3 ：诱导的全细胞蛋白 ；
M ：标准分子量蛋白
图 3 抗原蛋白 SDS-PAGE 检测 和 Western blot 鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期168
2.4 免疫小鼠抗血清滴度测定
用 ELISA 方法测定样品各稀释度的 OD450nm 值，
按照 P/N>2.1 的最大血清稀释度为血清滴度的原则，
ELISA 测定结果（图 4）表明，抗血清滴度为 1∶
6 400，说明表达的抗原蛋白具有良好的免疫原性。
多表位抗原中并保证正确的表达是需要解决的关键
难题。
IBDV-VP2 抗原的亚单位疫苗、多表位亚单位疫
苗、活病毒载体疫苗、DNA 疫苗及转基因植物疫苗
等已有研究报道，不同表达系统对重组蛋白的表达
和加工能力不同，因此不同程度影响重组产物的结
构从而影响其免疫保护作用，且单一抗原诱导的免
疫应答类型有限，单一抗原存在一定的免疫保护局
限性［5，11-13］。随着分子生物学和免疫分子学的快速
发展，人工合成含多个抗原表位基因用于复合多价
疫苗及病原体的检测方面的研究日益广泛，如乙肝
病毒、丙肝病毒、口蹄疫病毒等的多表位疫苗，疟
原虫、弓形虫多表位疫苗以及梅毒、弓形虫多表位
检测试剂盒等。多表位抗原有更好的免疫特异性和
敏感性，因此有广阔应用前景［14，15］。
4 结论
本试验构建 IBDV 多表位抗原基因原核表达载
体，诱导方便、表达量高，表达的病毒多表位抗原
蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性，为病原体
诊断抗原的研究和制备提供有效表达系统，也为研
究表位型基因工程疫苗提供新途径。
参 考 文 献
［1］ 张建军 , 高巍 , 侯军 . 鸡传染性法氏囊病毒研究进展［J］. 中
国家禽 , 2007, 29（12）：47-52.
［2］ 胡晓苗 , 汪丽 , 张丹俊 , 等 . 传染性法氏囊病病毒分子生物学研
究进展［J］. 动物医学进展 , 2006, 27（12）：10-14.
［3］ Ona A, Luque D, Abaitua F, et al. The C-terminal domain of the
pVP2 precursor is essential for the ineraction between VP2 and VP3,
the capsid polypeptides of infectious bursal disease virus［J］.
Virology, 2004, 322（1）：135-142.
［4］ Chang HC, Lin TL, Wu CC. DNA vaccination with plasmids
containing various fragments of large segment genome of infectious
bursal disease virus［J］. Vaccine, 2003, 21（5-6）：507-513.
［5］ 郁斌 , 闫志宪 , 王培永 . 鸡传染性法氏囊病新型疫苗研究现状
及发展趋势［J］. 中国动物检疫 , 2009, 26（4）：73-75.
［6］ Achille F, Christophe C, Bemard D, et al. Avian adenovirus CELO
recombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induce
protection against bursal disease in chickens［J］. Vaccine, 2004,
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
100 200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200
Mice antiserum dilution
O
D
45
0n
m
图 4 免疫小鼠血清滴度测定
3 讨论
为了减少病原体的毒性，目前新型疫苗的设计
多采用重组抗原作为候选抗原，随着生物信息学的
发展，多表位抗原成为疫苗设计的新方向。抗原表
位是引起免疫应答以及与抗体产生特异反应的抗原
基本结构功能单位，将适量表位串联，能够刺激机
体产生更多的中和抗体。抗原表位、连接方法、表
达系统以及表位的加工效率均影响多表位蛋白的免
疫效力［9，10］。
本试验的前期工作是从 GenBank 数据库选择
IBDV 病毒株的抗原蛋白基因序列，用表位分析软件
Goldkey 对抗原表位进行分析，筛选主要保护性抗原
VP2、VP3 的多个表位，设计重组多表位抗原基因。
在此基础上通过重叠延伸 PCR 技术，进行多表位抗
原基因的扩增合成。为了得到具有良好免疫特性的
多表位抗原，该方法可根据试验结果调整表位组合，
同时对于高度传染性病原体，该方法也是获取更加
安全有效抗原基因的途径。试验中采用的高效表达
载体 pBVIL1 为温度诱导，方法简便，蛋白表达量高，
IL1 具有免疫激活作用，将 IBDV 多表位抗原蛋白与
IL1 融合表达可提高多表位融合抗原的免疫原活性。
当然，有关其免疫保护方面的作用还需进行在
体的病毒攻击试验才能证实。由于 IBDV-VP2 蛋白
至少有 3 个构象依赖性中和抗原表位，因此要想进
一步提高抗原免疫特性，将构象依赖性表位设计到
2013年第9期 169胡巍等 ：鸡法氏囊病毒多表位抗原的表达及免疫特性分析
22（17-18）：2351-2360.
［7］ 刘文 , 毕红卫 , 胡巍 , 等 . 家禽三联多表位抗原蛋白的预测［J］.
山东理工大学学报 ：自然科学版 , 2004, 18（1）：46-49.
［8］ 胡巍 , 凌世淦 , 宋晓国 , 等 . 丙型肝炎病毒蛋白酶底物 NS5A-B
融合片段的原核表达和活性研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志 ,
2006, 22（1）：43-46.
［9］ Houimel M, Dellagi K. Peptide mimotopes of rabies virus glycopro-
tein with immunogenic activity［J］. Vaccine, 2009, 27（34）：
4648-4655.
［10］ 刘小娟 , 王永山 , 欧阳伟 , 等 . 传染性法氏囊病病毒抗原表位
与乙型肝炎病毒核心抗原嵌合基因的构建及其表达产物分
析［J］. 中国预防兽医学报 , 2010, 32（11）：879-883.
［11］ Gómez E, Lucero MS, Zoth SC, et al. Transient expression of VP2
in Nicotiana benthamiana and its use as a plant-based vaccine aga-
inst infectious bursal disease virus［J］. Vaccine, 2013, 31（23）：
2623-2627.
［12］ Chen YY, Hsieh MK, Tung CY, et al. Infectious bursal disease DNA
vaccination conferring protection by delayed appearance and rapid
clearance of invading viruses［J］. Archives of Virology, 2011, 156
（12）：2241-2250.
［13］ Pradhan SN, Prince PR, Madhumathi J, et al. Protective immune
responses of recombinant VP2 subunit antigen of infectious bursal
disease virus in chickens［J］. Veterinary Immunology and
Immunopathology, 2012, 148（3-4）：293-301.
［14］ 高军 , 龚育平 , 赵平 , 等 . 丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构
建与免疫原性研究［J］. 中国科学 C 辑 ：生命科学 , 2006, 36
（4）：346-354.
［15］ 张耀光 , 江丽 . 人工合成多表位抗原的研究进展［J］. 国际医
学寄生虫病杂志 , 2010, 37（6）：360-365.
（责任编辑 马鑫）
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