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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
人体缺乏降解草酸的酶，体内的草酸一般通过
肠道内微生物降解。1985 年 Allison［1］首次筛选出
具草酸分解能力的产甲酸草酸杆菌，之后又发现粪
肠球菌、雷氏普罗威登斯菌和乳酸菌具有不同程度
的草酸分解能力。Lung［2］首次得到分解产甲酸草酸
杆菌分解草酸的关键酶基因 oxc 和 frc。国内郭照宇［3］
对发酵乳制品中的乳酸菌进行筛，选得到 37 株具
有草酸分解能力的乳酸菌，赵树田［4］对 10 种可制
作酸奶的乳酸菌体外降解草酸能力评价，得到具有
最高分解能力的是乳双歧杆菌。而现有发现得到的
收稿日期 ：2012-07-27
基金项目 ：天津市应用基础及前沿技术研究计划（12JCQNC06400）
作者简介 ：张禹，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物与生化药学 ；E-mail: zhangyu03170@126.com
通讯作者 ：路福平 , 男，教授，博士，研究方向 ：微生物生物活性物质开发及工业微生物育种等 ；E-mail: lfp@tust.edu.cn
原生质体融合技术选育分解草酸乳酸菌菌株的研究
张禹1  毛淑红1  路福平1  聂实践2
（1. 天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 工业酶国家工程实验室 天津市工业微生物重点实验室，
天津 300457 ；2. 北京百林康源生物技术有限责任公司，北京 100069）
摘 要 ： 将具有草酸分解能力的乳双歧杆菌和具有耐氧特性的嗜酸乳杆菌进行原生质体融合，其最佳条件为 ：50% 的 PEG
6000，融合温度 30℃，融合时间为 7 min，CaCl2 浓度为 0.02 mol/L，MgCl2 浓度为 0.5 mol/L，在此条件下融合率可达 7.6%。从中筛
选出同时具有耐氧特性和草酸分解能力的融合子，草酸分解率为 13.4%。
关键词 ： 草酸 乳酸菌 原生质体融合 筛选 融合率
Screening of the Oxalate-degrading Lactobacillus Strains Using
Protolast Fusion Technology
Zhang Yu1 Mao Shuhong1 Lu Fupin1 Nie Shijian2
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，
Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，
Tianjin 300457 ； 2. Brins-LivePro Biotechnology Corporation，Beijing 00069）
Abstract:  Bifidobacterium lactis with oxalate-degrading capacity can efficiently reduce the oxalate in vivo, and can be used to prevent
and treat kidney stone diseases. While Bifidobacterium lactis is poorly oxygen-tolerant, that can not be employed as microbial ecological agents.
In this study, protoplast fusion was studied between Bifidobacterium lactis with oxalate-degrading capacity and oxygen-tolerant lactobacillus
acidophilus. Under the optimum conditions of protoplast fusion with PEG 6000 concentration 50%, fusion time 7 min, fusion temperature 30℃ ,
concentration of CaCl2 0.02 mol/ L and the concentration of MgCl2 0.5 mol/ L, the fusion rate reached 7.6%, and a oxygen-tolerant fusant showing
the level of oxalate degradation at 13.4% was obtained.
Key words:  Oxalate Lactobacillus Protoplast fusion Selected Fusion frequency
分解草酸的肠道微生物耐氧能力较差，为培养和生
产微生态制剂带来了困难。为克服该问题，Turroni
等［5］利用转基因技术对参与草酸代谢的草酰辅酶 A
脱羧酶和甲酰辅酶 A 转移酶的克隆与表达做了相关
研究。但转基因技术在食品领域存在着安全问题，
而原生质体融合技术更为安全，同时操作更为简便，
可以更快捷地得到重组菌。
本研究在国内外研究的基础上，选取具有草酸
分解能力的乳双歧杆菌和具有耐氧特性的嗜酸乳杆
菌作为亲本，通过双亲灭活进行原生质体融合，筛选
2013年第1期 187张禹等 ：原生质体融合技术选育分解草酸乳酸菌菌株的研究
可以在有氧环境生长并具有分解草酸能力的菌株
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 种 乳 双 歧 杆 菌（Bifidobacterium lactis
DSM 10140）购于中国普通微生物保藏管理中心。嗜
酸 乳 杆 菌（Lactobacillus acidophilus TCCC11275） 保
藏于天津科技大学菌种保藏中心。
1.1.2 培养基、溶液和试剂 乳双歧杆菌液体完全
培养基 ：蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 10 g/L，酵母提取物
5 g/L，葡萄糖 5 g/L，K2HP4 0.45 g/L，KH2PO4 0.33 g/L，
氯化铵 1 g/L，硫酸镁 0.1 g/L，L-半胱氨酸 0.5 g/L，
蒸馏水 1 L，pH 自然。
MRS 液体培养基： 蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 10 g/L，
酵母提取物 5 g/L，K2HPO4 2 g/L，柠檬酸二铵 2 g/L，
乙酸钠 5 g/L，葡萄糖 20 g/L，吐温 80 1 mL/L，硫酸
镁 0.5 g/L，硫酸锰 0.25 g/L，pH 自然。
再生培养基 ：半固体 MRS 培养基（不含吐温
80）中添加质量百分数为 2.5% 的明胶，浓度为 20
mmol/L MgCl2，浓度为 0.5 mol/L 的蔗糖。
草酸培养基 ：草酸钠 2.5 g/L，葡萄糖 1.5 g/L，
蛋 白 胨 1 g/L， 酵 母 提 取 物 0.5 g/L，K2HPO4 2 g/L，
KH2PO4 2 g/L，硫酸铵 2 g/L，硫酸锰 0.025 g/L。
原生质体稳定液 PB［6］：0.02 mol/L HEPES，pH
值为 7.0，添加浓度为 1 mmol/L 的 MgCl2，质量分数
为 0.5% 的明胶，浓度为 0.3 mol/L 棉籽糖或浓度为 0.5
mol/L 的乳糖。
溶菌酶溶液 ：用原生质体稳定液 PB 配制成一
定质量浓度的溶菌酶溶液，用一次性无菌滤器过滤
除菌。
聚乙二醇 PEG 6000 ：用原生质体稳定液 PB 配
制成一定质量浓度的的溶液 115℃灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 菌 种 活 化 分 别 取 菌 种 乳 双 歧 杆 菌 DSM
10140 和嗜酸乳杆菌 TCCC11275 按质量分数为 5%
接种于乳双歧杆菌液体完全培养基和 MRS 液体培养
基中 37℃静置培养 24 h。
1.2.2 原生质体制备与再生 取对数生长期 15 mL
菌液离心 3 500 r/min，并以原生质体稳定液 PB 洗涤
两次，用原生质体稳定液 PB 稀释至 106-107 个 /mL，
用完全培养基倾注法测定细胞数。转入 9.0 cm 培养
皿中，加入一定质量体积的溶菌酶溶液处理一定时
间，原生质体稳定液 PB 洗涤两次，用再生培养基
倾注法测定细胞数。
1.2.3 原生质体灭活 高温灭活 ：取乳双歧杆菌原
生质体细胞悬液 5 mL 在不同温度热水浴中，不同时
间灭活后用再生培养基倾注法测定细胞数。紫外灭
活 ：取嗜酸乳杆菌原生质体细胞悬液 5 mL 于 9.0 cm
灭菌平板中，置 15 W 紫外灯下，距离为 30 cm 照射
不同时间后用再生培养基倾注法测定细胞数。
1.2.4 原生质体融合 将灭活后两亲本原生质体
悬液在离心管中等体积混合，于 4℃冷冻离心机中
3 000 r/min 离心 10 min，然后加入不同配比质量百
分数的 PEG6000，融合前需使亲本的原生质体细胞
浓度达到 106-107 个 /mL，混匀后放入 15℃、转速
为 100 r/min 的恒温摇床中，10 min 以待融合 ；取出
融合后的原生质体悬液 4℃冷冻离心后用 PB 缓冲液
离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤后的原生
质体重悬于 PB 缓冲液中，得到融合后的原生质体
用再生培养基倾注法测定细胞数。
1.2.5 计算公式 原生质体形成率、原生质体再生
率、原生质体灭活率和融合率计算公式参考文献［7］。
1.2.6 分解草酸测定方法 将测试菌株转接到草酸
培养基中于 37℃培养 5 d 后，使用高效液相色谱法
检测草酸培养基发酵前后的草酸含量，高效液相
色谱法条件如下。色谱柱 ：C18 柱 5 μm，250×4.6
mm，pH 范围：2-10，流动相：2% H3PO4 的去离子水∶
甲醇（V/V）=99.5∶0.5，检测器波长：210 nm，流速：
0.5 mL/min。
2 结果
2.1 乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌原生质体制备条件
的确定
选择原生质体最佳的制备条件不仅要使原生质
体制备率达到最高，同时还要考虑原生质体再生率不
能过低，因此由表 1、表 2、表 3 结果可知乳双歧杆
菌的最佳原生质体制备条件 ：溶菌酶浓度为 6 mg/mL，
酶作用温度为 37℃，酶作用时间为 25 min。嗜酸乳杆
菌的最佳原生质体制备条件 ：溶菌酶浓度为 12 mg/mL，
酶作用温度为 37℃，酶作用时间为 30 min。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期188
溶菌酶浓度（mg/mL）
乳双歧杆菌原生质体
制备率（%)
乳双歧杆菌原生质体
再生率（%）
嗜酸乳杆菌原生质体
制备率（%）
嗜酸乳杆菌原生质体
再生率（%）
2 46.3 37.9 56.5 36.5
6 65.8 46.8 70.5 42.5
10 76.8 40.2 79.3 43.6
12 85.6 36.5 82.6 46.5
16 90.2 30.2 84.6 38.9
18 96.5 25.3 89.3 30.2
温度（℃）
乳双歧杆菌原生质体
制备率（%）
乳双歧杆菌原生质体
再生率（%）
嗜酸乳杆菌原生质体
制备率（%）
嗜酸乳杆菌原生质体
再生率（%）
31 57.6 30.3 21.2 35.9
33 62.5 33.3 30.9 36.5
35 75.7 37.5 50.2 35.1
37 81.3 39.5 79.5 37.5
39 86.9 38.2 82.5 33.9
41 83.4 36.9 89.5 31.2
时间（min）
乳双歧杆菌原生质体
制备率（%）
乳双歧杆菌原生质体
再生率（%）
嗜酸乳杆菌原生质体
制备率（%）
嗜酸乳杆菌原生质体
再生率（%）
10 49.3 20.2 30.7 35.1
15 53.7 26.3 45.8 37.2
20 66.8 29.3 58.7 37.5
25 89.2 30.2 69.5 38.2
30 93.2 28.3 79.3 39.5
35 96.3 19.2 85.6 32.5
时间（s） 原生质体灭活率（%）
20 25.2
40 53.5
60 77.6
80 96.8
100 100
120 100
温度（℃） 原生质体灭活率（%）
45 55.8
50 75.9
55 83.6
60 95.6
65 100
70 100
2.2 双亲本原生质体灭活剂量的确定
原生质体紫外灭活和热灭活的试验结果，见表
4、表 5、表 6。为保证原生质体的灭活率为 100%，
最后确定嗜酸乳杆菌的紫外灭活时间为 100 s，乳双
歧杆菌的高温灭活温度为 65℃，时间为 70s。
2.3 原生质体融合条件的确定
融合条件是得到融合子的关键因素，主要研究
了 PEG6000 浓度、 融合温度、 融合时间和无机离子
浓度对原生质体融合率的影响。
PEG 可以使原生质体膜之间有效接触，有效
地诱导原生质体融合［8］。由表 7 可知，融合率随
PEG6000 浓度升高增加到 5.0% 当浓度超过 50% 时，
融 合 率 下 降 到 3.2%。 因 此 选 择 PEG6000 浓 度 为
50% 作为原生质体融合时的 PEG 浓度。
表 1 乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌原生质体制备溶菌酶浓度
表 2 乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌原生质体制备溶菌酶作用温度
表 3 乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌原生质体制备溶菌酶作用时间
表 4 嗜酸乳杆菌原生质体紫外线灭活剂量 表 5 乳双歧杆菌原生质体高温灭活温度
2013年第1期 189张禹等 ：原生质体融合技术选育分解草酸乳酸菌菌株的研究
温度在一定程度上影响原生质体融合率，较高
的温度可以增加性细胞膜流动性，降低 PEG 黏度，
有助于原生质体的融合。由表 8 可知，融合温度上
升到 30℃时，原生质体融合率提高到 5.5%。温度继
续升高后，融合率降低至 2%。因此选择 30℃作为
融合温度。
PEG6000 浓度（%） 原生质体融合率（%）
30 2.3
35 3.9
40 4.2
45 4.7
50 5.0
55 4.0
60 3.2
温度（℃） 原生质体融合率（%）
15 3.5
20 3.9
25 4.3.
30 5.5
35 3.8
40 2.0
时间（min） 原生质体融合率（%）
2 2.9
3 3.9
5 5.3
7 6.0
9 5.3
11 4.8
CaCl2 浓度（mol/L） 原生质体融合率（%）
0.005 3.9
0.01 5.0
0.02 6.5
0.03 5.3
0.04 4.2
0.05 4.0
MgCl2 浓度（mol/L） 原生质体融合率（%）
0.2 2.3
0.3 4.9
0.4 5.7
0.5 7.6
0.6 6.0
0.7 5.3
时间（s） 原生质体灭活率（%）
20 20.3
30 40.6
40 56.9
50 72.8
60 89.3
70 100
80 100
90 100
表 6 乳双歧杆菌原生质体高温灭活时间
表 7 PEG 浓度对融合率的影响
表 8 融合温度对融合率的影响
PEG 融合处理时间大多数情况为 1-10 min，由
于 PEG 对细胞有一定的毒性，处理时间过长会导致
原生质体失活不能再生［9］。由表 9 可知，随着融合
时间增加到 7min 时，融合率提高到 6.0%，当融合
时间继续增加到 11 min 时，原生质体的融合率则降
为 4.8%，因此为了获得最大的融合率选择 7 min 作
为原生质体的融合时间。加入一定浓度的 Ca2+ 和
Mg2+ 在原生质体融合过程中可以促进融合。
表 9 融合时间对融合率的影响
由表 10、表 11 结果可知，选择融合率最高时
的浓度为 0.02 mol/L 的 CaCl2 和浓度为 0.5 mol/L 的
MgCl2 作为原生质体融合时的 Ca
2 浓度和 Mg2+ 浓度。
表 10 CaCl2 浓度对融合率的影响
表 11 MgCl2 浓度对融合率的影响
2.4 融合子的筛选
在有氧条件的草酸培养基中，亲本乳双歧杆菌
由于不耐氧无法生长，嗜酸乳杆菌由于不具有分解
草酸的能力也无法生长，只有融合后完全继承亲本
特性的融合子才能生长。在 296 株融合子中有 57 株
可以在有氧条件下的草酸培养基中生长，使用高效
液相色谱法对培养基中检测培养基接种前后的草酸
含量进行重复试验检测，筛选出分解草酸能力较高
的菌株 SZY1-1、SZY1-4、SZY1-7、SZY2-1、SZY2-2
和 SZY3-4，见表 12。
3 讨论
原生质体融合可以使两亲本细胞随机融合，有
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期190
效地筛选具有双亲特性的融合菌株，罗红霞等［10］
对乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus，LN1#）双亲灭
活进行原生质体融合得到在高温条件下产酸较强低，
温条件下产酸较弱的融合菌株。黄明深［11］利用有
芽孢的整肠生菌株（Bacillus licheniformis）与无芽孢
的保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus）作为
亲本，进行原生质体融合，得到了乳酸产量高于亲
本菌株的融合菌株。原生质体融合的筛选方法是得
到融合菌的重要环节，比较有效的是使用抗生素标
记筛选，但在益生菌研究领域抗生素标记的使用却
存在着安全问题。本研究双亲灭活原生质体融合后
利用耐氧特性和耐草酸生长特性的进行筛选，不需
要引入抗生素标记，可直接作为安全益生菌用于预
防和治疗结石病。
本研究原生质体融合率偏低，还需进一步研
究提高，以筛选得到草酸分解能力高于亲本的融合
菌株。张莉滟等［12］使用电融合技术对双歧杆菌和
热灭活的乳杆菌进行融合，通过生长特性以及初步
生化试验鉴定得到融合子，虽然通过电融合的方法
提高融合率，但在筛选方法上还不够完全。周正红
等［13］对黑曲霉原生质体的进行了电融合的研究，
融合率可达 60%，相对于 PEG 诱导的融合率显著提
高，后续研究可以对原生质体电融合方法进行探讨，
以提高融合率得到更多高效分解草酸的融合子。
4 结论
本研究确定了原生质体融合最佳条件为 50%
的 PEG 6000，融合温度 30℃，融合时间为 7 min，
CaCl2 浓度为 0.02 mol/L，MgCl2 浓度为 0.5 mol/L，在
此条件下融合率可达 7.6%。筛选出一株草酸分解率
为 13.4% 并可以在有氧条件下生长的融合子。
菌株
草酸含量（mg/mL）
草酸分解量（%）
0 h 120 h
乳双歧杆菌 2.35±0.21 2.03±0.35** 13.5
SZY1-1 2.35±0.21 2.07±0.28* 11.9
SZY1-4 2.35±0.21 2.09±0.36** 10.8
SZY1-7 2.35±0.21 2.03±0.24* 13.4
SZY2-1 2.35±0.21 2.05±0.21** 12.7
SZY2-2 2.35±0.21 2.07±0.45** 11.2
SZY3-4 2.35±0.21 2.07±0.56* 11.8
同对照组比， * ：P<0.05，** ：P<0.01
参 考 文 献
［1］ Allison MJ, Dawson KA, Mayberry WR. Oxalobacter formigenes
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oxc, from the bacterium Oxalobacter formigenes［J］. J Bacteriol,
1994, 176（8）：2468-72.
［3］ 郭照宇 , 平云婕 , 刘畅 . 高效降解草酸乳酸菌的筛选［J］. 中
国微生态学杂志 , 2010（1）：36-39.
［4］ 赵树田 , 张士青 , 顾欣 . 十种可制作酸奶的乳酸菌体外降解草
酸能力评价［J］. 上海交通大学学报 ：医学版 , 2009（12）：
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［5］ Turroni S, Bendazzoli C, Dipalo SC. Oxalate-degrading activity in
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（责任编辑 李楠）
表 12 融合子分解草酸能力测定