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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):188-192
α-淀粉酶可从淀粉分子内部切开 α-1，4 糖苷键，
生成糊精和还原糖，广泛应用于食品、酿造、制药、
纺织及石油开采等诸多领域，在工业生产中有极其
重要的地位，是目前用途较广泛的一种酶制剂［1，2］。
目前工业应用的 α-淀粉酶主要来源于细菌和丝状真
菌［3，4］，在原始菌株中，真菌来源的 α-淀粉酶被发
现比细菌更稳定［5］。国外对酸性 α-淀粉酶的研究起
步较早，1963 年日本 Yasuji 等［6］发现可用真菌生
产酸性 α-淀粉酶。在酵母菌中也发现了部分能产生
高酶活 α-淀粉酶的菌株［7］。我国对产 α-淀粉酶菌株
的研究起步较晚，尤其是耐酸性 α-淀粉酶。目前，
国际上一些大的酶制剂公司生产耐酸 α-淀粉酶的菌
种 50% 是基因工程菌［8］。近年来，已发现数十株优
良产 α-淀粉酶菌，包括耶鲁维亚酵母（Yarrowia）、
类酵母（Aureobasidium）、毕赤氏酵母（Pichia）、假
丝 酵 母（Candida）、 红 酵 母（Rhotolorula） 等［9］，
对酵母菌应用于工业生产 α-淀粉酶有了进一步推
动［10］。本研究筛选出一株耐酸性 α-淀粉酶酵母菌株，
收稿日期 ： 2014-11-25
基金项目 ：国家科技支撑计划项目（2013AA102101），国家自然科学面上基金项目（31370147），河南省高校青年骨干教师资助计划
（2013GGJS-077），河南省高校科技创新团队（15IRTSTHN019）
作者简介 ：屈建航，女，博士，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：qjh_bata@163.com
酸性 α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究
屈建航1  尹伊1  焦国宝2  丁长河1  张倩1  屈凌波1  刘仲敏2
（1. 河南工业大学生物工程学院，郑州 450000 ；2. 河南仰韶生化工程有限公司，渑池 472400）
摘 要 ： 自淀粉厂周边土壤分离筛选到一株高效耐酸 α-淀粉酶菌株 SH3，初步鉴定为酵母菌，发酵粗酶 pH 范围 3.8-8.0，
最适作用 pH5.0，该酶在 80℃下仍有酶活，最适作用温度 50℃。经单因素发酵条件的研究与优化，最适温度 37℃，培养基初始
pH5.0，可溶性淀粉作碳源，蛋白胨为氮源，200 mL 装液量。正交试验确定最佳产酶条件为可溶性淀粉 15 g/L、蛋白胨 30 g/L、
37℃、pH4.5，该条件下酶活力为 96.8 U/mg。
关键词 ： 耐酸 α-淀粉酶 ；菌株筛选 ；发酵条件 ；工艺优化 ；酵母菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.028
Screening of a Strain Producing Acid-stable α-Amylase and
Optimization of Its Fermentation Condition
Qu Jianhang1 Yin Yi1 Jiao Guobao2 Ding Changhe1 Zhang Qian1 Qu Lingbo1 Liu Zhongmin2
（1. College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450000 ；2. Henan Yangshao Biochemical Engineering
Company，Mianchi 472400）
Abstract: A strain SH3 producing acid-stable α-amylase was isolated from the soil nearing a starch factory. It was preliminarily identified
as yeast. The pH range of crude enzyme reaction was 3. 8-8. 0 with the optimum of 5. 0, and the activity of the enzyme was still available in the
temperature of 80℃ with the optimum of 50℃. The optimization of single-factor fermentation revealed that the optimal condition for the enzyme
production was 37℃, pH 5. 0, soluble starch as carbon source, peptone as nitrogen source and 200 mL liquid volume. Orthogonal test showed
that the optimal fermentation condition was as soluble starch of 15 g/L, peptone of 30 g/L, 37℃ and pH4. 5, under which the enzyme activity was
96.8 U/mg.
Key words: acid-stable α-amylase ；strain screening ；fermentation condition ；process optimization ；yeast
2015,31(7) 189屈建航等 ：酸性 α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究
研究且优化其发酵条件，旨在为工业利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土壤样品 河南省偃师某面粉厂污水排出口
处采集土壤样品。4℃保存备用。
1.1.2 培养基 筛选培养基（g/L）［1］：牛肉膏 3，
蛋白胨 10，NaCl 5，可溶性淀粉 10，琼脂粉 15，pH
5.0。种子及发酵培养基（g/L）［11］：胰蛋白胨 5，可
溶性淀粉 10，（NH4）2SO4 2.5，KH2PO4 3，CaCl2 0.2，
pH 调至 5.0。
1.2 方法
1.2.1 酸性 α-淀粉酶产生菌的分离筛选 初筛 ：土
壤样品，10 倍梯度稀释法涂布于筛选培养基，28℃
恒温培养。滴加碘液，记录有透明圈的菌株。复筛：
将初筛有透明圈的菌株，接种种子培养基，37℃、
200 r/min 培养 12 h，以 10% 的接种量转至发酵培养
基，相同条件培养 24 h。发酵液 5 000 r/min 离心 15
min，上清为粗酶液，测定酶活［1］。
1.2.2 淀粉酶活力测定方法 Yoo 酶活测定法［12，13］
稍加改进 ：2.5 mL 0.5% 可溶性淀粉溶液与 2.5 mL 柠
檬酸 - 磷酸盐缓冲液（pH5.0）50℃恒温水浴锅预热
10 min，加入酶液 0.5 mL，50℃下准确反应 10 min，
加入 5 mL 0.1 mol/L 的盐酸终止反应，取上述混合液
0.5 mL 与 5 mL 碘液混匀，660 nm 测定吸光度值 R（以
2.5 mL 蒸馏水代替可溶性淀粉溶液，其余条件相同
作为空白）。在上述反应条件下，以 0.5 mL 的缓冲
液代替 0.5 mL 酶液，测定吸光度值 R0
［11］。
酶活定义 ：50℃、pH5.0 条件下，10 min 水解 1
mg 淀粉所需的酶量为一个酶活力单位。
酶活公式：待测酶活（U/mg）=100*D*（R0-R）/R
其中，D ：稀释倍数，R0 ：对照吸光值，R ：酶
液的吸光值，100 ：转换系数。
1.2.3 菌种 ITS 序列鉴定
1.2.3.1 分子试剂及引物 Taq mix（TaKaRa）、ITS4
引 物 5-3 ：ggAAgTAAAAgTCgTAACAAgg、ITS5 引
物 5-3 ：TCCTCCgCTTATTgATATgC。
1.2.3.2 基因系统发育鉴定 基因组总 DNA 的提取
参考文献［14］进行。ITS 序列 PCR 扩增反应体系 ：
Taq mix 12.5 μL，ITS4 0.5 μL，ITS5 0.5 μL，ddH2O
9 μL，基因组 DNA 模板 2.5 μL，总体积 25 μL。反
应过程 ：95℃ 5 min，30 次循环（94℃ 30 s，55℃ 1
min，72℃ 1 min），72℃ 10 min。PCR 产物测定核苷
酸序列，GenBank 数据库完成 BLAST 比对。
1.2.4 酶学性质研究 37℃、200 r/min 培养 48 h 的
发酵液上清作为粗酶，pH3.8、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0
的缓冲条件，分别测定酶活以确定 pH 范围。设置
30、37、45、50、55、60、70 和 80℃温度条件测定
酶活以确定温度耐受性。
1.2.5 产酶发酵条件研究
1.2.5.1 菌株产酶曲线 种子液 10 mL 接种到 100
mL 发酵培养基，从 3 h 开始每小时测定酶活，以培
养时间为横坐标，酶活力为纵坐标绘制产酶曲线。
1.2.5.2 温度对菌株产酶的影响 以 5% 的接种量
将种子液接至 100 mL 发酵培养基，分别 28、37、
40℃振荡培养，从产酶高峰期开始每小时测定酶活。
1.2.5.3 初始 pH 对菌株产酶的影响 调节发酵培养
基初始 pH 值为 4.5、5.0、5.5、6.0，接入 5% 种子液，
37℃、200 r/min 培养，在产酶高峰期取样，测定酶活。
1.2.5.4 碳源对菌株产酶的影响 分别以 0.5% 葡萄
糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作为碳源，5% 的接种
量至 100 mL 发酵培养基中，37℃、200 r/min 培养，
在产酶高峰期测定酶活［15］。
1.2.5.5 氮源对菌株产酶的影响 分别以 0.5% 蛋白
胨、棉籽饼、黄豆饼、牛肉膏作为氮源，5% 的接种
量至 100 mL 发酵培养基中，37℃、200 r/min 培养，
在产酶高峰期测定酶活。
1.2.5.6 装液量对菌株产酶的影响 在 500 mL 三角
瓶中分别装入 50、100、150、200 mL 发酵培养基，
接入 5% 的种子液，37℃、200 r/min 培养，在产酶
高峰期测定酶活。
1.2.6 正交试验 根据单因素优化实验结果，针对
碳源、氮源、温度和 pH，经 SPSS 软件设计四因素
三水平正交实验［16］。
2 结果
2.1 菌株筛选
共筛选出产酸性 α-淀粉酶的菌株 24 株，部分
筛选结果见表 1，其中初筛 SH3 菌株，透明圈 / 菌
落直径比最大，D/d 为 5，选其作为实验菌株。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7190
表 1 菌种初筛结果
菌株编号 透明圈直径 D/mm 菌落直径 d/mm 圈径比 /（D·d-1）
SH3 20 4 5.00
SH7 9 7 1.29
SH9 16 7 2.29
XY8 35 18 1.94
XYY3 21 7 3.00
SY3 24 12 2.00
SY6 13 6 2.17
2.2 菌种鉴定
PCR 扩 增 菌 株 18S ITS 基 因 片 段， 测 序 后
GenBank 序列比对，结果与红酵母属（Rhodotorula
sp.）的序列同源性最高，为 97%（AM901697）-98%
（NR073315），基本确定为酵母菌。
2.3 产酶曲线
产酶曲线见图 1，由图 1 可见酶活先上升后下
降，在 14 h 酶活达到 91.4 U/mg，此后酶活迅速下降，
12-15 h 是高酶活时期。
发酵条件下研究温度对菌株 SH3 产酶的影响，结
果（图 2）表明，37℃和 40℃酶活均是先上升后下
降，37℃酶活 14 h 达到最高 91.6 U/mg，40℃酶活与
37℃相比上升较快，13 h 达到最高 91.3 U/mg，但下
降也较快。28℃菌体生长缓慢，高活性酶活出现较
晚。可能随温度升高生长代谢加快，产酶高峰期提前。
选取 37℃作为最佳发酵温度。
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20
䞦⍫U·mg-1  ᰦ䰤h
图 1 SH3 菌株产酶曲线图
2.4 酶的pH和温度范围
50℃、不同 pH 下测定菌株 SH3 的α-淀粉酶活力，
结果如表 2 所示。SH3 所产淀粉酶活力受酸碱度影
响较大，该酶在 pH3.8-8.0 之间均有酶活，在偏酸
性条件下酶活力较高，pH5.0 为酶反应最适 pH，酶
活为 79.8 U/mg。
pH5.0、不同温度下测定 SH3 酶活力，结果由
表 3 可知，该酶在 30℃-80℃均有酶活，30℃-50℃
酶活力随温度升高而升高，最适作用温度为 50℃，
酶活力为 74.2 U/mg。
2.5 产酶发酵条件优化结果
2.5.1 温度对菌株产酶的影响 28℃、37℃、40℃
䞦⍫࣋U·mg-1 
0
20
40
60
80
100
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17ᰦ䰤h28ć37ć40ć
图 2 温度对产酶的影响
表 2 酶的 pH 耐受范围
pH 酶活 /（U·mg-1）
3.8 43.7
4.0 59.2
4.5 63.8
5.0 79.8
6.0 68.7
7.0 65.4
8.0 60.7
表 3 酶的温度作用范围
温度 /℃ 酶活 /（U·mg-1）
30 35.6
37 42.7
45 48.3
50 74.2
55 64.9
60 59.2
70 41.3
80 29.6
2.5.2 装液量对菌株产酶的影响 由图 3 可知，在
发酵高峰期，相同时间内 200 mL 装液量的发酵酶活
最高，14 h 时达到最高 88.2 U/mg。
2.5.3 初 始 pH 对 菌 株 产 酶 的 影 响 选 取 pH4.5、
2015,31(7) 191屈建航等 ：酸性 α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究
5.0、5.5、6.0 的初始培养条件，分别测定 SH3 酶活
力，结果（图 4）表明，pH4.5-6.0 条件下菌体均能
生长，发酵 14 h 时测定酶活，pH5.0 发酵条件下酶
活最高，为 89.7 U/mg，依次高于 pH5.5、6.0 和 4.5，
其中 pH4.5 发酵条件下酶活相对最低，为 33.4 U/mg。
初始温度与 pH 四因素作三水平正交试验（表 5）。
由表 6 可知，最佳发酵条件为可溶性淀粉 15 g/L、
蛋白胨 30 g/L、37℃、pH4.5，对应酶活最高为 96.8
U/mg。极差分析结果可看出，碳源对菌株产酶的
影响最大，影响程度依次为 ：可溶性淀粉 > 蛋白胨
>pH> 温度。
表 5 四因素三水平表
水平
因素
碳源 氮源 温度 pH
1 10 g/L 可溶性淀粉 20 g/L 蛋白胨 28℃ 4.5
2 15 g/L 可溶性淀粉 25 g/L 蛋白胨 37℃ 5.0
3 20 g/L 可溶性淀粉 30 g/L 蛋白胨 40℃ 5.5
表 6 正交实验结果及极差分析结果
试验号 碳源 氮源 温度 pH 酶活 /（U·mg-1）
1 3 2 3 1 78.5
2 3 3 1 2 73
3 2 1 3 2 94.7
4 2 3 2 1 96.8
5 2 2 1 3 93.2
6 1 3 3 3 62.9
7 1 1 1 1 65.3
8 3 1 2 3 68.5
9 1 2 2 2 89.3
k1 94.9 87 78.7 80.2
k2 72.5 77.6 77.2 85.7
k3 73.3 76.1 84.9 74.9
R 22.4 10.9 7.7 10.8
3 讨论
酶 α-淀粉酶是基于淀粉糖原料生产产品过程中
使用的主要糖酶，在全球酶制剂产业中占 30% 左
右［17，18］。传统 α-淀粉酶最适作用 pH 值为 5.8-6.2，
而淀粉乳偏酸性（pH3.2-4.5），进一步糖化也是在酸
性条件（pH4.2-4.5）下进行，即液化前后需两次调
pH，影响产品提取，不利于节能减排。耐酸耐高温 α-
淀粉酶可有效解决这一问题，需求量越来越大，已
在欧美等发达国家得到广泛应用，但菌种选育等核
心技术也被国外跨国公司所垄断。我国缺乏高产菌
株，尚不能自主生产。
现阶段筛选得到的产酸性 α-淀粉酶菌株主要是
芽孢杆菌和曲霉［20，21，22］，普遍存在产酶水平较低
0
20
40
60
80
100
13 14 15
䞦⍫/U·mg-1  ᰦ䰤/h50 mL 100 mL 150 mL 200 mL
图 3 装液量对菌株产酶影响
2.5.4 碳源和氮源对菌株产酶的影响 由表 4 可知，
可溶性淀粉作为培养基碳源时酶活最高，为 87.95
U/mg，葡萄糖作碳源时酶活最低。而氮源中蛋白胨
为最佳氮源，酶活最高达到 93.39 U/mg，棉籽饼作
氮源时酶活最低，为 53.82 U/mg。
0
20
40
60
80
100
4.5 5 5.5 6
䞦⍫࣋U·mg-1 
pH
图 4 初始培养基 pH 条件对产酶的影响
表 4 碳源和氮源对菌株产酶的影响
碳源 酶活 /（U·mg-1） 氮源 酶活 /（U·mg-1）
葡萄糖 65.14 蛋白胨 93.39
蔗糖 74.45 棉籽饼 53.82
乳糖 79.28 黄豆饼 67.28
可溶性淀粉 87.95 牛肉膏 84.63
（NH4）2SO4 71.39
2.6 正交实验及结果
在单因素的基础上，对可溶性淀粉、蛋白胨、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7192
的问题，仍需在自然界筛选高酶活菌株，并进一步
优化耐酸、耐高温性能。采用基因工程技术对功能
基因进行定向改造，构建工程菌，是选育高产、高
性能菌株的重要途径［19］。
4 结论
从土壤样品中分离到一株产酸性 α-淀粉酶菌
株 SH3，该菌 18S ITS 序列与红酵母菌相似性 97%。
其酶活性最适作用 pH5.0，最适作用温度 50℃。最
佳发酵条件为可溶性淀粉 15 g/L、蛋白胨 30 g/L、
37℃、pH4.5，对应酶活力 96.8 U/mg。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）