全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
苏 云 金 芽 胞 杆 菌（Bacillus thuringiensis， 简 称
Bt）是一种在自然界中广泛存在的革兰氏阳性产芽
胞细菌［1］。Bt 在生长到稳定期后期时，细胞一端
或中央形成一个卵圆形的芽胞，同时母细胞中形成
一个或多个形状一致或不同的伴胞晶体（parasporal
收稿日期 : 2012-04-24
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31171911）, 国家“973”计划项目（2009CB118902）, 国家“863”计划项目（2011AA10A203）
作者简介 : 张彦蕊 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : Bt 新型杀虫基因的发掘 ; E-mail: xiaorui0501@126.com
通讯作者 : 张杰 , 男 , 博士生导师 , 研究方向 : 生防微生物分子生物学 ; E-mail: jzhang@ippcaas.cn
一种简单、快速的苏云金芽胞杆菌基因组
DNA 提取方法
张彦蕊1  束长龙1  宋福平1  黄大 2  张杰1
（1 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193 ；
2 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： 从培养时间、裂解溶液、抽提和沉淀时间等方面对苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）基因组 DNA 提取技
术进行改进。提取 8 株对蛴螬有杀虫活性的野生 Bt 菌株的基因组 DNA，分析其纯度，并进行 PCR 分析与酶切分析。试验结果表
明，新的提取方法耗时 36 min，明显短于旧方法所用时间（97 min）；两种方法提取的基因组 DNA A260/A280 均大于 1.8，无明显区
别 ；琼脂糖凝胶电泳结果显示，上样量相同时，新方法提取的基因组 DNA 浓度是旧方法的 5 倍以上 ；新方法提取的基因组 DNA
能作为模板灵敏地扩增出测试基因，所提取的 DNA 能被限制性内切酶完全酶切，证明 DNA 具有很高的纯度。本研究改进的基因
组 DNA 提取方法耗时短、产量高，并能满足 PCR 扩增、酶切等分子生物学需要。
关键词 ： 苏云金芽胞杆菌 基因组 DNA 提取 纯度 PCR 酶切
A Simple and Fast Method for Genomic DNA Extraction from
Bacillus thuringiensis Strains
Zhang Yanrui1 Shu Changlong1 Song Fuping1 Huang Dafang2 Zhang Jie1
（1State Key Laboratory of Biology for Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，
Beijing 100193 ；2Institute of Biotechnology Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract:  Extraction technique of genomic DNA form Bacillus thuringiensis was improved with regard to culturing time, lysis solution,
extraction and precipitation time in this study. Genomic DNA from eight Bacillus thuringiensis isolates toxic to scarab larvae were obtained by
this modified method, and purity of these DNA samples was assayed, then PCR amplification, restriction endonuclease enzyme reaction were
conducted respectively. The result indicated that 36 min was needed for the new method, while 97 min needed for the old method ；The A260/A280
value of the both DNA samples was beyond 1.8, no difference between them. Agarose gel electrophoresis analysis result showed DNA output of
the new method was more than five times higher than that of the old one ；The test gene could be amplified easily from DNA sample extracted by
the new method, and restriction reaction result indicated the genomic DNA obtained by modified method was digested completely, demonstrating
high purity of this DNA sample. The modified method is prominent on short time, high yield and purity, the DNA sample obtained can be used for
many molecular biology studies, including PCR amplification and restriction endonuclease digestion.
Key words:  Bacillus thuringiensis Genomic DNA Extraction Purification PCR Enzyme digestion
crystal）。到衰亡期时，Bt 母细胞在胞壁水解酶的作
用下裂解，伴胞晶体随着芽胞的释放而释放到胞外。
这些由 cry 基因编码的晶体蛋白多种害虫具有特异
的杀虫活性［2］。由于 cry 基因的高效和特异选择性，
这些基因已经被广泛用于转基因抗虫植物的开发与
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期198
应用，创造了巨大的经济效益与生态效益［3］。因此，
Bt 菌株的筛选与新基因发掘成为目前 Bt 的研究热点
之一。如何能从大量的 Bt 野生菌株资源中提取数量
多、质量高的基因组 DNA，是目前 Bt 杀虫新基因发
掘和相关基础研究亟待解决的问题。
传统的基因组提取方法主要有 CTAB 法和 SDS
法。CTAB 法提取 DNA 操作繁琐，耗时费力，所用
试剂成本较高，对细菌等微生物基因组 DNA 的提取
效果也不理想 ；SDS 法步骤较 CTAB 法简单，但是
提取的 DNA 浓度较低，对 DNA 的损伤较大，而且
也用到一些对人体有害的试剂［4-6］。上述方法不利
于基因组样品的高通量制备，需要建立更高效的 Bt
基因组制备方法。
由于 Bt 在芽胞释放时期，细胞壁溶解，RNA
转录与蛋白合成基本停止，胞晶混合物中蛋白成分
主要是伴胞晶体［7］，RNA 含量低［8］，有利于基因组
DNA 的制备。新方法缩短了提取时间，提取的 DNA
能满足基因克隆、鉴定等分子生物学需求，并且减
少了对人体有毒有害药品的使用，对提高 Bt 资源的
发掘效率有重要的意义。目前，本实验室已经分离
筛选到 8 000 余株 Bt 菌株，本研究从大量的菌株中
快速获得高质量的基因组 DNA，旨在进行从 Bt 胞晶
混合物中制备基因组 DNA 方法的探索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及来源 Bt HBF-1 菌株由河北农林科学
院植物保护研究所提供，它对蛴螬具有杀虫活性，
T13-C12、T13-D1、T13-D2、T13-D3、T13-D4、T13-
D5、T13-D6 等 7 株菌株为本实验室筛选分离的对蛴
螬有杀虫活性的 Bt 菌株。
1.1.2 培养基 LB 固体培养基 ：0.5% 酵母提取物，
1.0 % 胰蛋白胨，1.0% NaCl，1.3% 琼脂粉，pH7.0，
121℃灭菌 20 mim。
1.1.3 溶液与试剂 SⅠ：1.0 mol/L 蔗糖、25 mmol/L
Tris-Cl，25 mmol/L EDTA ；SⅡ ：200 mmol/L Tris-Cl，
10 mmol/L EDTA，2.0% SDS，500 mmol/L NaCl，
pH7.5；NSⅠ：4.0 mol/L 异硫氰酸胍，1.0 mol/L NaCl；
TE 缓冲液 ：10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，pH-
8.0 ；电泳缓冲液配制见分子克隆实验指南（第 3
版）［9］。
其他药品及试剂：2.0%（W/V）SDS、70% 乙醇；
SDS、Tris 平衡酚、琼脂糖、溶菌酶购自北京冰达生
物科技有限公司；核酸内切酶购自北京六合通经贸有
限 公 司 ；dNTPs Mixture、Taq 酶、10×PCR buffer、
BM5000 购自北京博迈德科技发展有限公司 ；D15000
DNA Marker 购自天根生化科技（北京）有限公司 ；
Tris、NaCl、EDTA、异硫氰酸胍、蔗糖、无水乙醇、
氯仿和异丙醇购自中保科农生物科技有限公司。
1.1.4 仪器 超净工作台（苏州净化设备厂）、高速
离心机（德国 Eppendorf，5415D 型）、电泳仪（北
京市六一仪器厂，DYY-5 型）、凝胶成像系统（美国
WEALTEC 公司，Dolphin-Doc）、微量紫外分光光度
计（美国 Thermo Finnigan，Nanodrop）、恒温水浴锅（余
姚长江温度仪表厂，DHW-420）。
1.2 方法
1.2.1 基因组的提取及电泳图谱制备
1.2.1.1 菌体培养与收集 将新鲜的待测菌种划线
接种到固体 LB 培养基上，每株菌种培养两份，一
份培养过夜 12 h 即可，另一份培养至菌体 80% 以上
裂解。
1.2.1.2 基因组 DNA 提取过程 刮取平板上的菌体
约 100 mg 至 1.5 mL EP 管中，旧方法的基因组提取
步骤及所需时间，见图 1-A，新方法的基因组提取
步骤及所需时间，见图 1-B。
1.2.1.3 DNA 浓度及纯度分析 浓度分析用 Image
J141 软件分析，用 1.0 μL λ DNA（0.3 μg/μL）作为
标准浓度。纯度分析见分子克隆手册第 3 版［10］。
1.2.1.4 电泳分析 将 10 μL 上述样品与 1.0 μL 10×
loading buffer 混匀，以 1.0 μL λ DNA 做对照，在含有
溴化乙锭的 0.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳，电压 50 V。
结束后紫外下拍照分析。对照电泳图谱分析 DNA 的
产量和完整性。
1.2.2 PCR 扩增 分别以两种方法提取的基因组
DNA 为模板进行 PCR 扩增。扩增测试基因选用在
Bt 菌株中分布广泛的插入序列 IS231，引物为 IS4: 5-
CATSSCCATCAASYTA AVR-3（S=G/C，Y=T/C，V=
G/C/A，R=G/A）［11］。反应体系（50 μL）：10×PCR
buffer（Mg2+ free）5.0 μL，Mg2+（25 mmol/L）4.0 μL，
2012年第11期 199张彦蕊等 ：一种简单、快速的苏云金芽胞杆菌基因组 DNA 提取方法
dNTPs mixture（各 2.5 mmol/L）4.0 μL，引物 1.0 μL，
基因组 DNA 1.0 μL，Taq 酶（5 U/μL）1.0 μL，ddH20
补 至 50 μL。 反 应 程 序 ：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 1 min，
40℃ 2 min，72℃ 3 min，35 个循环 ；最后终延伸 10
min。将 4.0 μL 上述样品与 1.0 μL 10×loading buffer
混匀，在含有溴化乙锭的 0.7% 琼脂糖凝胶上进行电
泳，电压 60 V。结束后紫外下拍照分析。
1.2.3 酶切分析 两种方法提取的基因组 DNA 用
EcoR Ⅰ进行酶切分析，酶切体系（100 μL）：基因
组 DNA 约 5.0 μg，酶 3.0 μL，10×H buffer 10.0 μL，
ddH20 补至 100 μL。反应程序 ：37℃保温 4 h。酶切
后反应液加 1/10 体积 3.0 mol/L 醋酸钠（pH5.2），2
倍体积预冷无水乙醇，-20℃沉淀 1 h，10 μL ddH20
溶解 DNA。电泳分析参照 1.2.2.4。
2 结果
2.1 基因组纯度分析
对提取的基因组DNA样品进行紫外光吸收分析，
结果（表 1）显示，其 OD260nm 与 OD280nm 光吸收的比
值在 1.8 以上，说明没有蛋白质的污染，但是由于
没有用 RNase 对 DNA 进行纯化，所以存在 RNA 污染。
对提取的基因组 DNA 样品进行浓度分析结果
（表 2）表明，新方法提取的基因组 DNA 浓度是旧
方法的 5 倍以上，明显优于旧方法。
2.2 基因组电泳图谱分析
用两种方法提取的基因组电泳图谱（图 2）显示，
图 1 两种方法提取基因组 DNA 步骤比较
5 min
1 min
A B
㩕ޫᵏ㓶㜎100 mg
200 μL Sĉˈ20 mg/mL
ⓦ㧼䞦ˈ37ćᆥ㛢
300 μL SĊˈ100 μL㤟䞊,
␧रˈ65ćᆥ㛢
ߧতਾ࣐ㅹփ〟≟ԯ
12 000 r/min⿫ᗳ
᭦䳶к␵ˈ࣐ㅹփ〟ᔲ
щ䞷ˈᇔ⑙䶉㖞
12 000 r/min⿫ᗳ
1 mL70%҉䞷⍇⏔⊹⏰
12 000 r/min⿫ᗳ
ⵏオᒢ⠕⊹⏰
100 μL TE㕃ߢ⏢ⓦ䀓⊹
㣭ᆒ䟺᭮ᵏ㓶㜎100 mg
200 μL TE㕃ߢ⏢ˈ␧र
200 μL 2% SDSˈ␧र
400 μL NSĉˈ␧र
12 000 r/min⿫ᗳ
᭦䳶к␵ˈ࣐550 μLᔲщ䞷
12 000 r/min⿫ᗳ
1 mL 70%҉䞷⍇⏔⊹⏰
12 000 r/min⿫ᗳ
ⵏオᒢ⠕⊹⏰
100 μL TE㕃ߢ⏢ⓦ䀓⊹
ᙫᰦ䰤 36 min
1 min
5 min
5 min
1 min
10 min
1 min
10 min
1 min
1 min
1 min
ᰦ䰤ᰦ䰤
30 min
20 min
10 min
10 min
5 min
10 min
1 min
5 min
97 minᙫᰦ䰤
表 1 DNA 样品的紫外光吸收分析表
菌株 OD260/OD280（新方法） OD260/OD280（旧方法）
T13-C12 2.03 1.97
T13-D1 1.88 2.04
T13-D2 2.07 2.00
T13-D3 1.98 2.03
T13-D4 2.07 2.11
T13-D5 1.99 2.12
T13-D6 1.81 2.31
HBF-1 2.00 2.02
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期200
表 2 DNA 样品的浓度分析表
M CK1 2 3 4 5 6 7 8
ᰗᯩ⌅
1 2 3 4 5 6 7 8
ᯠᯩ⌅
19329
bp
7743
6223
4254
3472
2690
1882
1489
M. λDNA/Eco130Ⅰ（λ/E）:19329、7743、6223、4254、3472、2690、
1882、1489、925、421(bp); 1. T13-C12; 2. T13-D1; 3. T13-D2; 4. T13-D3;
5. T13-D4; 6. T13-D5; 7. T13-D6; 8. HBF-1; CK: λDNA（48 kb）
图 2 两种方法提取的基因组 DNA 电泳图
用两种方法提取的基因组 DNA 在 λ DNA 48 kb 左右
都存在一条明显的条带。新方法提取的基因组 DNA
较旧方法条带清晰，产量高，并且由图可以看出新
方法提取的 DNA 中 RNA 残留少，而旧方法提取的
DNA 中 RNA 残留较严重。
M. DNA Marker; 1. T13-C12; 2. T13-D1; 3. T13-D2; 4. T13-D3; 5.
T13-D4; 6. T13-D5; 7. T13-D6; 8. HBF-1; CK. 空白对照
图 3 两种方法提取 DNA 的 PCR 扩增图谱
M CK1 2 3 4 5 6 7 8
ᰗᯩ⌅
1 2 3 4 6 7 85
ᯠᯩ⌅
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8
ᰗᯩ⌅
1 2 3 4 6 7 85
ᯠᯩ⌅
15000
10000
7500
5000
2500
1000
bp
M. DNA Marker; 1. T13-C12; 2. T13-D1; 3. T13-D2; 4. T13-D3; 5.
T13-D4; 6. T13-D5; 7. T13-D6; 8. HBF-1
图 4 两种方法提取基因组酶切电泳图
3 讨论
苏云金芽胞杆菌是革兰氏阳性菌，它的细胞壁
较革兰氏阴性菌致密、厚实，组分中肽聚糖和磷壁
酸含量高［12］，使得其细胞壁机械强度大，提取基因
组时破坏细胞壁较困难。传统的 Bt 基因组提取方法
是在高渗溶液中使细菌发生质壁分离，然后用溶菌
酶破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰氨基葡糖
之间的 β-1，4 糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解
成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细
菌溶解，这样破坏细胞壁有一定的局限性，条件要
求比较高，有可能使细胞壁破坏的不充分，故提取
的基因组产量较低。本研究改进的 Bt 基因组 DNA
提取方法需要培养至菌体 80% 以上裂解，裂解细胞
的细胞壁已经发生自溶，省去了溶菌酶破坏细胞壁
的过程，细胞内溶物释放较彻底，有利于基因组的
提取，故提取的基因组浓度大，产量高。用传统的
方法收集的营养期细胞合成代谢旺盛，基因转录活
跃，RNA 含量高，蛋白质种类多，含量大 ；而芽胞
菌株 浓度 ng/μL ( 新方法） 浓度 ng/μL ( 旧方法）
T13-C12 55. 30 2.25
T13-D1 45.77 2.94
T13-D2 65.77 0.57
T13-D3 132.25 3.06
T13-D4 57.92 2.11
T13-D5 60.94 2.21
T13-D6 57.22 5.93
HBF-1 63.84 13.4
2.3 PCR分析
对两种方法提取的基因组 DNA 进行 PCR 分析，
结果（图 3）显示，新方法所提取的基因组 PCR 扩
增条带比旧方法更清晰，说明新方法所提取的 DNA
可以满足 PCR 扩增的要求。
2.4 酶切分析
对两种方法提取的基因组 DNA 进行酶切分析。
由图 4 可以看出新方法所提 DNA 虽然浓度较大，但
是在 4 h 内均能充分酶切，酶切条带呈均匀的弥散状，
与旧方法没有明显差别，表明该方法所提取的基因
组 DNA 纯度很高，满足基因组文库构建、Southern
杂交等研究之需。
2012年第11期 201张彦蕊等 ：一种简单、快速的苏云金芽胞杆菌基因组 DNA 提取方法
释放期细胞将要进入休眠期，细胞壁溶解，合成代
谢减弱，RNA 合成下降，含量减少 ；胞晶混合物中
主要的成分是杀虫晶体蛋白，蛋白种类和含量少，
有利于 DNA 的提取，故改进的方法提取的 DNA 虽
然没有经过酚氯仿抽提，但是其 OD260nm 与 OD280nm
光吸收的比值在 1.8 以上，两种方法提取的基因组
DNA 蛋白质含量与旧方法无明显区别。
提取的 DNA 电泳结果显示，两种方法提取的基
因组 DNA 在 48 kb 左右都存在一条主要的条带，条
带大小无明显差异，说明本试验改进的基因组提取
方法提取的 DNA 很完整。结果还可以看出新方法提
取的基因组 DNA 较旧方法产量高，并且 RNA 残留少。
PCR 扩增结果显示，新方法所提取的基因组 DNA 能
作为模板进行 PCR 扩增，且扩增条带比旧方法清晰，
扩增结果不同可能是因为新方法提取的基因组 DNA
浓度明显大于旧方法所致，当然也可能是旧方法提
取的基因组 DNA 纯度不如新方法，导致扩增效果不
理想，尚需更多试验验证。酶切结果显示，新方法
提取的基因组 DNA 能被 EcoRⅠ充分酶切，呈均匀
的弥散状，与旧方法无明显差别，可用来构建基因
组文库或做 Southern 杂交。
两种方法提取基因组 DNA 所需步骤均为 11 步，
但是新方法提取基因组 DNA 所用时间大大减少，试
剂种类少、配制简单，获得的 DNA 浓度较高，为
Bt 新的杀虫基因的发掘创造了便利条件。但是由于
提取的 DNA 没有进行纯化，所以有 RNA 残留，虽
然 RNA 的存在对基因鉴定和克隆没有太大干扰，但
是今后提取可以在提取完成后用 RNA 酶处理来去除
RNA，以获得更纯的基因组 DNA 样品。
4 结论
本研究用苏云金芽胞杆菌芽胞释放期细胞提取
基因组 DNA，提取过程耗时 36 min，明显短于旧方
法所用时间（97 min）；两种方法提取的基因组 DNA
A260/A280 均大于 1.8，无明显区别 ；新方法提取的基
因组 DNA 浓度是旧方法的 5 倍以上，能作为模板灵
敏地扩增出测试基因并能被限制性内切酶完全酶切，
证明 DNA 具有很高的纯度。苏云金芽胞杆菌基因组
DNA 提取方法的改进对提高 Bt 资源的发掘效率有重
要意义，为芽胞杆菌分子生物学研究创造有利条件。
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（责任编辑 马鑫）