全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-04-20
基金项目 ：转基因重大专项课题（2011ZX08012-001,2009ZX08012-001B, 2008BAK41B01-2）
作者简介 ：陈丽丽，女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；E-mail：chenlilimm@126.com
通讯作者 ：黄新，男，副研究员；E-mail：huangx@caiq.org.cn
玉米基因组 DNA 提取及浓度测定方法评价
陈丽丽1,2 张鹏1 黄新2 朱水芳2
（1北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029 ；2中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所，北京 100029）
摘 要: 以非转基因玉米种子为材料，比较了常用的 3 种植物基因组 DNA 提取试剂盒及改良的 CTAB 法，通过琼脂糖凝胶
电泳、紫外分光光度及实时荧光 PCR 扩增检测，对提取得到的基因组 DNA 的纯度、得率及 4 种提取方法的重复性、提取时间进
行分析 ；比较紫外分光光度法、Qubit 荧光法、Pico Green 荧光分光光度法，以实时荧光定量 PCR 检测结果为参照，对 3 种 DNA
浓度测定方法的准确性进行分析。结果显示，磁珠法 (Promega) 最适合应用于快速、简便、高效检测中的植物基因组 DNA 提取，
能有效获得纯度高、完整性好的基因组 DNA，并且磁珠法提取效率高，重复性好，提取时间短 ；在基因组 DNA 浓度测定中，紫
外分光光度法、Qubit 荧光法、Pico Green 荧光分光光度法的相对误差分别为 99.8%、49.8% 和 28.9%，表明 Pico Green 荧光分光光
度法测定 DNA 浓度的准确度最高。
关键词: 基因组 DNA 提取效率 浓度测定
Research of Genome DNA Extraction and Concentration
Determination from Corn
Chen Lili1,2 Zhang Peng1 Huang Xin2 Zhu Shuifang2
（1College Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029 ；
2Institute of Animal and Plant Quarantien, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029）
Abstract: Three plant genomic DNA kits and a modified CTAB method were applied to extract genome DNA from non-GM corn. The
genome DNA extracted by these four methods was detected using agarose gel electrophoresis, ultraviolet spectrophotometry and real-time PCR
for analysis of its purity, yield, repeatability and extration time. The three methods, ultraviolet spectrophotometry, Qubit fluorescence and Pico
Green fluorescence spectrophotometry were used to determine the concentration of genome DNA. The detection of real-time quantitative PCR
was the control group for analysis these three methods’ accuracy. The results showed that the magnetic extraction method (Promega) has high
efficiency and good repeatability, requires short extraction and can produce genome DNA with integrality and high purity. The relative error of
ultraviolet spectrophotometry, Qubit fluorescence and Pico Green fluorescence spectrophotometry is 99.8%, 49.8% and 28.9% respectively. This
result indicated that Pico Green fluorescence spectrophotometry has the highest accuracy for determining the concentration of genome DNA.
Key words: Genome DNA Extraction efficiency Concentration determination
随着世界经济发展，我国进出口植物产品贸易
量不断增大，为了避免外来有害生物入侵的潜在危
害，有必要针对入境植物产品携带的有害生物建立
一种更为快速、简便、高效的检测方法。然而，植
物产品中有害生物较低的含量对检测过程中基因组
DNA 提取的效率、纯度及其浓度的定量都提出了很
高的要求。
目 前， 传 统 的 CTAB、SDS 法 被 广 泛 应 用 于
DNA 的抽提 [1]，但由于操作步骤繁琐，耗时长，不
能满足快速、简便、高效的要求。随着分子生物学
的发展，多种商业化的植物基因组 DNA 提取试剂盒
应运而生，这些试剂盒主要是利用离心柱、纳米磁
珠等介质直接吸附 DNA，洗脱得到纯净的 DNA，极
大地简化了操作步骤，方便快速。但现在鲜有针对
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不同类型的植物基因组 DNA 试剂盒的提取效率、纯
度进行分析和比较的相关报道。在植物基因组 DNA
提取过程中，植物种子中所含的酚类，多糖和蛋白
质等化合物，不仅会导致 DNA 的降解，也会抑制后
续分子试验中限制酶、连接酶及 DNA 聚合酶等酶类
的生物活性 [2,3]。能否完全破碎细胞并释放 DNA，提
取物的纯度及完整性是评价植物基因组 DNA 提取方
法的几个关键指标。
由于植物产品中的有害生物含量较低，我们需
要相对准确地测定 DNA 浓度，确保后续分子试验中
实时荧光 PCR[4，5]、基因芯片 [6] 等检测的顺利进行。
若测定的 DNA 浓度偏高，可能导致后续分子检测中
无法检出有害生物；若测定的 DNA 浓度偏低，可能
扩大 DNA 提取物中抑制成分对后续分子检测的影
响。目前，常用的 DNA 浓度测定方法有紫外分光光
度法、Qubit 荧光法和 Pico Green 荧光分光光度法。
但是，这几种方法测定 DNA 浓度的准确性如何，到
目前为止没有文献或资料有明确报道。
本研究以玉米种子为材料，采用 3 种常用的植
物基因组 DNA 提取试剂盒及改良 CTAB 法提取基因
组 DNA，分析比较各种方法获得的基因组 DNA 纯度、
得率、重复性及提取时间；以特异的实时荧光 PCR
定量检测结果为参照，比较紫外分光光度计、Qubit
荧光仪、Pico Green 荧光分光光度计定量的准确程度，
从而为合理选择最适合快速、简便、高效检测的基
因组 DNA 提取和浓度定量的方法提供参考。
1 材料与方法
1.1　材料
非转基因玉米种子由中国检验检疫科学研究院
动植物检疫研究所提供，非转基因玉米核酸标准品
购自美国油脂化学协会（AOCS）。
所 用 试 剂 为 MIX（ABI 公 司 ）； DNeasy Plant
Mini Kit（QIAGEN）；Plant Genomic DNA Kit
（TIANGEN）；Wizard Magnetic DNA Purification
System For Food（Promega）；Quant-iT dsDNA HS
Assay Kit（Invitrogen）；Quant-iT PicoGreen dsDNA
Kit（Invitrogen）。
所用仪器为贝克曼冷冻离心机（Beckman 公
司 ）；BIO-RAD Model 3000Xi 电 泳 仪（BIO-RAD 公
司）；ALPHA 5500 凝胶成像仪（ALPHA 公司）；ABI
7900 实时荧光 PCR 仪（ABI 公司）；Evolution-3000
紫外可见分光光度计（Thermo 公司）；F-4600 荧光
分光光度计（日本 HITACHI 公司）；Qubit 荧光仪
（Invitrogen）。
引物及探针，使用中华人民共和国国家标准
GB/T 19495.5-2004 公布的检测玉米内源 zss Ⅱ b 基
因的引物序列和探针序列，由上海基康生物技术有
限公司合成。引物及探针序列，如表 1 所示。
表 1 实时荧光 PCR 引物和探针
检测基因 编号 序列(5-3) 片段长度（bp）
zssⅡb zssⅡb-R
CTCCCAATCCTTTGACATCTGC
TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG
FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA
151
1.2 方法
1.2.1 玉米种子基因组 DNA 的提取方法 改良的
CTAB 法，参照文献 [7]，提取基因组 DNA，即把
非转基因玉米种子研磨成粉末，作为样品，称取
100 mg 样品，转移至 1.5 mL 离心管，加 500 μL CTAB
缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-
HCl，20 mmol/L EDTA，pH8.0），混合溶液于 65℃
孵育 30 min ；向上述反应体系中加入 500 μL Tris 饱
和 苯 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇（25 24 1）， 混 匀 ；4 ℃，
12 000×g 离 心 10 min， 上 层 液 转 移 至 另 一 新 的
1.5 mL 灭菌离心管中，加 2×V CTAB 沉淀液（5 g/L
CTAB，0.04 mol/L NaCl），室温下孵育 60 min ；4℃，
12 000×g 离 心 5 min， 弃 上 清 液 ；用 350 μL NaCl
（1.2 mol/L）溶解沉淀，待沉淀溶解后，加 350 μL 氯
仿，混匀；4℃，12 000×g 离心 10 min，将上清液（透
明）转移至另一新的 1.5 mL 灭菌离心管中，加 0.6×V
异丙醇，充分混匀 ；4℃，12 000×g 离心 5 min，弃
上清液 ；用 70% 乙醇洗涤沉淀，室温干燥后，将
DNA 溶解在 100 μL 灭菌双蒸水中。离心柱提取纯化
法（QIA-GEN）、离心柱提取纯化法（TIANGEN）和
陈丽丽等 ：玉米基因组 DNA 提取及浓度测定方法评价研究
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期72
磁珠提取纯化法（Promega），按试剂盒说明书进行，
均称取 100 mg 样品进行提取，最后用 100 μL TE 缓
冲液溶解 DNA。以上所有操作均在同一次试验中平
行完成，并做 3 次重复试验。提取好的基因组 DNA
作为非转基因玉米样品，备用。
1.2.2　DNA 产物的检测
1.2.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测 各取 5 μL 非转基因
玉米样品，用 SYBR Green Ⅰ染色，1% 琼脂糖凝胶
电泳进行检测。电压 125 V，室温下电泳 30 min 后
取出，用凝胶成像系统检测电泳结果并拍照保存。
1.2.2.2 紫外分光光度计检测 各取 1 μL 非转基因
玉米样品稀释至 10 μL，使用 Evolution-3000 紫外可
见分光光度计分别测定 260 nm 和 280 nm 处的紫外
吸收值，计算 260 nm 和 280 nm 处的紫外吸收值的
比值，来判断提取的基因组 DNA 纯度。
1.2.2.3 实时荧光 PCR 扩增检测 扩增基因为玉米
内源基因 zss Ⅱ b，上下游引物序列见表 1，扩增片
段长度为 151 bp。根据 GB/T 19495.5-2004 公布的玉
米内源基因 zss Ⅱ b 反应体系，以 4 倍梯度稀释的非
转基因玉米核酸标准品为模板，构建实时荧光 PCR
标准曲线。同时，对非转基因玉米样品进行实时荧
光 PCR 扩增。
反应体系：Mix 12.5 μL，上游引物 1.25 μL（10 μm
ol/L），下游引物 1.25 μL（10 μmol/L），探针 0.5 μL
（10 μmol/L）， 模 板 5 μL， 加 ddH2O 至 总 体 积 为
25 μL。
反应程序：50℃ 2 min，95℃ 10 min，以 95℃ 15 s、
60℃ 1 min 进行 40 个循环，60℃收集，FAM 荧光检测。
1.3　非转基因玉米样品DNA浓度检测方法
1.3.1 紫外分光光度法检测 用 Evolution-3000 紫外
可见分光光度计测定非转基因玉米样品 A260、A280 及
A320，并计算出样品的 DNA 浓度值。
1.3.2 Qubit 荧光法检测 根据 Qubit 荧光仪使用说
明，选择 Quant-iT dsDNA HS Assay Kit，按照操作说
明，测定非转基因玉米样品 DNA 浓度。
1.3.3 Pico Green 荧光分光光度法检测 使用荧光分
光光度计，选择 Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit，按
照操作说明，首先构建 DNA 浓度 - 荧光值标准曲线，
然后根据标准曲线分析非转基因玉米样品 DNA 浓
度。荧光检测采用 480 nm 激发，520 nm 收集荧光
信号。
2 结果
2.1 基因组DNA的检测
2.1.1 基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测 基因
组 DNA 的电泳检测结果，见图 1。由图可知，4 种
方法提取的基因组 DNA 主带均很清晰，表明提取物
具有很好的完整性 ；但是，4 种方法获得的提取物
浓度有差异，磁珠法（Promega）提取出的 DNA 条
带较亮，浓度较高，离心柱法（QIAGEN）提取出的
DNA 条带偏暗，浓度偏低。
2.1.2 基因组 DNA 的紫外分光光度计检测 使用
紫外分光光度计测量基因组 DNA 在 260 nm 和 280
nm 处的紫外吸收值 OD260 和 OD280，平行测量三次取
平均值，计算出的 OD260/OD280，见表 2。结果显示，
除了离心柱法（TIANGEN），其他 3 种方法提取的
基因组 DNA 的 OD260/OD280 在 1.8-2.0 之间，提取的
DNA 均有很好的纯度。
2.1.3 基因组 DNA 的实时荧光 PCR 扩增检测 对
非 转 基 因 玉 米 核 酸 标 准 品 进 行 4 倍 梯 度 稀 释
（0.05-50 ng/μL），构建标准品实时荧光 PCR 标准曲
线，结果见图 2。结果显示，标准曲线斜率为 -3.337，
且相关系数 R2 达到 0.999，具有很好的线性关系，
可用于 4 种方法提取的 DNA 的浓度测定。
图 1 基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测图
M.2000 bp Marker；1-3. 改良 CTAB 法；4-6. 离心柱法（TIANGEN）；
7-9. 离心柱法（QIAGEN）；10-12. 磁珠法（Promega）
表 2 基因组 DNA 的 OD260/OD280
提取方法 OD260/OD280
改良CTAB法
离心柱法（QIAGEN）
离心柱法（TIANGEN）
磁珠法（Promega）
1.80
1.82
1.71
1.91
2011年第12期 73陈丽丽等 ：玉米基因组 DNA 提取及浓度测定方法评价研究
分别以 4 种提取方法获得的基因组 DNA 为模
板，进行实时荧光 PCR 扩增反应，通过标准曲线，
计算出不同提取方法获得的 DNA 浓度，结果见表
离 心 柱 法（TIANGEN）、 改 良 CTAB 法 和 离 心 柱
法（QIAGEN）。针对 4 种提取方法进行的重复性
验证及提取时间比较，表明每种提取方法的变异系
数（%）在 0.1-0.5 之间，均具有很好的稳定性。磁
珠法（Promega）、离心柱法（TIANGEN）和离心柱
法（QIAGEN）3 种试剂盒提取时间较改良 CTAB 法
明显缩短，以磁珠法（Promega）提取时间最短，在
1 h 内完成提取。通过实时荧光 PCR 检测表明，此
基因组 DNA 适用于后续分子试验操作。
提取方法 DNA浓度（ng/μL） 得率
改良CTAB法
离心柱法（QIAGEN）
离心柱法（TIANGEN）
磁珠法（Promega）
3.488
3.387
4.685
8.137
348.8 ng/100 mg
338.7 ng/100 mg
468.5 ng/100 mg
813.7 ng/100 mg
表 3 实时荧光 PCR 检测比较 4 种基因组DNA 提取方法结果
提取方法 样品Ct值 Ct平均值 SD CV（%） 提取时间（h）Ct1 Ct2 Ct3
改良CTAB法
离心柱法（QIAGEN）
离心柱法（TIANGEN）
磁珠法（Promega）
28.01
28.07
27.58
26.72
27.99
28.14
27.44
26.90
27.96
28.17
27.67
26.92
27.99
28.12
27.57
26.85
0.03
0.05
0.12
0.11
0.11
0.18
0.44
0.41
4-5
1-１.5
1-1.5
1
表 4 四种基因组 DNA 提取方法重复性及提取时间比较
DNA浓度检测方法 浓度（ng/μL） 平均浓度（ng/μL） 标准浓度（ng/μL） 相对误差C1 C2 C3
紫外分光光度法
Qubit荧光法
PicoGreen分光光度法
4313.241
16.387
11.857
4092.414
16.206
11.210
4325.409
16.077
11.287
4243.683
16.224
11.451
8.137
99.8%
49.8%
28.9%
表 5 非转基因玉米样品 DNA 浓度测量结果及相对误差
1. 50 ng/μL ；2. 12.5 ng/μL ；3. 3.13 ng/μL ；4. 0.78 ng/μL ；
5. 0.20 ng/μL ； 6. 0.05 ng/μL
图 2 非转基因玉米标准品实时荧光 PCR 标准曲线
3。从表中可见，在实时荧光 PCR 检测中，磁珠法
（Promega）提取获得的 DNA 浓度及得率最高，分别
为 8.137 ng/μL 和 813.7 ng/100 mg。
2.2 基因组DNA提取方法重复性及提取时间比较
为了检测 4 种基因组 DNA 提取方法的重复性，
平行做 3 次提取，并分别以基因组 DNA 作为模板进
行扩增检测，得到的 Ct 值进行汇总，见表 4。结果
显示，4 种提取方法得到的 Ct 值变异系数（%）在
0.1-0.5 之间，均小于 25%，证明 4 种方法的重复性
均很好 ；从提取时间方面考虑，磁珠法最快，只需
1 h 就能完成提取。
2.3 三种方法测定玉米样品DNA浓度结果
以 1.2 中磁珠法（Promega）提取的 DNA 为待
测样品，分别使用紫外分光光度计、Qubit 荧光仪、
PicoGreen 荧光分光光度计进行 DNA 浓度检测，并
做 3 次重复，以实时荧光 PCR 检测获得的磁珠法
（Promega）DNA 浓度为标准浓度，进行准确度分析，
结果见表 5。
结果显示，使用紫外分光光度计、Qubit 荧光仪
和 PicoGreen 荧光分光光度计检测得到的 DNA 浓度，
与标准浓度相比，相对误差分别为 99.8%、49.8% 和
28.9%。
3 讨论
研究表明，4 种提取方法均可以提取出完整的
基因组 DNA，除离心柱法（Tiangen）外，其余 3 种
方法提取的 DNA 均有很好的纯度。但提取得率存
在明显差异，从高到低依次为 ：磁珠法（Promega）、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期74
3 种 DNA 浓度测定方法对基因组 DNA 的定量
结果显示，以实时荧光 PCR 定量检测结果为参照标
准，紫外分光光度法、Qubit 荧光法、Pico Green 荧
光分光光度法的相对误差分别为 99.8%、49.8% 和
28.9%。可见，3 种 DNA 浓度测定方法的准确度有
很大差异，其中 Pico Green 荧光分光光度法的准确
度最高。
4 结论
综上所述，可以选用磁珠法（Promega）提取植
物基因组 DNA、Pico Green 荧光分光光度法测定基因
组 DNA 浓度，应用于快速、简便、高效的检测技术中。
参 考 文 献
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［2］ 谢友菊 . 遗传工程概论［M］. 北京 : 北京农业大学出版社，
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［7］ 郑文杰，刘烜，刘伟，等 . 转基因大豆加工产品的定性 PCR 检
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（责任编辑 狄艳红）