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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
布拉酵母（Saccharomyces boulardii）是酿酒酵
母的一个亚种，有缓解腹泻症状的独特作用。作用
机制包括直接抗毒素、中和毒素、抑制病原菌的生
长和侵入、增强肠道黏膜的免疫功能等［1］。其活菌
收稿日期 ：2013-02-26
基金项目 ：科技支撑计划课题（2013BAD10B02, 2011BAD26B02），中国农业科学院基本科研业务费（1610032012042）
作者简介 ：胡小媛，女，硕士研究生，研究方向 ：工业微生物 ；E-mail ：huxiaoyuan1034@163.com
通讯作者 ： 滕达，女，副研究员，研究方向 ：抗菌蛋白和发酵饲料蛋白 ；E-mail ：tengda@caas.cn ；
黄建忠，男，教授，博士生导师，研究方向 ：酶制剂 ；E-mail ：hjz@fjnu.edu.cn ；
王建华，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：微生物生物技术 ；E-mail ：wangjianhua@caas.cn
防腹泻布拉酵母培养条件的响应面法优化
胡小媛1，2  滕达2  张勇2  毛若雨2  王秀敏2  黄建忠1  王建华2
（1 . 福建师范大学生命科学学院 工业微生物教育部工程研究中心 福州 350108 ；2. 中国农业科学院饲料研究所基因工程室
农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081）
摘 要 ： 在摇瓶水平上对布拉酵母（Saccharomyces boulardii）培养基及培养条件进行优化。先通过单因子法筛选最优碳源、
氮源及无机盐，再利用响应面法优化发酵培养基组分及培养条件，采用 Plackett-Burman 法筛选影响布拉酵母生长的主要因素，用
最陡爬坡试验及 Box-Benhnken 设计进一步优化选定的主要因素。得出最佳发酵培养基为 ：麦芽糖 2%，蛋白胨 2%，酵母浸提取物
2.08%，培养基初始 pH 值为 6 ；最佳发酵条件为 ：温度 29.6℃，转速 250 r/min，250 mL 三角瓶培养基装量 29 mL，接种量为 5%，
培养时间为 24 h。优化后的布拉酵母菌体湿重达到 32.2 g/L，比优化前（20.9 g/L）提高了 54.1% ；优化后活菌数达 8.3×108 CFU/
mL，比优化前（5.5×108 CFU/mL）提高了 50.9%。
关键词 ： 布拉酵母 响应面法 优化 培养条件 防腹泻
Optimization of Cultivation Conditions of Saccharomyces boulardii
Against Diarrhea Using Response Surface Method
Hu Xiaoyuan1，2 Teng Da2 Zhang Yong2 Mao Ruoyu2 Wang Xiumin2 Huang Jianzhong1 Wang Jianhua2
（1. College of Life Science，Engineering Research Center of Industrial Microbiology，Fujian Normal University，Fuzhou 350108 ；
2. Key Laboratory of Feed Biotechnology of MOA，Gene Engineering Laboratory，Feed Research Institute，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract:  The fermentation medium and conditions of Saccharomyces boulardii were optimized based on single-factor experiments
and response surface method. Single-factor experiments were performed to select the optimal carbon source, nitrogen source and inorganic
salt. Response surface method was used to optimize the fermentation medium and conditions. A Plackett-Burman design was used to evaluate
the effects of eight factors ；the path of steepest ascent and the Box-Behnken design were performed for further optimization. The optimal
fermentation medium contained 2% of maltose, 2.08% of yeast extract, 2% of glucose, with initial pH value of 6.0. The optimal fermentation
conditions were as follows ：5% inoculums added to 250 mL erlenmeyer flask with 29 mL medium volume were cultured with shaking speed
250 r/min at 29.6℃ for 24 h. In the optimal fermentation medium and conditions, the cell wet weight of Saccharomyces boulardii increased
from 20.9 g/L to 32.2 g/L, increased by 54.1%, the number of viable yeast increased from 5.5×108 CFU/mL to 8.3 ×108 CFU/mL, increased by
50.9%.
Key words:  Saccharomyces boulardii Response surface method Optimization Cultivation conditions Anti-diarrhea
制剂曾主要用于预防和治疗儿童及成人多种肠道疾
病，如急性腹泻、抗生素相关腹泻、旅行者腹泻等，
具有良好疗效且安全［2-4］。布拉酵母在动物养殖中
亦显示良好效果，如控制肉鸡沙门氏菌感染［5］、降
2013年第6期 195胡小媛等 ：防腹泻布拉酵母培养条件的响应面法优化
低大肠杆菌内毒素对断奶仔猪的危害，减少死亡率［6，
7］。另外，酵母细胞含丰富的蛋白质、维生素、各种
酶等营养成分和协同因子［8］，为动物补充各种营养
及生长因子，促其健康生长。预期布拉酵母作为安
全饲料添加剂在促进饲用抗生素减量使用中有一席
用武之地，前景良好，行业刚开始使用，菌种改良
和发酵优化提高潜力大。本文拟以响应面法优化布
拉酵母培养条件，提高酵母生物量，旨在为规模化
生产奠定技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 布拉酵母，本实验室保藏。
1.1.2 培养基 初始发酵培养基 ：YPD 培养基（2%
葡萄糖，2% 蛋白胨，1% 酵母浸提取物）；碳源优化
基础培养基 ：2% 蛋白胨，1% 酵母浸提取物 ；氮源
优化基础培养基 ：2% 麦芽糖，0.5% 酵母浸提取物 ；
无机盐优化基础培养基：2% 麦芽糖，2% 蛋白胨，1%
酵母浸提取物。
1.2 方法
1.2.1 种子液培养 挑取布拉酵母单菌落接种至
YPD 液体培养基中，30℃，250 r/min，振荡培养至
OD600nm 为 6.0。
1.2.2 初始发酵培养条件 250 mL 三角瓶装 50 mL
培养基，接量 1%，30℃，250 r/min，培养 24 h。
1.2.3 布拉酵母生物量测定 比浊法 ：在 600 nm 下
测定适当稀释的的发酵液的 OD 值。菌体湿重 ：发
酵液 5 000 r/min 离心 10 min，收集菌体，用生理盐
水重悬，再 5 000 r/min 离心 10 min，尽量吸除上清，
称重。活菌计数 ：平板计数法［9］，将布拉酵母发酵
液制成一系列 10 倍梯度稀释的菌液，每个梯度取
100 μL 稀释液涂布于平板上，培养后，统计菌落数
目（菌落数在 30-300 为有效计数），计算出活菌数。
1.2.4 生长曲线的绘制 将布拉酵母种子液按 1%
的接种量接种于盛有 250 mL YPD 液体培养基的三
角瓶中，再分装于 25 个 50 mL 三角瓶，装液量均为
10 mL，置于 30℃摇床中 250 r/min 培养。从接种时
开始计时，每隔 2 h 取出一个三角瓶，测发酵液的
OD600nm。以时间为横坐标，OD600nm 值为纵坐标绘制
出布拉酵母的生长曲线。
1.2.5 试验设计
1.2.5.1 单因子试验 不同碳源对布拉酵母菌生长
的影响 ：配制碳源优化基础培养基，分别加入 2%
葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、乳糖及可溶性淀粉
作为碳源，按方法 1.2.2 基础发酵培养条件进行发酵
后，将发酵液适当稀释，测其 OD600nm。
不同氮源对布拉酵母生长的影响 ：配制氮源优
化基础培养基，分别加入 2% 玉米浆膏、蛋白胨、
硫酸铵、硝酸钾及尿素作为氮源，按方法 1.2.2 基础
发酵培养条件进行发酵后，将发酵液适当稀释，测
其 OD600nm。
无机盐对布拉酵母生长的影响 ：配制无机盐优
化基础培养基，分别添加磷酸二氢钾、硫酸镁、无
水氯化钙，添加浓度设 0.05% 和 0.1% 两个梯度，按
方法 1.2.2 基础发酵培养条件进行发酵后，将发酵液
适当稀释，测其 OD600nm。
1.2.5.2 Plackett-Burman（PB）试验 在单因子试验
结果的基础上，选取可能影响酵母生物量的 8 个因
素 ：麦芽糖、蛋白胨、酵母浸提取物、初始 pH 值、
接种量、装液量、培养温度和摇床转速，作为研究
对象，每个因素取 2 个水平 ：低水平（-1）和高水
平（+1），另外设置 3 项虚拟项，以考察误差。按照
试验设计表 2，在不同条件下培养 24 h，取出后适
当稀释测发酵液 OD600nm，使用 Design-Expert7.1.6 软
件分析试验结果。
1.2.5.3 最陡爬坡试验 将 PB 试验筛选出的对布拉
酵母生长影响显著的因素作为考察对象，根据显著
因素的正负效应确定最陡爬坡试验的变化方向和变
化步长，快速地逼近最大响应区域。按试验设计培
养 24 h，发酵液适当稀释，测 OD600nm。
1.2.5.4 Box-behnken 设计 以 PB 试验筛选得到的
对酵母生长影响显著的因素作为设计因素，以最陡
爬坡试验得出的条件作为中心点，每个因素取 3 个
水平，以（-1，0，+1）编码。培养 24 h 取发酵液适
当稀释 OD600nm，使用 Design-Expert7.1.6 软件对试验
结果进行响应面分析。
2 结果
2.1 布拉酵母生长曲线
以 培 养 时 间 为 横 坐 标， 各 时 间 点 的 发 酵 液
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期196
OD600nm 值为纵坐标绘制布拉酵母生长曲线，从图 1
中可知，布拉酵母在 YPD 培养基中，0-2 h 处于迟
滞生长期，2-24 h 处于对数期，24 h 之后达到稳定期，
所以将优化过程中的发酵时间设为 24 h。
物中已含足够的无机盐，故培养基中不需再额外添
加无机盐。
表 1 无机盐对布拉酵母生长的影响
无机盐种类 添加量（%） OD600nm
磷酸二氢钾 0.05 20.01
0.1 19.17
硫酸镁 0.05 19.11
0.1 20.19
无水氯化钙 0.05 19.44
0.1 18.93
对照 0 19.8
2.5 Plackett-Burman（PB）设计法筛选显著影响
因素
发 酵 24 h 后 取 样， 测 发 酵 液 OD600nm（ 表 2）。
利用 Design-Expert7.1.6 软件进行分析，得到各因素
对酵母生长的效应度及贡献值，结果如表 3 所示，
表明酵母浸提取物、装液量和培养温度是 3 个影响
最显著的因素。其中，酵母浸提取物为正效应，而
装液量和温度为负效应。针对以上 3 个显著因素进
行进一步优化，其他因素影响相对不显著，呈正效
应的因素维持在高水平，呈负效应的维持在低水平。
2.6 最陡爬坡试验逼近最优值所在的邻近区域
根据 Plackett-Burman 试验结果，对 3 个显著因
素酵母浸提取物、装液量和温度进行最陡爬坡试验，
寻找最优值区。试验结果如表 4 所示，第 3 组试验
条件下最利于酵母生长，故以第 3 组试验条件作为
响应面试验因素水平的中心点。
2.7 响应面分析确定显著影响因素的最优值
根据最陡爬坡试验结果确定中心点，采用 Box-
Behnken 试验设计确定显著因子的最优水平，试验
12 18 24 30 36 42 48ษޫᰦ䰤h60
0
2
4
6
8
10
O
D
60
0n
m 12
14
16
18
图 1 布拉酵母的生长曲线
2.2 碳源种类优化
在碳源优化基础培养基的基础上，考察不同碳
源对布拉酵母生长的影响，图 2 结果显示麦芽糖效
果明显优于其他碳源，故选择麦芽糖为下一步试验
碳源。
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
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O
D
60
0n
m
图 2 不同碳源种类对布拉酵母生长的影响
2.3 氮源种类优化
在氮源优化基础培养基的基础上，考察不同氮
源对布拉酵母生长的影响，从图 3 中可见，以蛋白
胨作为氮源的效果最好，故选择蛋白胨为下一步试
验氮源。
2.4 无机盐优化
从表 1 中可看出，与对照相比，添加 0.05% 或
0.1% 的无机盐对布拉酵母的生长均没有明显促进效
果，且添加无水氯化钙对布拉酵母有微弱抑制作用。
说明基础培养基中的天然成分蛋白胨和酵母浸提取
图 3 不同氮源种类对布拉酵母生长的影响
22
20
18
16
14
12
10
8
6
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2
0 ⦹㊣⍶㞿 㳻ⲭ㜘 ⺛䞨䬥≞Ⓚ ⺍䞨䫮 ቯ㍐
O
D
60
0n
m
氮源
2013年第6期 197胡小媛等 ：防腹泻布拉酵母培养条件的响应面法优化
设计见表 5 和表 6。并由 Design-Expert7.1.6 软件拟
合得到多元回归模型为 ：
Y（酵母发酵液 OD600nm）= +25.31-0.76 X1+0.73
X2-0.23 X3+ 0.23 X1X2-0.40 X1X3+0.24 X2X3-1.31 X1
2-
1.81 X2
2-0.22 X3
2。
对回归方程进行方差分析，分析结果见表 7，
该 模 型 P 值 为 0.006 5<0.05， 说 明 回 归 方 程 的 显
著性及可靠性较高，且该方程的决定系数 R2 值为
90.91%，说明该模型与实际拟合良好。另外，该模
型失拟 P 值 0.7058>0.05，可知该模型失拟不显著。
对回归模型进行响应面分析，得到各响应面三维曲
面图和等高线图（图 4），从图 4 可看出 X1，X2，X3
存在极值点，为求得模型极值点，对回归方程求解，
表 2 N=12 的 Plackett-Burman 设计及结果
序号 A B C D E F G H J K L OD600nm
1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 15.78
2 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 15.12
3 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 12.45
4 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 16.95
5 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 -1 1 19.23
6 1 -1 1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 11.52
g7 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 14.91
8 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 19.59
9 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 16.11
10 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 11.91
11 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 19.08
12 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 8.25
表 3 Plackett-Burman 试验设计的因素、水平及影响效果
因素代号 因素 高水平 低水平 效应度 贡献率（%）
A 麦芽糖（%） 2 1 0.20 0.089
B 蛋白胨（%） 2 1 1.67 6.20
C 酵母浸提取物（%） 1 0.5 2.00 8.89
D 初始 pH 值 6 4.5 0.010 0.0002
E 接种量（%） 5 1 1.86 4.17
F 装液量（mL） 50 30 -2.71 11.96
G 培养温度（℃） 37 30 -5.14 56.25
H 转速（r/min） 250 150 0.93 6.80
J 空项 — — 1.43 5.60
K 空项 — — -0.060 0.0080
L 空项 — — 0.022 0.0011
表 4 最陡爬坡试验设计及结果
序号 装液量（mL） 酵母浸提取物（%） 培养温度（℃） OD600nm
1 40 1 34 19.67
2 35 1.5 32 22.08
3 30 2 30 24.34
4 25 2.5 28 22.19
5 20 3 26 21.93
表 5 响应面分析试验因素及水平
因素代码 因素
水平
Low（-1） Center（0） High（1）
X1 装液量（mL） 25 30 35
X2 酵母浸提取物（%） 1.5 2 2.5
X3 培养温度（℃） 28 30 32
表 6 Box-Behnken 试验设计与结果
RUN X1 X2 X3 Y（OD600nm）
1 -1 -1 0 22.44
2 -1 1 0 23.04
3 1 -1 0 20.88
4 1 1 0 22.41
5 0 -1 -1 22.65
6 0 -1 1 22.05
7 0 1 -1 24.03
8 0 1 1 24.39
9 -1 0 -1 24.75
10 1 0 -1 23.61
11 -1 0 1 24.75
12 1 0 1 22.02
13 0 0 0 24.93
14 0 0 0 25.02
15 0 0 0 26.70
16 0 0 0 25.05
17 0 0 0 24.87
表 7 Box-Behnken 试验结果的方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值
模型 33.19 9 3.69 7.78 0.0065
X1-X1 4.59 1 4.59 9.68 0.0170
X2-X2 4.28 1 4.28 9.02 0.0198
X3-X3 0.42 1 0.42 0.88 0.3787
X1X2 0.22 1 0.22 0.46 0.5211
X1X3 0.63 1 0.63 1.33 0.2861
X2X3 0.23 1 0.23 0.49 0.5082
X1
2 7.22 1 7.22 15.23 0.0059
X2
2 13.82 1 13.82 29.16 0.0010
X3
2 0.21 1 0.21 0.44 0.5294
Residual 3.32 7 0.47
Lack of Fit 0.90 3 0.30 0.49 0.7058
Pure Error 2.42 4 0.61
Cor Total 36.50 16
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期198
得到酵母浸提取物、装液量和温度的最佳值分别为
2.08%、29 mL、29.6℃，在此条件下，预测酵母发
酵液的 OD600nm 最高为 25.49。
2.8 验证优化结果
采 用 最 优 条 件 进 行 试 验， 测 得 酵 母 发 酵 液
OD600nm 为 25.54，与模型预测结果 25.49 接近，说明此
模型预测结果能较好地反映实际情况。优化后布拉酵
母菌体湿重达 32.2 g/L，活菌数达 8.3×108 CFU/mL。
3 讨论
单因子法、正交试验等方法在试验因素和水平
较多时耗时长、工作量大，也难以较好反映出因素
之间交互作用［10］。Plackett-Burman 设计（PB）能用
最少试验次数从众多因素中筛选出主要影响因素，
缩短试验周期，减少工作量 ；响应面法结合统计和
数学方法，建立连续变量曲面模型，快速有效得到
最优值［11，12］。近年，PB 与响应面法相结合的优化
26.7
25.125
23.55
21.975
20.4
2.50
2.25
2.00
1.75
1.50 25.0
27.0
30.0
32.5
35.0
2.50
2.25
2.00
1.75
1.50
25.0 27.5 32.5 35.030.0
22.9779
22.1424
22.3068
23.8135
24.649
22.9779
㻵⏢䟿mL 㻵⏢䟿mL䞥⇽⎨ᨀਆ⢙%
䞥⇽
⎨ᨀ
ਆ⢙
%
O
D
60
0n
m
OD600nm
26.7
25.525
24.35
23.175
22
32.00
31.00
30.00
29.00
28.00 25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
32.00
31.00
30.00
29.00
28.00
25.0 27.5 32.5 35.030.0
24.9334 24.4265
23.4126
23.9196
24.9334
22.9057
㻵⏢䟿mL
㻵⏢䟿mL
䞥⇽⎨ᨀਆ⢙%
⑙ᓖ
℃
O
D
60
0n
m
26.7
25.525
24.35
23.175
22
32.00
31.00
30.00
29.00
28.00 1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
32.00
31.00
30.00
29.00
28.00
1.50 1.75 2.25 2.502.00
24.8681
24.3105
24.8681
5
5
5
23.7529
23.1952
22.6376 24.3105
䞥⇽⎨ᨀਆ⢙% 䞥⇽⎨ᨀਆ⢙%⑙ᓖ℃
⑙ᓖ
℃
O
D
60
0n
m
OD600nm
OD600nm
图 4 响应面分析三维曲面图和相应的等高线图
2013年第6期 199胡小媛等 ：防腹泻布拉酵母培养条件的响应面法优化
方法广泛应用于各种微生物的培养条件优化，均获
良好效果［10］。本研究先通过单因子法筛选出最优碳
源、氮源，再通过 Plackett-Burman 设计从可能影响
布拉酵母生长的 8 个因素中筛选出 3 个相对显著的
因素，并利用响应面法对其水平进行了优化，从而
得到布拉酵母的最优培养条件，使其菌体湿重（32.2
g/L）比优化前（20.9 g/L）提高了 54.1 %，活菌数（8.3
×108 CFU/mL）比优化前（5.5×108 CFU/mL）提高
了 50.9 %。类似的关联报道报道包括，王子辉等［13］
通过单因子法和正交试验优化布拉酵母生物量及海
藻糖积累条件，使布拉酵母的生物量比优化前提高
了约 34%，菌体中海藻糖含量比优化前提高了约
30% ；王学峰等［14］采用单因子与响应面法相结合的
方法，优化影响酿酒酵母菌 LFN518 生物量的培养基
组分，使其生物量（菌体干重 8.124 g/L）比优化前
（菌体干重 6.25 g/L）提高了 29.984% ；孙庆申等［12］
通过 Plackett-Burman 设计与响应面法结合，优化面
包酵母种子培养基后，菌体生物量（活菌 4.69×108
CFU/mL）提高 5 倍以上。横向比较并且结合试验体
会，本试验优化水平还有提高空间，后续研究中可
采用抗菌定向诱变育种筛选高生物量布拉酵母，以
及对影响布拉酵母生长的因素进行更全面的优化，
预期将获得更好效果。
4 结论
对布拉酵母培养基及培养条件进行了优化，通
过单因子法及响应面分析得到最佳培养基配方 ：麦
芽 糖 2%， 蛋 白 胨 2%， 酵 母 浸 提 取 物 2.08%， 培
养 基 初 始 pH 值 为 6 ；最 佳 发 酵 条 件 为 ：温 度 为
29.6℃，摇床转速为 250 r/min，培养基装量为 29 mL
（250 mL 三角瓶），接种量为 5%，培养时间为 24 h。
在此条件下，布拉酵母菌体湿重达到 32.2 g/L，比优
化前（20.9 g/L）提高了 54.1 %；活菌数达到 8.3×108
CFU/mL，比优化前（5.5×108 CFU/mL）提高 50.9 %。

参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）