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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，其作用底物广
泛，主要包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、
羧酸及其衍生物、人工合成的偶氮类色素、甾体激
素和生物色素、金属有机化合物以及其他非酚类底
物［1］。因此其在纺织［2］、食品［3］、造纸［4］、农业［5］
等领域中都有广泛的应用。漆酶来源广泛，在真菌
分泌物［6］、细菌［7］、高等植物［8］、昆虫［9，10］、甚
至动物的肾脏和血清中也都存在着漆酶［11，12］。目
前研究最多的是真菌漆酶，且分泌漆酶最主要的是
单子菌亚门的白腐真菌［13-15］。但是野生菌产漆酶
的活性低，不能适应工业化大规模生产。目前，研
究者对提高漆酶产量的研究主要集中于基因改造
和诱变育种，由于生物技术的提高，研究者已成
功将云芝［16］、金针菇［17］等漆酶基因克隆出来并
收稿日期 ：2014-02-25
作者简介 ：彭滟钞，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物育种 ；E-mail ：414426489@qq.com
通讯作者 ：曹福祥，男，教授，博士生导师，研究方向 ：植物学和生物化学与分子生物学 ；E-mail ：csfucao@163.com
紫外、60Co 复合诱变选育烟色烟管菌漆酶高产突变株
彭滟钞  曹福祥  董旭杰  彭继庆  胡双喜
（中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙 410004）
摘 要 ： 对烟色烟管菌（Bjerkandera fumosa 5.0172）的孢子悬浮液进行紫外诱变筛选得到一株诱变株 ZW-7，其产漆酶的活
力是原始菌株的 1.33 倍，继代培养 5 代后，未见酶活下降。将诱变株 ZW-7 的孢子悬浮液用 60Co-γ 射线进行辐射诱变筛选得到一
株诱变株 Co-11，其产漆酶的活力是 ZW-7 的 1.18 倍，为 380.5 U/L，较原始菌株的 250.6 U/L 提高了约 58.1%，继代培养 5 代后，
酶活稳定。
关键词 ： 烟色烟管菌 紫外 60Co-γ 射线 诱变 漆酶
Screen High-producing Laccase Strain of Bjerkandera fumosa Through
UV and 60Co Composite Mutagenesis
Peng Yanchao Cao Fuxiang Dong Xujie Peng Jiqing Hu Shuangxi
（College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）
Abstract: Mutagenic strains ZW-7 was obtained from the spore suspension of Bjerkandera fumosa（5.0172）by UV mutagenesis and
screening. The laccase activity was 1.33 times than the original strain. After subcultured five generations, laccase activity was stable. ZW-7 was
mutagenized to a new mutagenic strain Co-11 by treating with 60Co-γ ray radiation and its activity was 380.5 U/L, which was 1.18 times than
ZW-7 and 1.58 times than the original strain（250.6 U/L）. After subcultured five generations, enzyme activities of Co-11 remains stable.
Key words: Bjerkandera fumosa UV 60Co-γ rays Mutagenic Laccase
在毕赤酵母表达系统中实现了表达，但表达量最高
也只有 107 U/L，且操作复杂，同时异源表达还处
于起步阶段而难以适应工业化生产。诱变育种是一
种重要的育种方法，尤其在菌种遗传背景不是很清
楚的情况下，物理或化学诱变方法是很有效的育种
方法，现在对于漆酶研究主要集中于物理诱变并且
取得了一定进展，如郑蕾［18］通过紫外诱变白腐菌
（Phanerochaete chrysosporium）后获得 1 株高产诱变
株其酶活比之前提高了 79.54%，经过 5 代传代培养，
未见酶活下降，具有较好的遗传稳定性，优化其条
件得到酶活为 214.9 U/L。复合诱变是近年来新兴的
一种诱变方法，通过多次诱变的菌株经过筛选依旧
可以产酶稳定的菌株，并且与单一的诱变方法相比
其酶活更高，因此得到广泛关注。严平等［19］通过
2014年第9期 121彭滟钞等：紫外、
60Co 复合诱变选育烟色烟管菌漆酶高产突变株
对筛选到的高效降解木质素的菌株 YJ-9-1 进行紫外
微波复合诱变得到菌株 3-8，并利用其对玉米秸秆中
的木质素降解，结果发现在 14 d 的时候菌株 3-8 对
玉米秸秆木质素的降解率为 48.43%，比出发菌株提
高了 16.03%。紫外诱变与 γ 射线诱变都属于物理诱
变，因其操作简单，正突变能力强，遗传稳定性高
而受到广大研究者青睐。烟色烟管菌（Bjerkandera
fumosa 5.0172）是东北生长在阔叶树上的一个偶见
种［20，21］，能造成木材白色腐朽，经本试验研究证明
可以产生漆酶，过去未见关于该菌漆酶的报道。本
研究采用紫外、60Co-γ 射线的复合诱变，改变其生
理特性，提高其产漆酶能力，选育出高产漆酶的菌株，
旨在为进一步工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 烟 色 烟 管 菌（Bjerkandera fumosa
5.0172）购买于中国微生物保藏中心。
1.1.2 培养基 PDA 培养基（1 L）：马铃薯的浸出
液 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO4 1.5 g，MgSO4·7H2O
3 g，维生素 B1 微量，琼脂 15 g。
愈创木酚选择培养基［22］：PDA 培养基中加入
0.04% 的愈创木酚。
基本发酵培养基（1 L）：麦麸 5 g，葡萄糖 20
g，酒石酸铵 0.2 g，KH2PO4 2 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，
维生素 B1 10-20 mg，吐温 80 1 g，微量元素 70 mL。
微量元素（1 L）：甘氨酸 0.6 g，CaCl2·2H2O 1.56
g，MnSO4·H2O 0.5 g，NaCl 1 g，FeSO4·7H2O 0.1g，
CoSO4 0.22 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4·5H2O
0.1 g，KAl（SO4）2·12H2O 0.01 g，H3BO3·0.01 g，
NaMoO4·2H2O 0.01 g。
1.2 方法
1.2.1 孢子悬液的制备 将保存的斜面接入培养皿
中于 28℃培养，约 7-9 d 开始形成孢子，用接种环
将孢子刮下倒入生理盐水中，震荡，用纱布过滤，
稀释成 1×108个/mL 的悬浮液，保存备用。
1.2.2 菌株的诱变及致死率的测定
1.2.2.1 紫外诱变 取制备好的孢子悬浮液 5 mL 于
6 cm 的培养皿中，将之放到磁力搅拌器上，置于距
紫外灯 30 cm（紫外灯预热 30 min）处，打开皿盖，
在紫外灯下分别照射 30、60、90、120、150、180、
210 和 240 s。照射结束后，用黑布包裹静置 10 min，
然后涂平板，每组做 3 个重复，于 28℃培养形成单
菌落，计算致死率，所有操作均在红光下进行。
致死率（%）=（对照处理菌落数-诱变处理菌
落数）/ 对照处理菌落数 ×100%
1.2.2.2 60Co-γ 射线诱变 取紫外诱变得到的高产菌
株进行扩大培养，用生理盐水制成 1×108个/L 的单
孢子溶液，取 10 mL 的单孢子溶液放入 20 mL 的试
管中，利用原子能放射仪分别以 100 Gy、200 Gy、
300 Gy、400 Gy、500 Gy 和 600 Gy 的辐射剂量进行
诱变处理。然后涂平板，每组做 3 个重复，于 28℃
培养形成单菌落，计算致死率，公式同上。
1.2.3 初筛 将诱变后的菌株接入选择培养基培养，
每组做 3 个重复，在 28℃培养 2-4 d，与原始菌株
比较。
1.2.4 复筛 将初筛成功的菌株编号培养，分别接
入 5 个直径约为 5 mm 的菌块到装有 100 mL 的发酵
培养基的 250 mL 锥形瓶中，在温度为 30℃，转速
为 150 r/min 条件下培养，每组做 3 个重复，从第 3
天开始，隔 1 d 测定漆酶活力，取平均值与原始菌
株比较。
1.2.5 粗酶液的制备 将发酵液在 8 000 r/min 的离
心机离心 8 min，取上清液。
1.2.6 漆酶的检测方法［23］ 在 3 mL 的反应体系中，
取 2.7 mL 的 0.1 mol/L 的 醋酸-醋 酸 钠 缓 冲 液，0.2
mL 的 0.5 mmol/L 的 ABTS，0.1 mL 的粗酶液于 25℃
下反应，测定其在 420 nm 下 3 min 的吸光度变化值。
酶活定义 ：以 1 min 内催化氧化 1 μmol ABTS［2，2-
联氮-二（3-乙基-苯并噻唑 -6-磺酸）二铵盐］的量
为一个酶活单位（U/L）。
2 结果
2.1 紫外诱变
2.1.1 最佳照射时间的确定 紫外处理后，致死率
与辐射时间的关系（图 1）显示，当紫外灯照射时
间到 150 s 时，致死率超过 80%，说明该菌对紫外
线敏感，随着时间的推移致死率缓慢增加，最终在
240 s 时接近 100%。考虑到致死率为 90% 出现正突
变的可能性较大，所以选择 180 s 为最佳照射时间。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期122
2.1.2 筛选结果 能够产生漆酶的菌株具有使愈创
木酚选择培养基变红的能力，且变色时间和变色圈
大小以及颜色深浅与产生漆酶的能力有一定关系。
诱变后得到的菌株在选择培养基上培养结果（表 1）
显示，得到的 ZW-1、ZW-2、ZW-5、ZW-6 和 ZW-7，
这 5 株诱变株与原始菌株比在变色时间、变色圈大
小或变色圈颜色深浅上都有一定提高，因而选为正
突变菌株扩大培养进行进一步复筛，同时得到该菌
株紫外诱变的正突变率为 33.3%。
表 1 诱变株与原始菌株初筛结果比较
菌株编号
开始变色
时间（d）
4 d 后变色圈
大小（cm）
4 d 后变色圈
颜色深浅
5.0172 3 2.0 +++
ZW-1 2 2.2 +++
ZW-2 2 2.1 +++
ZW-3 3 1.8 ++
ZW-4 3 1.6 ++
ZW-5 2 2.5 +++
ZW-6 3 2.4 +++
ZW-7 1 2.6 +++
ZW-8 3 1.8 ++
ZW-9 3 1.6 ++
ZW-10 4 1.2 ++
ZW-11 3 1.6 ++
ZW-12 4 0.5 +
ZW-13 3 1.8 ++
ZW-14 3 1.7 ++
ZW-15 5 0.2 +
+ 表明浅红色 ；++ 表明红色 ；+++ 表明深红色 ；下同

2.1.3 摇瓶复筛 为了测定正突变株产生漆酶的
能 力， 对 初 筛 选 的 菌 株 进 行 复 筛。 通 过 发 酵 培
养， 漆 酶 活 力 结 果（ 图 2） 显 示， 筛 选 出 的 5 株
菌株的漆酶活力与原始菌株比均有所上升，证明
所选用的初筛方法是能够快速有效地筛选出高产
漆酶的菌株，其中酶活最大的是诱变株 ZW-5 和
ZW-7， 最 高 酶 活 分 别 达 到 了 312.2 U/L 和 320.2
U/L，且达到最高酶活时间为 9 d，较原始菌株提前
了 2 d，说明紫外诱变不但能够提高酶的活力，还
能缩短最大产酶的时间，考虑到菌株在培养一段
时间后容易出现退化，将此两株菌株进行继代培
养，培养 5 代后，诱变株 ZW-5 产漆酶活力下降了
20%，ZW-7 漆酶活力未见下降，在最高产酶时间
9 d 时得到酶活为 320.2 U/L，较原始菌株最高产酶
时间 11 d 得到酶活 250.6 U/L 提高了约 27.8%，所以
选取 ZW-7 作为优势菌株进行进一步试验。
1209060300
0
20
40
60
80
100
150 180 210 240
㠤↫⦷% ᰦ䰤s
图 1 紫外照射烟色烟管菌孢子致死率曲线
0 2 4 6 8ᰦ䰤d10 12 14 16 185.0172ZW-1ZW-2ZW-5ZW-6ZW-7350300䞦⍫U/L 200100150500250
图 2 诱变株与原始菌株漆酶的酶活比较
2.2 60Co-γ射线诱变
2.2.1 最佳辐射剂量的确定 用原子能放射仪进行
处理，辐射剂量与菌株的致死率结果（图 3）显示，
500 Gy 的辐射剂量时 ZW-7 的致死率超过了 80%，㠤↫⦷%
4003002001000
0
20
40
60
80
100
500 600䗀ሴࡲ䟿Gy
图 3 60Co 辐射剂量与致死率关系
2014年第9期 123彭滟钞等：紫外、
60Co 复合诱变选育烟色烟管菌漆酶高产突变株
说明诱变株 ZW-7 对 60Co-γ 射线敏感，随着辐射剂
量的增加，600 Gy 时致死率接近 100%。因为较大
的致死率出现正突变的可能性较大，所以选取辐射
剂量为 500 Gy 的菌悬液进行进一步试验。
2.2.2 选择培养基初筛 初筛结果（表 2）显示，
Co-2、Co-5、Co-6、Co-8、Co-11 与 诱 变 株 ZW-7 相
比在变色圈直径大小、开始变色时间或变色圈颜色
强度上有所提高，因而将其作为筛选得到的优势菌
进行下一步试验，同时得到 ZW-7 在 60Co-γ 射线诱
变时正突变率为 41.7%。
表 2 诱变株与 ZW-7 初筛结果比较
菌株编号
开始变色
时间（d）
变色圈直径
大小（cm）
变色圈
颜色强度
ZW-7 1 2.6 +++
Co-1 2 2.4 ++
Co-2 1 2.6 +++
Co-3 3 1.5 ++
Co-4 2 2.1 +++
Co-5 1 2.8 +++
Co-6 0 2.9 +++
Co-7 2 2.1 +++
Co-8 1 3.2 +++
Co-9 3 1.0 ++
Co-10 2 1.6 ++
Co-11 0 3.4 +++
Co-12 1 2.3 ++

2.2.3 摇瓶复筛 发酵培养结果（图 4）显示，几
株筛选的诱变株与 ZW-7 相比酶活均有所上升，Co-2
产漆酶活力上升较少，但最高产酶时间依然为第 9
天，Co-5、Co-6、Co-8、Co-11 产漆酶活力提高较大，
但最大产酶时间都较 ZW-7 推迟了 2 d，为 11 d，考
虑到诱变后的菌株容易出现菌株退化，将这几株菌
株进行继代培养 5 代，结果发现 Co-5、Co-6 有所下降，
Co-8 和 Co-11 未见酶活下降，选择漆酶活力最高的
诱变株 Co-11（380.5 U/L）为诱变优势菌。其酶活比
原始菌株提高了 51.8%。
3 讨论
诱变之后的菌株具有正突变株和负突变株，寻
找一种合理高效的初筛方法能够大大缩短试验时间，
提高试验效率，愈创木酚选择培养基是目前应用最
多的快速筛选漆酶高产菌的方法，王瑞苓［24］、司静
等［25］、林娟等［26］、潘澄等［27］、傅恺等［28］都是使
用这种方法进行初筛的，但添加的愈创木酚的浓度
并不相同。王宜磊等［22］通过研究添加不同浓度的
愈创木酚选择培养基得到浓度为 0.04% 时筛选的效
果最好，且凡是能变色的菌株具有产生漆酶的能力，
同时氧化带产生时间和颜色深浅能一定程度上反映
出漆酶的酶活力，本研究通过试验发现，除了上述
两个条件，变色圈直径的大小也能反应出漆酶的活
力大小。但由于这 3 个指标都是直接观察得到，不
能用数值直接体现漆酶的酶活，正如王宜磊［14］指出，
虽然初筛能快速筛选漆酶的高产菌株，但并不能完
全代表漆酶的活力，因此为了进一步说明漆酶的酶
活上升程度，在初筛的基础上进行了复筛，结果证
明初筛的几株菌株漆酶活力都有所上升，由此进一
步证明上述 3 个条件都能说明诱变过程中菌株发生
了正突变，试验方法可靠。
4 结论
本试验采用紫外、60Co-γ 射线进行复合诱变得
到能够稳定遗传的 Co-11，其产漆酶活力比出发菌株
提高了 58.1%，说明复合诱变在原诱变方法基础上
进行改进，作为一种新兴的诱变方法能够得到遗传
稳定性高的菌株，且筛选所得菌株产酶的活力比单
一诱变方法更高，在工业上具有广阔的应用前景。
参 考 文 献
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ZW-7
Co-2
Co-5
Co-6
Co-8
Co-11
400
300
350
250
200
100
50
0
┶䞦⍫࣋U/L 150
0 2 4 6 8ᰦ䰤d10 12 14 16 18
图 4 诱变株与原始菌株漆酶酶活比较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期124
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（责任编辑 马鑫）