全 文 ：·综述与专论· 2013年第9期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
RNA 干 扰（RNA interference，RNAi） 是 指 一
种生物体内由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。当细
胞中导入与内源性 mRNA 同源的双链 RNA 时，该
mRNA 发生降解而导致基因表达沉默。RNAi 最早是
在研究线虫中被发现的［1，2］，随后陆续发现于真菌、
拟南芥、果蝇、锥虫、水螅、涡虫及斑马鱼等多种
真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默
（posttranscriptional gene silencing，PTGS）、 共 抑 制
（cosuppression）及 RNA 介导的病毒抗性等现象均属
于 RNAi 在不同物种的表现形式。
在植物研究中，1999 年 Hamilton 等［3］首次在
PTGS 植株中发现了长度为 25 nt 的 RNA 中间产物。
此后 RNAi 技术被广泛应用于植物基因功能鉴定和
功能基因表达调控等各个领域，并已在烟草、水稻、
棉花、玉米、 小麦、 大麦、 马铃薯及番木瓜等多种植
物中得到成功应用［4-6］。在植物 RNA 干扰的研究
中，无论是未知基因功能验证还是已知功能基因的
收稿日期 ：2013-04-11
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31171822），中央级公益性科研院所基本科研业务费专项课题（ITBB110212）
作者简介 ：言普，男，博士，助理研究员，研究方向 ：植物生物技术 ；E-mail ：yanpu305@126.com
通讯作者 ：周鹏，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：生物技术和植物病理 ；E-mail ：zhp6301@126.com
植物 hpRNA 干扰载体构建的研究进展
言普  沈文涛  黎小瑛  周鹏
（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）
摘 要： RNAi 技术在基因功能鉴定和功能基因表达调控中发挥着重要作用。hpRNA 干扰载体被广泛用于植物的 RNAi 研究。
对植物 hpRNA 干扰载体的构建方法进行综述，并分析其优缺点，为植物 hpRNA 干扰载体构建方法的选择提供参考。
关键词 ： RNAi hpRNA 干扰载体 载体构建 Golden Gate 克隆
Progress in Construction of hpRNA Vector for Plant RNAi
Yan Pu Shen Wentao Li Xiaoying Zhou Peng
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101）
Abstract:  RNAi technology plays an important role in the identification of gene functions and the regulation of gene expression. hpRNA
vectors have been used widely for RNAi research in plants. The progress in the methods for the construction of plant hpRNA vector was reviewed
in this paper, and their advantages and disadvantages were analyzed. It can help to provide a reference to select the appropriate method for the
construction of plant hpRNA vector.
Key words:  RNAi hpRNA Interference vector Vector construction Golden Gate cloning
表达调控，构建相应的 RNA 干扰表达载体都是最基
本试验步骤和必要方法。在 RNAi 研究中，通常通
过向细胞内导入发夹 RNA（Hairpin RNA，hpRNA）
来表达双链 RNA，以沉默目的基因的表达。在植物
中，研究表明含有内含子作为间隔序列的发夹 RNA
（ihpRNA）具有较高的沉默效率［7］。因此，ihpRNA
表达载体被广泛用于植物的基因沉默研究。为了方
便植物 ihpRNA 表达载体的构建，研究人员相继开
发了多种构建方法，根据其构建原理，可以分为以
下 5 类。
1 五种植物 hpRNA 表达载体的构建方法
1.1 传统的酶切连接法
Wesley 等［7］ 构建了一个用于植物 ihpRNA 表
达 载 体 构 建 的 载 体 pHANNIBAL 及 其 同 系 列 载 体
pKANNIBAL。在这 2 个载体上均具有一个 35S 启
动子-多克隆位点-PDK 内含子-多克隆位点-ocs 终
止子的表达框结构，2 个多克隆位点上分别有 3 个
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期8
和 4 个不同的酶切位点，目的片段经 2 次 PCR 扩
增后分别带上与载体 2 个多克隆位点处相应的酶切
位点，通过 2 次酶切、连接和转化反应分别以正向
和反向插入到内含子两端，形成发夹结构。由于
pHANNIBAL 上已整合有启动子、内含子和终止子
序列，方便了植物 ihpRNA 表达载体的构建，但需
要 2 次酶切、连接和转化，仍然比较费时费力，不
适合高通量的研究。2011 年，Manamohan 等［8］ 构
建了一个 pGRNAi 载体，此载体与 pHANNIBAL 一
样，是基于传统的酶切连接克隆法原理，在内含子
两端分别具有一个多克隆位点，但它增加了多克隆
位点上的酶切位点数量，分别具有 9 个酶切位点可
供选择，并且 2 个多克隆位点的序列反向相同，因
此目的片段只需 1 次 PCR 扩增，通过 1 次酶切、连
接和转化反应就可以同时克隆到内含子两端，完成
ihpRNA 表达载体的构建（图 1）。使用 pGRNAi 载
体与 pHANNIBAL 载体相比，较大地简化了操作过
程。但采用传统的酶切连接法，需要载体和目的片
段的分别酶切及其相应酶切产物的电泳和回收，尤
其对于 pGRNAi 载体的酶切，需要同时回收载体框
架和内含子这 2 个酶切产物。因此，与其他克隆方
法相比（如后面将介绍的 Gateway 克隆法、LIC 克隆
Aatll
2X35SP
Ascl
SacII XbaI BamHI PstI EcoRV Clal PacI
SexA1
PacI ClaI EcoRVPstI BamHI XbaI SacII AscI
Fragment-II[RC]Fragment-I
Intron
TARGET
GENE
pGRNAi vector RE digestion with
AatII & SexAI
SexA1
SexA1
AalII
cDNA
Insert
Ligation
2X35SP 5˃
5˃
5˃
5˃ 3˃
3˃
3˃
3˃ 3˃ 5˃
AatII Insert SexAI SexAI
Transformation
2X35SP PDS Intron SOd Nos-T
AatIISexA1SexA1AatII
pGRNAi-pds vector
Insert AatII
Nos-TIntron
SexA1
IntronNos-T2X35SPPCR with gene specific
primers containing
RE sites
RE digestion with
AatlI & SexAI
AaclI
AatlI
Digested and
Dephosphorylated vector
Bcll Ncll Spel Smal EcoRI HindIII Sall SexA1 Sall HindIII
EcoRISmail Spel Notl Bcll Aatll
图 1 利用 pGRNAi 载体通过传统酶切连接法构建 hpRNA 载体示意图［8］
2013年第9期 9言普等 ：植物 hpRNA 干扰载体构建的研究进展
法和 Golden Gate 克隆法），仍然比较繁琐。
1.2 Gateway克隆法
Gateway 克隆技术是一个高效的大规模克隆系
统，它利用 λ 噬菌体的位点特异性重组系统，实现
不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间
的平行转移，并且能定向克隆。通过 Gateway 技术
可以快速和高效地将一个或多个目的 DNA 片段同
时构建到多种与 Gateway 技术兼容的载体系统上。
Gateway 克隆技术的优点是可以不必考虑目的 DNA
是否有合适的酶切位点，并且与传统的需要 DNA
限制性内切酶、DNA 连接酶、凝胶电泳和 DNA 片
段纯化等多个繁冗步骤的克隆方法相比，该方法只
需一步生化反应，而且操作方便、快捷，节省了大
量的时间和劳力。将 Gateway 技术应用于构建植物
hpRNA 表达载体，具有操作简单、快速、成功率高
等优势。目前已有多种基于 Gateway 技术的载体用
于构建植物 hpRNA 表达载体，并得到广泛应用，其
中有代表性的是 pHELLSGATE 系列载体［7，9，10］。使
用 Gateway 克隆方法，只需扩增和克隆一个目的基
因片段，通过特异性重组，此片段可同时以正向和
反向整合到内含子的两端，形成发夹结构，省去了
繁杂的酶切-连接过程，因此适合高通量的研究（图
2）。使用 Gateway 克隆技术构建植物 hpRNA 表达载
体已被国内外实验室广泛使用，构建了用于各种植
物 RNAi 研究的 hpRNA 表达载体［11-17］。但是由于
Gateway 克隆技术为 Invitrogen 公司的专利技术，其
产品价格昂贵，而且在构建 ihpRNA 过程中仍然需
要两步克隆，即目的基因片段先克隆到入门载体中，
再由入门载体克隆到目的表达载体中。因此，构建
过程还有简化的空间。
1.3 重叠延伸PCR法
重叠延伸 PCR（overlap extension-PCR，OE-PCR）
能将 2 个或多个扩增片段重叠拼接起来，在定点突
变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲
除等方面有广泛的应用［18］。利用 OE-PCR，同样可
以构建 ihpRNA 结构。通过 PCR 扩增将正向和反向
的目的基因片段与内含子拼接成发夹结构，再利用
传统的酶切 - 连接法或 TA 克隆法将此 ihpRNA 结构
克隆到植物表达载体中。基于 OE-PCR，已有多个
实验室成功构建了 ihpRNA 结构［19-22］。其中本实验
室建立了一种利用非对称 OE-PCR，通过使用混合
引物在一管中快速构建 ihpRNA 结构的方法（图 3），
命名为 Mixed One-step OE-PCR（MOOE-PCR）。利用
该方法成功构建了一系列 ihpRNA 表达载体，包括
能同时干扰 2 个基因的嵌合型干扰载体［20，23］。应用
重叠延伸 PCR 构建 ihpRNA 结构具有简单快速的优
点，整个 ihpRNA 结构的构建过程可在数小时内完成，
并且不需购买昂贵的试剂盒，成本相对低廉，同时
内含子的选择不受载体的限制，可自由选择，具有
灵活性。但是，该方法需要设计和合成较多 PCR 引物，
并且使用 PCR 的方法扩增发夹结构往往出现效率低
的问题，尤其是对于具有高 GC 含量和（或）繁杂
结构的目的基因片段。此外，通过该方法构建好的
发夹结构还需要再克隆到植物表达载体才能够使用。
pENTR/D+
fragment
L1
L1
+
L2
L2
pENTR/D-TOPO
TOPO-Isomerase
CACC
GTGG
mRNA
CACC
RT-PCR
AAAAAAAAAA
R1 R1
R2R2
+ pHELLSGATE12
LR Clonase
B1
B2 B2
B1
Loaded pHELLSGATE12
ccdB ccdB
图 2 利用 pHELLSGATE 系列载体通过 Gateway 克隆法
构建 ihpRNA 载体示意图［9］
Template 1-for stem
FP
BP1
BP2
BP3
Template 2- for intron
BP4
3840 cyclesMOOE-PCR
Stem Intron Stem
图 3 重叠延伸 PCR 构建 ihpRNA 示意图［20］
1.4 LIC克隆法
LIC 克隆方法（ligation-independent cloning）利
用 T4 DNA 聚合酶的外切活性，在 PCR 片段末端及
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期10
线性载体末端产生单链末端，由于这两种分子末端
设计为序列互补，因此退火后转化可得到重组载体。
通过这种方式可以把目的片段定向、高效地插入
LIC 载体上，不受目的片段和载体上酶切位点的限
制，并且还可以串联接入多个片段。基于 LIC 克隆
方法，Xu 等［24］开发了一种构建植物 ihpRNA 表达
载体的新方法。该方法首先构建了一个与 LIC 克隆
平台相适应的用于构建植物 ihpRNA 表达载体的新
载体 pRNAi-LIC。pRNAi-LIC 的发夹表达框结构与
pHELLSGATE 系列的相似，但是用于整合目的片段
处的序列由 LIC 接头序列取代了 Gateway 的重组序
列（图 4）。使用 pRNAi-LIC 可简单快速的构建植物
ihpRNA 表达载体，只需要一次转化，且具有零背景、
成本低等优势。但由于 LIC 克隆方法中需要使用 T4
DNA 聚合酶的外切活性，因此不适用环状质粒，需
要先将 pRNAi-LIC 质粒线性化处理。
LIC1
PCR product 1 PCR product 1
pRNAi-LIC
Smal
Target fragment Target tragment
Target fragment
LIC2
LIC4
LIC3
LIC1
LIC3
LIC2Pdk intron
ccdB
ccdB
LIC4
LIC4LIC2
LIC1 LIC3
+
LIC4
LIC3
LIC2
Mix
T4 DNA Polymerase T4 DNA Polymerase
+ dATP + dATP
T4 DNA Polymerase
+ dTTP
LIC1
LIC2LIC1
LIC1 LIC2 LIC3
LIC3 LIC4
LIC4
LIC4LIC3
OX13 OX14
LIC2LIC1
BamHI SacI BamHI SacI
Repair
Transform into E.coli
Anneal
Target fragment
Target fragment
Target fragment Target fragment
图 4 利用 pRNAi-LIC 构建 ihpRNA 示意图［24］
1.5 Golden Gate克隆法
Golden Gate 技术是一种新近发展的快速克隆技
术，其核心部分是利用Ⅱ s 类型的限制性内切酶。
此类酶具有在识别位点外切割的特点，对切割位点
处序列没有特异要求，酶切后产生的黏性末端可
由任意碱基组成。通过适当地设计Ⅱ s 类型酶切位
点，使得 DNA 片段拼接后不存在原有的酶切位点，
这样酶切和连接过程可同时进行，并且能同时连接
多个 DNA 片段，因此发展成了具有简单、快捷等
优点的 Golden Gate 克隆技术［25，26］。本实验室基于
Golden Gate 克隆技术，创建了一种构建 ihpRNA 表
达载体的新方法［27］。在此方法中，首先构建了一个
与 Golden Gate 克隆系统配套的植物 RNAi 载体（命
名为 pRNAi-GG）。pRNAi-GG 含有一个 2×35S 启动
子-BsaI 位点-ccdB 基因-BsaI 位点-PDK 内含子-BsaI
位点-ccdB 基因-BsaI 位点-Nos 终止子的表达框结
构。使用该方法，只需在扩增靶基因序列的同时，
由引物在序列两端加上相应的 BsaI 识别和切割位点，
靶基因片段扩增后直接与 pRNAi-GG 质粒混合，同
时加入 BsaI 酶和 T4 DNA 连接酶，经一步酶切-连
接同步反应后，此靶基因片段能同时以正向和反向
的位置克隆到 pRNAi-GG，形成 ihpRNA 表达载体结
2013年第9期 11言普等 ：植物 hpRNA 干扰载体构建的研究进展
构（图 5）。整个构建过程只需在一管中通过一个酶
切-连接同步反应完成，无需酶切片段的电泳和回
收等过程，且构建效率高，无背景干扰，同时由于
pRNAi-GG 为植物双元表达载体，构建好的 ihpRNA
表达载体可直接用于农杆菌转化研究。应用此方法，
成功构建了多个基因的 ihpRNA 表达载体，包括单
GGAGTGAGACC
CCTCACTCTGG
GGTCTCAGGAG
CCAGAGTCC T C
ACGATGAGACC
TGCTACTCTGG
GGAGTGAGACC
CCTCACTCTGG
GGTCTCAACGA
CCAGAGTTC C T
TCGTTGAGACC
ACCAACTCTGG
GGTCTCACTCC
CCAGAGTGACG
TCGTTGAGACC
ACTCTGG
GGTCTCA
CCAGAGTGAGG
CTCC
GGTCTCAACGA
CCAGAGTTG CT
TCGTTGAGACC
AGCAACTCTGG
GGTCTCACT C C
CCAGAGTGAGG
AGCACCTC
2X35S
A
B
ccdB Pdk Intron ccdB Nos
Target fragment
PCR product
2X35S ccdB Pdk Intron
pRNAi-GG
+
ccdB Nos
2X35S Pdk Intron
Loaded pRNAi-GG
ccdB
Nos
Target fragment2X35S Pdk Intron NosTarget fragment
BsaI
BsaI
BsaI BsaI BsaI
BsaI
Target fragment
Bsa I+T4 ligase
GGAG
TGCT
CCAG
CCTC
ACGA
TGCT
TCGT
AGCA
CTCC
GAGG
BsaI BsaI
BsaI
BsaI
+
GGAGTGAGACC
ACTCTGG
CGTCTCA
CCAGAGTTGCTccdB
BsaI
BsaI
BsaI
BsaI
ACGA
个的报告基因和植物内源基因，以及同时含两个基
因片段的嵌合型 ihpRNA 表达载体。此方法具有简单、
快速、高效、成本低等优点，为大规模的植物功能
基因组研究提供了一个高通量平台。目前，本实验
室已免费为国内外 30 多个科研单位提供了 pRNAi-
GG 载体，用于植物 hpRNA 表达载体的构建。
A ：pRNAi-GG 的表达框结构 ；B ：使用 pRNAi-GG 一步法构建 ihpRNA 载体
图 5 利用 pRNAi-GG 构建植物 ihpRNA 表达载体的示意图［27］
2 结语
以上 5 种方法均能方便植物 hpRNA 表达载体的
构建，其主要区别是克隆方法不同。综合操作的简
便性、构建效率和试剂成本等因素的考虑，Golden
Gate 克隆法具有一定的优势。其与传统的酶切连
接方法相比具有明显的操作简便的优势 ；该方法只
需一次转化，而 Gateway 克隆法需要 2 次转化，因
此该方法比 Gateway 克隆法更为简便，且试剂成本
低 ；其与 LIC 克隆法相比，区别 LIC 克隆法需要 2
个 PCR 反应以及一个载体线性化的酶切过程，而
Golden Gate 克隆法只需 1 个 PCR 反应，不需要单
独的载体线性化过程，载体和目的片段的酶切及其
连接在一管内同时进行，操作更为简便。由于各实
验室有其常用和熟练的克隆方法，因此在构建植物
hpRNA 表达载体过程中可根据自身情况和需求选择
上述 5 种方法。
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（责任编辑 狄艳红）