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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
从植物组织中提取 RNA 是进行植物分子生物
学方面研究的必要前提［1］，近年来发展的高通量测
序技术，如转录组短枪测序法（Whole Transcriptome
Shotgun Sequencing）、转录组测序技术（RNA-Seq）
和高性能的生物信息分析技术对于 RNA 的质量要求
较高，这对 RNA 提取在完整性和纯度方面有了更高
收稿日期 ：2013-01-17
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30860032，31160058），兵团博士资金项目（2011BB018）
作者简介 ：杨晓燕，女，硕士研究生，研究方向 ：生物技术制药 ；E-mail: yeziyxy@sina.com
通讯作者 ：张波，男，博士，副教授，研究方向 ：生物技术制药 ；E-mail: Bozhang_lzu@126.com
适合转录组测序的葡萄叶片总 RNA 试剂盒
提取法的改进
杨晓燕1  张波1，2  黄方爱1  颜欢1  李月荣1  郑秋生2
（1. 石河子大学药学院，石河子 832002 ；2. 省部共建新疆特种资源植物药重点实验室，石河子 832002）
摘 要 ： RNA 试剂盒法是获取植物高质量 RNA 样品的常用技术，针对 3 种常见 RNA 提取试剂盒在红地球葡萄叶样品 RNA
提取效果进行评估和优化，以期找到适合红地球葡萄叶片 RNA 表达谱测序需求的高质量 RNA 提取策略。试验依据 3 种试剂盒推
荐时间和条件进行 RNA 提取，并对时间等条件进行优化，比对了优化前后 RNA 质量。结果显示，试剂盒经优化后的方法提取的
RNA 收率高，完整性好，OD260/OD280 在 1.8-2.2 之间，OD260/OD230 大于 2，28S 与 18S 条带清晰完整，RNA-Seq 测序质量及基因覆
盖度符合要求。在红地球葡萄叶片上的 RNA 提取结果表明，延长提取试剂与样品的接触时间操作可以显著提高 RNA 提取质量（纯
度 / 完整性）。
关键词 ： 红地球葡萄 RNA 提取 试剂盒法 转录组短枪测序法
The Improvement on the Protocols of Total RNA Extraction Kits for
RNA-Seq from Grape Leaves
Yang Xiaoyan1 Zhang Bo1，2 Huang Fang’ai1 Yan Huan1 Li Yuerong1 Zheng Qiusheng2
（1. School of Pharmaceutical Sciences，Shihezi University，Shihezi 832002 ；2. Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources，
Ministry of Education，School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832002）
Abstract:  Commercial RNA extraction kits were wildly used in obtaining high quality RNA samples from plants. To seek the optimal
method for the extraction of high quality RNA in RNA Expression Sequences Array（RNA-Seq）, the topic of present article is to evaluate and
optimize the effects of three common RNA extraction kits on leaves samples from grapevine（Vitis vinifera cv. Red Globe）. The quantities of
RNA were analyzed between the recommendatory and optimal usages of three kits in term of times. Results showed that the optimized procedure
for RNA extraction displayed higher yield and better integrity on total RNA. There are a ratios of OD260/OD280 from 1.8 to 2.2 and further OD260/
OD230 ratio no less than 2, resulted in a integrate 28S and 18S bands by electrophoresis. The extracted samples also kept their quality and gene
coverage from RNA-Seq sequencing. Our research demonstrated that the prolonged incubation time for samples preparation and other procedures
would significantly benefit the separation of total RNA from grape leaves（Vitis vinifera cv. Red Globe）with a higher purity and integrity.
Key words:  Vitis vinifera cv. Red Globe RNA extaction Kit assay RNA-Seq
的要求。
植物含有大量的多糖、多酚、代谢产物、色素
等成分，增加了高质量 RNA 的提取难度 ；由于种属
和取材部位的不同亦会造成提取策略个体化及复杂
化，适合植物 RNA 提取的方法也不尽相同［2-5］。葡
萄组织中就有多种次生代谢产物，较难提取到高质
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期216
量的 RNA［6］，尽管国内外的研究者已经开发出从葡
萄组织中提取 RNA 的方法，如 SDS 法［7］ 、CTAB 法［8，
9］、以及二者结合法等方法［10］。近年来，商业化的
RNA 提取试剂盒在一些植物样品 RNA 提取中已被
证明具有简单快捷，试验重复性较好的优点。但对
于高质量尤其是满足测序要求的样本，其应用效果
尚待评价。为了满足本课题对于葡萄叶片样本 RNA
提取效果较高的需求，本研究拟对比 3 种新疆地区
常见植物 RNA 提取试剂盒在葡萄叶片 RNA 提取中
的效果，并针对葡萄叶片材料特性对试剂盒操作流
程优化，建立适合于 RNA-Seq 测序的葡萄叶片高质
量 RNA 提取方案。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为红地球葡萄（Vitis vinifera L. cv. Red
Globe）1 月龄叶片，取自于石河子大学药园。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取方法 首先通过变性剂裂解破
碎组织，然后经过氯仿等有机溶剂变性蛋白并抽提
RNA，最后将 RNA 经过沉淀、洗涤、干燥并溶解待用。
1.2.2.1 试 剂 盒 A ：UNIQ-10 柱 式 Trizol 总 RNA 抽
提试剂盒（生工生物工程股份有限公司，上海）。试
剂盒 B ：RNAprep Pure 多糖多酚植物总 RNA 提取试
剂盒（天根生化科技有限公司，北京）。试剂盒 C ：
RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN 公司，德国）步骤
皆参照各自说明书。
1.2.2.2 试剂盒方法改进 参照试剂盒提供方法和
流程，具体改进策略详，见表 1。
表 1 三种试剂盒提取葡萄叶片总 RNA 的改进策略
试剂盒 改进参考步骤 延长时间策略
UNIQ-10 2、6、7、9 延至 10 min
RNAprep Pure 1、5、8、9、10 延至 10、5、5、5、10 min
RNeasy Plant Mini Kit 1、6、7、8、9 延至 10、5、10、10 min

1.2.2.3 总 RNA 检测及纯度分析 RNA 样品非变性
琼脂糖凝胶电泳检测。各方法提取之 RNA 置于 1％
琼 脂 糖 凝 胶（Biowest® regular agarose G-10，gene 有
限公司）上电泳，电压 120 V，15 min（恒流恒压电
泳仪，美国 Bio-Rad 公司），用凝胶成像系统（Bioshine
GelX 1650 凝胶成像系统，上海欧翔科学仪器有限公
司）拍照记录。
（1） 浓 度 检 测 方 法 ：Qubit Fluorometer（ 美 国
invitrogen 公 司 ）；琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 定 量 ；Agilent
2100（美国安捷伦科技公司）。
（2）28S∶18S 检测方法 ：Agilent 2100（美国安
捷伦公司）芯片分析仪自动计算。
1.2.2.4 基因数字表达谱测序（RNA-Seq） 参考文
献［11］及华大基因委托书技术内容，试验流程简
介如下：总 RNA 加热打开二级结构后，带有 Oligo（dT）
的磁珠富集 mRNA，用试剂盒去除 rRNA。向得到的
mRNA 中加入适量打断试剂高温条件下使其片段化，
再以片段后的 mRNA 为模板，合成 cDNA，经过磁
珠纯化、末端修复、3 末端加碱基 A、加测序接头
后，进行 PCR 扩增，从而完成整个文库制备工作构
建好的文库用 Agilent 2100 Bioanalyzer（美国安捷伦
公 司 ） 以 及 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System
（美国应用生物系统 ABI 公司）进行质量和产量检
测，文库质控合格后使用 Illumina HiSeqTM 2000（美
国 Illumina 公司）进行测序。
2 结果
2.1 RNA电泳分析
RNA 质量一般通过电泳和 RNA 特定吸光度的
值共同来评价，在图 1 中对比分析了条件优化前后
对试剂盒 A、B、C 提取结果的影响。采用试剂盒 A
推荐的方法提取的葡萄叶片 RNA 经琼脂糖凝胶电泳
后没有条带（优化前试剂盒 A 所示），优化后得到
的 RNA 电泳条带明显出现，但伴随有拖尾现象（优
化后试剂盒 A 所示）；采用试剂盒 B 推荐方法提取
的 RNA 电泳条带只有 5S 带，且有弥散现象（优化
前试剂盒 B 所示），优化后得到清晰的 28S、18S 和
5S 电泳条带（优化后试剂盒 B 所示）；采用试剂盒
C 推荐方法提取的 RNA 电泳条带有不清晰的 2 个条
带，18S 和 5S（优化前试剂盒 C 所示），优化后得到
清晰明亮的 28S、18S 和 5S 电泳条带（优化后试剂
盒 C 所示）。
2.2 RNA纯度、浓度检测
从表 2 可以看出采用试剂盒 A（编号 1、2、3）
2013年第6期 217杨晓燕等 ：适合转录组测序的葡萄叶片总 RNA 试剂盒提取法的改进
改进方法提取的 RNA 样品原液浓度大于 100 ng，
OD260/OD280 在 1.8-2.2 之间，但是 OD260/OD230 均小于 2。
而采用试剂盒 B（编号 4、5、6）和试剂盒 C（编号 7、
8、9）改进方法提取的 6 个 RNA 样品不但原液浓
度大于 100 ng，而且 OD260/OD280 和 OD260/OD230 的值
全都在 1.8-2.2 之间。为了保证后续试验的准确性，
试验又采用 Agilent 2100 对 3 个试剂盒改进法提取
的 RNA 样品纯度和质量进行深度分析，检测结果
见图 2。
通过 Agilent 2100 RNA 芯片对提取的总 RNA 电
泳结果质量检测，试剂盒 A 改进方法提取的 1 号
RNA 样品总范围为 151.2，浓度为 117 ng/μL，RNA
完整性为 8.10 ；2 号 RNA 样品总范围为 155.2，浓度
为 88 ng/μL，RNA 完整性为 8.50 ；3 号 RNA 样品总
范围为 103.9，浓度为 99 ng/μL，RNA 完整性为 8.40；
试剂盒 B 改进方法提取的 4 号 RNA 样品总范围为
155.4，浓度为 110 ng/μL，RNA 完整性为 8.60 ；5 号
RNA 样品总范围为 136.7，浓度为 97 ng / μL，RNA
完 整 性 为 8.00 ；6 号 RNA 样 品 总 范 围 为 91.4， 浓
度为 65 ng/μL，RNA 完整性为 8.40 ；试剂盒 C 改进
方法提取的 7 号 RNA 样品总范围为 485.2，浓度为
199 ng/μL，RNA 完整性为 8.00 ；8 号 RNA 样品总范
围为 328.7，浓度为 135 ng/μL，RNA 完整性为 8.50；
9 号 RNA 样品总范围为 505.5，浓度为 190 ng/μL，
1
Ոॆࡽ
Ոॆਾ
䈅ࡲⴂA 䈅ࡲⴂB 䈅ࡲⴂC
2 3 4 5 6 7 8 9
试剂盒 A ：UNIQ-10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒 ；试剂盒 B ：RNAprep
Pure 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒 ；试剂盒 C ：RNeasy Plant Mini Kit
图 1 三种试剂盒方法提取葡萄叶片总 RNA 电泳图
表 2 Qubit Fluorometer 检测 3 种试剂盒改进方法提取的葡萄叶片总 RNA 纯度及产量
方法 编号 原液浓度（ng/μL） 体积（μL） 总量（μg） OD260/OD280 OD260/OD230
试剂盒 A 1 351.0 14.5 5.0895 1.80 0.97
2 264.0 27.5 7.26 1.90 1.04
3 297.0 18 5.346 1.81 0.97
试剂盒 B 4 330.0 36 11.88 2.11 2.01
5 291.0 31 9.021 2.12 2.04
6 195.0 41 7.995 2.11 2.11
试剂盒 C 7 597.0 17 10.149 2.10 2.24
8 405.0 39 15.795 2.09 2.00
9 580.0 25 14.5 1.99 2.01
RNA 完整性为 7.40。
从表 3 中可以看出，采用 Agilent 2100 RNA 芯
片检测 3 个试剂盒改进方法提取的 9 个 RNA 样品
28S 条带大小是 18S 的 1.5-2.0 倍。
2.3 RNA测序质量评估
随机选取试剂盒 B 和试剂盒 C 改进方法提取的
3 个 RNA 样品进行基因数字表达谱测序（RNA-Seq）
工作。结果如图 3 所示，A、B、C 3 个测序样品的
片段可读性（Tags distribution）满足 RNA-Seq 分析
要求，其中完全测序（Clean reads）在 A 与 C 样品
超过了 99％。此外，Containing adaptor 是处理后依
然含有标签序列的基因，Containing N 是含有未知核
苷酸的基因，Low quality 是测序碱基峰值小于检测
阈值的基因，这些都属于低质量测序结果标志。从
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期218
图 3 中可以看到，样品中上述低质量测序结果所占
比重极小，说明经优化的试剂盒提取的 RNA 的质量
是可以满足测序要求的。
2.4 RNA测序基因覆盖度
根据 RNA-Seq 的测序技术原理，在样本的测
FU
40
30
20
10
25 200 1000 4000
8585
8585
8585 8585 8585
85858585
8585 8585
nt
0
FU
40
30
20
10
25 200 1000 4000 nt
0
FU
30
20
10
25 200 1000 4000 nt
0
FU
40
20
25 200 1000 4000 nt
0
FU
40
30
20
10
25 200 1000 4000 nt
0
FU
30
20
10
25 200 1000 4000 nt
0
FU
100
50
25 200 1000 4000 nt
0
FU
100
50
25 200 1000 4000 nt
0
FU
100
50
25 200 1000 4000 nt
0
1 2 3
4 5 6
7 8 9
图 2 Agilent 2100 RNA 芯片对提取的总 RNA 电泳结果质量
表 3 Agilent 2100 RNA 芯片检测提取总 RNA 质量
NO. Name
Start Size
（nt）
End Size
（nt）
Area % of total Area 28S ：18S
1
18S 1601 1914 26.3 17.4
1.6
28S 2713 3366 42.7 28.2
2
18S 1654 1979 25.2 16.2
1.5
28S 2857 3501 50.8 32.8
3
18S 1642 1950 18.3 17.6
1.8
28S 2768 3479 32.2 31.0
4
18S 1679 1990 30.0 19.3
1.8
28S 2888 3585 55.0 35.4
5
18S 1647 1912 23.5 17.2
1.9
28S 2844 3514 45.0 32.9
6
18S 1639 1936 15.4 16.8
1.9
28S 2860 3445 28.5 31.2
7
18S 1632 1917 81.2 16.7
1.7
28S 2809 3363 134.8 27.8
8
18S 1654 1937 56.7 17.2
1.9
28S 2855 3485 104.9 31.9
9
18S 1603 1899 69.2 13.7
1.5
28S 2785 3391 103.7 20.5
Containing Adaptor30114，0.85%
Containing N197，0.01%
Low Ouality3226，0.09%
Clean Roads3488627，99.05%
Containing Adaptor35442，0.97%
Containing N174，0.00%
Low Ouality3862，0.11%
Clean Roads3608392，98.92%
Containing Adaptor32275，0.88%
Containing N244，0.01%
Low Ouality3437，0.09%
Clean Roads3619533，99.02%
A
B
C
图 3 测序样品的 Tag 分布统计（n=3）
2013年第6期 219杨晓燕等 ：适合转录组测序的葡萄叶片总 RNA 试剂盒提取法的改进
序过程中，对目的基因在测序结果的覆盖程度及
这些基因数目进行 RNA 测序基因覆盖度分析。从
图 4 中可以看出，覆盖度在 60％以上的基因数占
总 基 因 数 的 比 例 A 是 47.76%，B 是 51.42%，C 是
55.48%。覆盖度 >90% 的基因数占总基因数的比例
A 是 18.76%，B 是 20.46%，C 是 22.98%，这些结果
表明，所获得 RNA 的测序结果基因覆盖度较高，达
到了 RNA-Seq 分析的基本要求。
时间，可以在不增加提取成本的情况下显著提升 3
种试剂盒的提取效果。
Trizol 交换柱法是动植物细胞 RNA 提取最常见
试剂盒提取方法，适用面广且操作简便，但在本研
究中发现 Trizol 法 RNA 提取试剂盒 A 即使优化后条
件也无法满足本试验提取质量要求，这说明针对葡
萄叶样品不建议使用这类宽泛型试剂盒。试剂盒 B
和 C 主要针对植物样品，在优化时间等条件后，B
的电泳条带 28S 和 18S 条带清晰明亮，C 的可以看
到清晰的 3 条电泳条带，提示提取的 RNA 完整性较
好，说明适合葡萄叶样品提取。
分子生物学试验中对 RNA 质控一般通过样品
吸光值比率进行纯度评估，OD260/OD280 的比值用于
估计核酸的纯度（1.8-2.2）。但对于 RNA-Seq 需要
额外 OD260/OD230 比值用于估计脱盐和去多糖多酚
的程度（>2.0）［12，13］，蛋白去除不彻底会导致前者
比值过低，脱盐不完全或植物多糖与多酚的污染会
导致后者比值过低［14］，这两种指标是保障高质量
RNA 提取的重要判定标准。譬如试剂盒 A 改进后 3
个 RNA 提取样品 OD260/OD280 值在 1.8-2.2 之间，但
是 OD260/OD230 都小于 2，这种纯度的 RNA 可以满足
RT-PCR 试验需求，但无法保障 RNA-Seq 要求。而
专门针对植物材料的试剂盒 B 和试剂盒 C 在优化试
验中取得了较理想的提取结果，通过 Agilent 2100 对
样品纯度和完整性进行深度分析发现采用改进方法
试 剂 盒 B 提 取 的 RNA 的 28S∶18S 的 值 都 接 近 2，
说明试剂盒 B 优化后提取的 RNA 质量最佳。数字基
因表达谱需要高纯度和高完整性的 RNA 样本，对比
参考文献［15，16］中数字基因表达谱（RNA-Seq）
中 RNA 测序质量评估和 RNA 测序基因覆盖度的结
果，本试验结果表明试剂盒 B、C 经优化条件后提
取的葡萄叶片 RNA 满足 cDNA 文库构建及 RNA 表
达谱测序的工作需求。
4 结论
宽泛的 Trizol 提取法并不适合葡萄叶样品高质
量 RNA 提取。即便是专门针对植物样品的试剂盒其
参数也需要根据具体样品特点进行优化，推荐延长
试剂与提取样品接触时间。
90%-100%3464
80%-90%2110
70%-80%1773
60%-70%1457
50%-60%1403
40%-50%1380
30%-40%1349
20%-30%1585
10%-20%1906
0%-10%2041
90%-100%3823
80%-90%2338
70%-80%1891
60%-70%1555
50%-60%1401
40%-50%1336
30%-40%1341
20%-30%1474
10%-20%1776
0%-10%1750
90%-100%3895
80%-90%2228
70%-80%1821
60%-70%1458
50%-60%1417
40%-50%1252
30%-40%1244
20%-30%1479
10%-20%1765
0%-10%1805
~11%
~19%
~11%
~10%
~10%
~9%
~7%
~7%
~8%
~8%
~12%
~21%
~10%
~10%
~10%
~8%~7%
~7%
~8%
~8%
~13%
~20%
~9%
~10%
~10%
~8%~7%
~7%
~7%
~8%
A
B
C
图 4 RNA 测序基因覆盖度统计
3 讨论
高性能的 RNA 生物信息学研究在样品完整性
和纯度方面对 RNA 提取技术有特殊的要求。相对于
常规提取，样品完整且无酶等抑制物残留成为商品
化的 RNA 提取试剂盒的基本技术指标。实际使用过
程中，提取策略往往需要针对具体样品特点进行条
件优化，延长接触时间是若干优化中最经济的一种。
本研究即针对葡萄叶样本进行提取策略的优化，如
表 1 所示适当延长提取环节相关试剂与样品的接触
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期220
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）