全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
丙酮丁醇梭菌 ldhL基因的克隆
及其在大肠杆菌中的表达
于振海 1 杨登峰 2 郭媛 1 马潘蕾 1 韦宇托 1 黄日波 1, 2
( 1广西大学生命科学与技术学院,南宁 530005; 2广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心,南宁 530004 )
摘 要: 首次从丙酮丁醇梭菌 (C lostridium acetobuty licum ATCC 824)中克隆得到 L乳酸脱氢酶 ( Llacta te dehydrogenase,
ldhL )基因,并将其连接到 pSE380表达载体上, 得到重组质粒 pSE380 ldhL, 将重组质粒转化到乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷
的 E scherichia coli FM Jl44大肠杆菌中进行表达。 SDSPAGE分析表达产物的分子量约为 34 kD,摇瓶发酵后用 HPLC检测分析
L乳酸产量为 24 g /L, 纯度达到 99 9% ,不需要再进行手性分离, 为以后在工业上生物法生产高纯度的 L乳酸打下基础。
关键词: L乳酸 L乳酸脱氢酶 克隆 表达
C loning and Expression of ldhL Gene from Clostridium Acetobutylicum
inEscherichia coli
Yu Zhenha i
1
Yang Dengfeng
2
GuoYuan
1
M a Panlei
1
W e iYutuo
1
Huang R ibo
1, 2
(
1
College of Life Science and T echnology, Guangxi University, N anjing 530005;
2
National Engineer ing R esearch Center forN onfood B ioref inery, Guangx iA cademy of Sciences, N anning 53004)
Abstrac:t The Llac tate dehydrogenase genew as firstly cloned from C lostridium acetobuty licum ATCC 824. The recomb inant plas
m id pSE380 ldhL w as construc ted by inserting ldhL into expression vector pSE380 and then transform ed intoE scherich ia coli FM Jl44.
SDSPAGE result show ed that the re lative mo lecu la rw eigh t o f the expression product w as about 34 kD. The production of LLac tic acid
analyzed byH PLC w as abou t 2 4 g /L a fter ferm enta tion in the flask. The deg ree of purity w as 999% , w hich does not require Ch ira l
separation further. The resea rch lay a foundation to achieve b io log ica l produc tion o f highpur ity w ith h igh purity in the industry area.
Key words: LLactic ac id Llacta te dehydrogenase C lon ing Expression
收稿日期: 20091125
基金项目:广西青年基金 (桂科青 0832016 ) ,广西亚热带生物资源保护利用重点实验室 省部共建国家重点实验室培育基地开放课题
( SB0606)
作者简介:于振海,男,硕士研究生,研究方向:基因工程菌构建与酶工程; Em ai:l yuzhenh1985@ 163. com
通讯作者:黄日波,男,教授,博士生导师,主要从事发酵与酶工程研究; Em ai:l rbhuang@ gxas. cn
L乳酸作为一种重要的有机酸, 广泛应用于食
品、农业、环保、医药、饲料、日用品及化工等领域,尤
其是 L乳酸聚合物在生产可降解聚合物的研究方
面已成为全球关注的热点。随着聚乳酸作为生物可
降解塑料的迅速发展, 采用高新技术来开发光学纯
度高、产量高、转化率高的 L乳酸生产技术成为全
球关注的热点, 但化学法生产 L乳酸都需手性分
离,而生物法能产生单一的 L乳酸, 所以越来越引
起人们的关注 [ 1, 2]。
丙酮丁醇梭菌 ( C. acetobutylicum ATCC 824)是
一种革兰氏阳性菌,而且在厌氧条件下产生丁醇,丙
酮和乙醇,比例为 6!3!1即 ABE发酵, 同时也产生
乳酸,但不是主要产物。在严格的条件限制下,乳酸
会变为主要的发酵产物, 所以该基因在一定条件下
具有很强的表达能力,同时, 表达宿主大肠杆菌乳酸
脱氢酶基因被敲除后自身不会再产生 D乳酸,从而
只产生 L乳酸 [ 3- 6]。
本试验构建出了以乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解
酶缺陷的 E. coli FM Jl44大肠杆菌为宿主生产高纯
度 L乳酸的基因工程菌, 并进行了摇瓶发酵, 为以
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
后实现高纯度 L乳酸工业化生产作了探索性
研究。
1 材料与方法
1. 1 菌株和质粒
丙酮丁醇梭菌 ( C. acetobutylicum ATCC 824)购
自德国微生物菌种保藏中心 ( DSMZ) , E. coli FM
Jl44 ( ∀ ldh pf l: cam r trpR h is29 ( am ( p ro2 ary427
deoB arc tsx IN ( rrnD rrnE ) lacY )由南开大学刘如林
教授赠送,表达载体 pSE380购自 Inv itrogen公司。
1. 2 培养基
LB培养基 ( 1%蛋白胨、05%酵母提取物、1%
N aC ,l pH70)用于大肠杆菌培养。丙酮梭菌的培养
基 ( 05% 蛋白胨、03% 酵母提取物、1% 牛肉膏、
05%葡萄糖、01%可溶性淀粉、005%半胱氨酸、
乙酸钠 03、琼脂粉 005%, pH值 70)用于丙酮丁
醇梭菌培养 [ 7]。
13 酶、试剂和检测设备
T4 DNA连接酶 LA TaqDNA 聚合酶、DL2000
DNA M arker、蛋白质分子量 Marker购自 TaKaRa公
司。限制性内切酶 N co I、Xho I为 Fermentas公司产
品。胶回收试剂盒及小量 PCR产物纯化试剂盒为天
根产品。其他试剂为国产分析纯。寡聚核苷酸由上海
Sangon生物公司合成。测序委托上海鼎安测序公司完
成。U3000系列高效液相色谱购自美国戴安公司。
14 目的基因的克隆
基因组 DNA的提取纯化、质粒 DNA的提取、
DNA酶切、连接和转化均参考文献 [ 8]。根据 Gen
Bank中查到 C acetobuty licum ATCC 824的 L乳酸
脱氢酶基因全序列, 序列号为 CA _C0267, 设计扩增
ldhL基因的 PCR引物如下: ldhL基因上游引物: 5#
GCCGCCATGGTCAAAAAGAATACTAAA ATTTCAG
TAATC3#(划线部分为 N co I酶切位点 );
ldhL 基 因 下 游引 物: 5#GCGCCTCGAGTTA
AAATATACTATCTAGTGATTC3#(划线部分为 Xho I
酶切位点 )。
以 C. acetobutylicum ATCC 824总 DNA为模板
用以下 PCR程序进行扩增: 94∃ , 30 s, 55∃ , 30 s,
72∃ 1 m in, 共 30个循环; 最后 72∃ 延伸 10 m in。
PCR产物在 08%的琼脂糖电泳检测, 回收目的片
段用于酶切和连接。
15 重组质粒的构建及表达
从 C. acetobu ty licum ATCC 824基因组 DNA中
PCR扩增 ldhL基因,将 PCR产物与表达载体 pSE380
分别用 N co I和 Xho I双酶切,用 T4连接酶连接,转化
到 Ecoli FM Jl44进行表达,酶切鉴定及 PCR鉴定获
得含 ldhL 基因的重组质粒, 将重组质粒命名为
pSE380ldhL。
16 ldhL基因表达产物的 SDSPAGE分析
分别挑取单菌落 E. coli FM Jl44于 LB ( 100 mg /
mL Amp)培养基中, 以含空载体 pSE380的大肠杆
菌菌株 E. coli FM Jl44菌株作对照。 37∃ 振荡培养
过夜后,次日, 按 1%量接种到新鲜 LB ( 100 mg /mL
Amp)培养基中, 37∃ 培养至 OD600为 04 - 06时,
加 IPTG至终浓度为 1 mmo l /L, 30∃ 诱导 8 h后取
1mL培养液离心收集菌体, 分别加 20 L ddH 2O和
等体积的 2 %蛋白质电泳上样缓冲液, 沸水浴 5
m in, 然后 12 000 r/ m in离心 2m in,取 10 L上清进
行 SDSPAGE分析。
17 摇瓶发酵
分别挑取含有重组质粒的单菌落 E. coli FM Jl44
接种于 LB ( 100mg / mL Amp)培养基中,以含空载体
pSE380的大肠杆菌菌株 E. coli FM Jl44菌株作对照,
37∃ 振荡培养过夜后。次日,按 1%量接种到新鲜 LB
( 100 mg / mL Amp)培养基中, 37∃ 培养至 OD600为
04- 06时,加 IPTG至终浓度为 1 mmo l/L, 同时补
加 1%的葡萄糖, 30∃ 诱导至 OD600为 15- 18,再补
加 2%的葡萄糖同时将瓶口密封进行兼性厌氧发酵,
发酵 48 h后,将摇瓶发酵后的发酵液 12 000 % g离心
2m in,取上清进行高效液相分析。
18 发酵产物的高效液相色谱条件
标样为含 2g /L的 L乳酸的水溶液。B ioRadHPX
87H柱,流动相为 4mM H2 SO4,流速为 05mL/m in,柱
温 45∃ ,检测波长为 210 nm,进样量 10 L[ 9]。
2 结果与分析
21 ldhL基因的扩增及其序列测定
以 C. acetobuty licum ATCC 824基因组 DNA为模
板扩增目的基因,产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩
增片段,结果见图 1。结果表明扩增片段大小约为 1
kb,与预期相符。经测序分析,与 GenBank所报道的
序列一致,这表明已扩增得到 L乳酸脱氢酶基因。
82
2010年第 3期 于振海等:丙酮丁醇梭菌 ldhL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
M. DL2000 ladder ; 1, 2. ldhLPCR扩增条带
图 1 PCR扩增产物电泳结果
22 pSE380 ldhL重组质粒的构建与鉴定
PCR产物经 N co I、Xho I双酶切后, 与同样经
N co I和 Xho I处理的表达载体 pSE380连接, 连接
后转化到大肠杆菌 E. coli FM Jl44感受态细胞。提
取质粒经N co I、Xho I酶切鉴定、电泳验证,结果见
图 2。结果表明, ldhL基因已经连接到表达质粒上,
重组的表达质粒命名为 pSE380 ldhL。
M. DL2000 ladder; 1. pSE380 ldhL双酶切; 2. pSE380双酶切
图 2 重组质粒 pSE380ldhL酶切图谱
23 ldhL基因表达产物的 SDSPAGE分析
将含有重组质粒的大肠杆菌菌株 E. coli FM Jl44
在 LB培养基中培养,经 IPTG诱导后收集菌体,进行
SDSPAGE电泳,结果如图 3。结果表明重组菌株 E.
coli FM Jl44与对照菌株相比,有一分子量约 34 kD的
特征蛋白带出现,大小与推算的分子量一致,结果表
明外源的 ldhL基因在大肠杆菌中获得了表达。
M.蛋白分子量分析; 1.经诱导的 pSE380全菌蛋白;
2.经诱导的 pSE380 ldh全菌蛋白
图 3 重组质粒 pSE380 ldhL表达
产物的 SDSPAGE分析
24 发酵后产物高效液相的图谱
图 4是 20g /L的 L乳酸标样的高效液相进样图
谱, L乳酸的出峰时间为 1281 m in。图 5是对照含
pSE380的菌发酵后进样后的高效液相图谱, 乳酸出
峰的位置未见有峰出现。图 6为 样品含 pSE380ldhL
的菌发酵后进样后的高效液相图谱,在乳酸出峰的位
置有峰出现,证明 L乳酸基因得到表达, 以上 3个 L
乳酸峰面积和含量如表 1所示。根据标样出峰的时
间和高效液相柱子不能区分 L型和 D型乳酸的性
能,结果表明空对照中对应的乳酸出峰位置没有峰证
明敲除后的大肠杆菌不再产生 D乳酸,而样品产生
的乳酸峰证明只能是 L乳酸峰,根据出峰的峰面积可
以算出 L乳酸初步摇瓶发酵的产量为 24 g /L。
图 4 标准样进样后液相图谱
83
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
图 5 对照含 pSE380的菌发酵后进样后的高效液相图谱
图 6 样品含 pSE380 ldhL的菌发酵后进样
后的高效液相图谱
表 1 L乳酸峰面积和含量
样品名称 峰面积 L乳酸含量
标样 22182 20
对照 0 0
样品 26137 24
3 讨论
丙酮丁醇梭菌 ( C. acetobutylicum ATCC 824)基
因已早有报道,但有关丙酮梭菌的 ldHL基因在异源
宿主细胞中表达的研究在国内外却未见有报道。由
于大肠杆菌自身含有 D乳酸脱氢酶基因发酵后能
产生少量的 D乳酸, 从而影响到表达产物 L乳酸的
纯度。本试验首次克隆了丙酮梭菌的 ldHL基因的
CDS序列,再将克隆的 DNA片段插入大肠杆菌表达
载体 pSE380的 MCS处,通过 IPTG诱导, 在敲除 D
乳酸脱氢酶基因的 E. coli FM Jl44中成功实现表达,
得到了不含 D乳酸的高纯度的 L乳酸表达产物, 为
以后工业生产高纯度 L乳酸打下基础。
本试验只对丙酮梭菌的 ldhL基因的异源表达
做了一个初步尝试。若要获得真正应用到工业发酵
中还要进一步优化发酵条件, 或者纯化出此酶进一
步研究酶学性质来提高其酶活 [ 10, 11] , 也可以做基因
敲除促进其向乳酸方向进行代谢 [ 12] , 进一步提高其
产量,或者选择更合适的表达系统,如毕赤酵母表达
系统等。
参 考 文 献
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2010年第 3期 吴建军等 : L fcinB突变基因在大肠杆菌中的融合表达及其活性测定
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