全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
收稿日期:2007-07-30
基金项目:国家林业局野生动植物保护项目(010-413255)
作者简介:杨成君(1978-),男,博士,主要从事植物分子生物学研究;E-mail:nxyycj@yahoo.com.cn
通讯作者:王军,E-mail:junwang1966@yahoo.com.cn
人参(PanaxginsengC.A.Mey)为五加科、人参属多年生宿根草本,别名棒锤,素有“东北三宝”之称。是
我国常用的珍贵药材。对研究和保存珍贵的人参基因资源至关重要。然而研究人参的基因表达情况,获得
高质量的 RNA是相关实验的重要前提。质量高、完整性好的 RNA是进行 cDNA文库构建、northern印迹分
析,基因体外翻译、DDRT-PCR、cDNA末端快速扩增,RT-PCR等分子生物学研究工作的基础。目前提取各
种植物 RNA的常规方法以及商业提取试剂盒很多,针对不同的植物材料选择适合的方法至关重要。由于
人参植物中含有大量的蛋白质、多酚以及其他次生代谢物质代谢产物,内源 RNase活性较高,严重干扰了
RNA的提取。本研究运用了 CTAB法、Trizol法、Bizol法和 SDS法 4种方法进行了比较试验,其中 SDS法获
得了高质量的总 RNA,其纯度和完整性都非常高,完全可以满足下一步的实验要求。
1 材料与方法
1.1 植物材料
红果人参叶片RNA的提取
杨成君 王军 周莉 刘关君
(东北林业大学林学院,哈尔滨 150040)
摘 要: 提取高质量的RNA是进行人参植物分子生物学研究的必要前提。利用 CTAB法、Trizol法、Bizol法和
SDS法,从红果人参叶片中提取了总RNA,通过紫外分光光度法和凝胶电泳检测,结果显示:四种方法得到的纯度都比较
高,OD260/OD280值都在1.7~2.0之间;SDS法提取的RNA,凝胶电泳显示28S条带是18S条带亮度两倍,而且无污染,好于
其他三种方法。通过RT-PCR,dscDNA片段条带弥散分布大小在0.2~3.0kb,从而进一步验证了SDS法提取的RNA质
量,完全可以进行下一步的分子生物学研究
关键词: 人参叶片 RNA提取 RT-PCR
ExtractionofTotalRNAfrom PanaxGinsengC.AMeyer.cv.
HongguoLeaves
YangChengjun WangJun ZhouLiLiuGuanjun
(ColegeofForestry,NortheastForestryUniversity,Harbin150040)
Abstract: Extractionofhigh-qualityRNAisaprerequisitetostudypanaxginsengcv.Hongguoplantmolecular
biology,Basingon themethodsofCTAB,Trizol,Bizol,and SDS,totalRNA wasisolated from panaxginsengcv.
Hongguoleaves,ThequalityoftotalRNAwasanalyzedwithagarosegelelectrophoresisandUVspectrophotometer.The
resultindicatedthatthepurityofRNAextractedwashighbyfourmethods,alofA260/A280wasrangefrom 1.7to2.0;
thesharpnesof28Sbandswastwicethan18SofbandsbyusingSDSmethod,andwasnotcontaminative.Theother
methodswerelesthanthatSDSmethod.AfterRT-PCR,dscDNA bandssizewasrangefrom 0.2kbto3.0kb,the
resultsfurtherdemonstratedthatthepurityandintegralityoftotalRNAisolatedbyusingSDSmethodweresignificantly
satisfactoryforthedemandsofmolecularbiologicalresearch.
Keywords: PanaxginsengleavesRNAextraction RT-PCR
2008年第1期
4年生红果人参(PanaxGinsengC.AMeyer.cv.Hongguo)叶片采自吉林抚松。
1.2 主要试剂
试剂:Trizol为 Invitrogen公司产品,Bizol为 BIOER公司产品,RQ1RNase-FreeDNase为 Promega公司
产品,反转录试剂盒为 Clontench公司产品。其他均为国产分析纯试剂。
1.3 提取方法
1.3.1 CTAB法 向1.5ml的离心管中加入 0.6ml的 CTAB提取缓冲液(2%CTAB,1.4mol/LNaCL,0.025mol/L
四硼酸钠 pH=8.0),10%的 β-巯基乙醇。65℃水浴中预热。取红果人参叶片 200mg,迅速加液氮冷冻研磨成
细粉状,加入到预热的提取缓冲液中,65℃水浴 5min。加入 300μlTris平衡酚,300μl氯仿,震荡 10min,4℃,
13000r/min-1,离心 10min,取上清,加 Tris平衡酚、氯仿各 300μl,重复抽提一次,取上清,向其中加入 600μl
的氯仿,震荡 5min,4℃,13000r/min-1,离心 5min。取上清,加入等体积的 5mol/LLiCL,1/2体积的无水乙醇,
混匀,冰上沉淀 10min,4℃,13000r/min-1,离心 10min。去上清,用冰浴的 75%的乙醇洗涤沉淀。空气中干燥
沉淀,加 40μl的 DEPC水溶解 RNA。
1.3.2 Trizol法 取红果人参叶片 100mg,迅速加液氮冷冻研磨成细粉状,装入 1.5ml的离心管,加 1ml的
Trizol。混匀,室温放置 5min,加入 200μl的氯仿,颠倒混匀 15s,室温放置 2min,4℃,12000r/min-1,离心
15min,取上清弃沉淀。上清转移至新的离心管中,加入500μl的异丙醇。混匀,室温放置10min,4℃,12000r/min-1,
离心 10min。去上清,沉淀中加入 1ml75%的乙醇,涡旋震荡样品,4℃,7500r/min-1,离心 5min。用移液器小
心去除乙醇,沉淀在空气中干燥大约 5~10min,加 40μl的 DEPC水溶解 RNA。
1.3.3 Bizol法 取的红果人参叶片 200mg,迅速加液氮冷冻研磨成细粉状,装入 1.5ml的离心管,加入 1ml
的 BIZOL,震荡混匀,室温放置 15min,4℃,12000r/min-1,离心 5min,取上清弃沉淀。在上清中加入 200μl的
氯仿,震荡混匀,冰上放置 15min,于 4℃,12000r/min-1,离心 15min。取上清,转移到一个新的离心管中,加
等体积的冰浴的异丙醇,颠倒混匀,将混合的样品在-20℃下孵育 25min,4℃,12000r/min-1,离心 10min。弃
上清,用冰浴的 75%的乙醇 1ml洗涤 RNA沉淀一次,涡旋震荡样品,4℃,12000r/min-1,离心 5min。去除上
清,空气中晾干沉淀,加 40μl的 DEPC水溶解 RNA。
1.3.4 SDS法 先在 1.5ml的离心管中加入 750μl的提取缓冲液 (2%SDS,4mol/L尿素,0.1mol/LNaCl,
0.01mol/LEDTApH8.0,0.05mol/LTris-HClpH8.0)、10%的 β-巯基乙醇,取 200mg叶片,在液氮中研磨成粉
末,迅速加入其中,然后加入 350μlTris平衡酚,350μl氯仿,震荡 10min,4℃,13000r/min-1,离心 10min,取
上清,加Tris平衡酚、氯仿各350μl,重复抽提一次,取上清,向其中加入 750μl的氯仿,震荡 5min,4℃,13000r/
min-1,离心 5min,取上清,加入 3倍体积的无水乙醇、1/10体积 3mol/L的 NaAC(pH5.2),混匀,-70℃沉淀
15min;4℃,13000r/min-1,离心 15min,弃上清,用冰浴的 75%的乙醇 1ml洗涤 RNA沉淀一次,空气中晾干
沉淀,加 40μl的 DEPC水溶解 RNA。
1.4 总 RNA质量检测与分析
1.1%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性,紫外分光光度法进行纯度检测。
1.5 RT-PCR检测
将提取的总 RNA用 RQ1RNase-FreeDNase消化 DNA。消除可能的 DNA污染。根据 clontech公司提供
RT-PCR操作体系说明书进行。将总 RNA使用反转录酶和 SMARTIVOligonucleotide反转录成单链 cDNA,
单链 cDNA通过 LD-PCR扩增生成 dscDNA。所提供的引物序列:SMARTTMIVOligonucleotide(10μM):5-
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3;CDSII/3PCRPrimer(10μM):5-ATTCTAGAGG
CCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3(N=A,G,CorT;N-1=A,G,orC);5PCRPrimer(10μM):5-
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3。PCR程序反应参数如下:95℃预变性 1min;95℃变性 15s,68℃延伸
6min,共 23个循环;至 4℃结束反应。取 5μl反应产物进行 1.1%的琼脂糖电泳鉴定产物。
杨成君等:红果人参叶片RNA的提取 137
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
2 结果与分析
2.1 总 RNA的质量检测与分析
取适量的总 RNA经紫外分光光度.计进行纯度测定,质量好的 RNA的 OD260/OD280值 1.7~2.0之间,以
上 CTAB、Trizol、Bizol和 SDS四种方法得到的纯度都比较高,分别是 1.96、1.79、1.93、1.98。
用 1.1%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性,经琼脂糖凝胶电泳检测(图 1)。结果表明:CTAB法所
提取红果人参叶片的 RNA不完整。28S和 18S的荧光亮度不接近
2∶1,在 28S、18S条带附近有明显的拖带现象,说明所提取的 RNA
有部分降解。在泳道的上方能看见比较浅的 DNA荧光条带。说明
CTAB法提取的 RNA中有 DNA的污染。
Trizol法所提取的 RNA能看见 3条主带的存在,但是 RNA的
完整性不好,28S和 18S的荧光亮度差不多,接近 1∶1,未呈现 2倍
的关系。说明所提取的 RNA降解严重。在点样孔上有明显的亮带,
说明所提取的 RNA比较脏。去除杂质不彻底。有 DNA污染。
Bizol法所提取的 RNA能看见明显的三条主带,28S与 18S条
带亮度比较接近 2∶1,但是在泳道的上方也能隐约看见 DNA的条带,说明此方法提取红果人参叶片的
RNA的效果也不佳。但要好于前两种方法。
SDS法所提取的 RNA中 28S、18S条带清晰可见,28S与 18S荧光亮度比接近 2∶1,说明 RNA比较完
整。泳道上方没有 DNA出现,也没有拖带现象,点样孔干净。综合比较以上 3种方法,SDS法所提取的 RNA
比较好。
2.2 RT-PCR分析
为了进一步确定所提取的 RNA的完整性,对 SDS法和 Bizol法提取的 RNA进行了反转录。首先对两
种方法所提取的总 RNA使用 RQ1RNase-FreeDNase进行消化 DNA。消除可能的 DNA污染。反转录后第一
链 cDNA经过 LD-PCR合成 dscDNA。经 1.1%琼脂糖凝胶电泳检测,SDS法提取的 RNA经过 RT-PCR得到
dscDNA片段条带弥散分布大小在 0.2~3.0kb(图 2),进一步表明 SDS法提取的总 RNA质量合格,降解量
少,cDNA的长片段较多。说明能够用于进行下一部
cDNA文库构建分子生物学研究。Bizol法提取的
RNA经过反转录 RT-PCR得到 dscDNA片段条带弥
散分布大小在 0.1~1kb,条带弥散短,亮度浅,说明
cDNA长度不足,片段少。证明 Bizol法提取的 RNA
不完整。不能用于下一步的分子生物学研究。
3 讨论
Trizol是各种提取 RNA的经典方法。Trizol法以
及其改进的方法被研究者们广泛应用。提取方法简
便,整个实验流程短,减少了实验前准备的工作量。
但是 Trizol商业试剂比较昂贵。陈亮等[1]应用 Trizol
一步法从富含多酚茶树新梢中提取到了质量好的
RNA;王昆[2]等也研究了人参 RNA提取方法,其中对
Trizol法进行了改良,从成熟的叶片中获得了高质量、完整性好的总 RNA;但是王壮伟[3]等介绍 Trizol法在
苹果属组培苗中很难得到完整的 RNA。实验中,应用 Trizol法也没有得到质量合格红果人参叶片的 RNA。
Bizol法提取的 RNA要好于 CTAB、Trizol法,其操作简便,实验流程短。与 Trizol法类似。但是其反转录
图 1 总 RNA的电泳图
ACTAB法 BTrizol法 CBizol法 DSDS法
图 2 dscDNA的 1.1%琼脂糖凝胶电泳
A SDS法提取的 RNA经过 RT-PCR得到 dscDNA BBizol法提
取的 RNA经过 RT-PCR得到 dscDNA 1dscDNA 2Marker
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片段短,证明其 RNA不完整。Bizol法提取 RNA的报道也较少,对于 Bizol法提取红果人参叶片 RNA还需
要进一步的研究。
CTAB、SDS法都是常规的提取方法。CTAB、SDS是蛋白质变性剂,对 RNase有较强的抑制作用,在材料
提取之前,预先在提取液中加入 Tris-平衡酚、氯仿,更能有效的抑制 RNase的活性。同时 Tris-平衡酚、氯仿
进行长时间的震荡抽提,可以充分的变性 RNase,通过离心除去。在两种方法中,提取液中都加入了 10%的
β-巯基乙醇,高浓度的 β-巯基乙醇用来抑制 RNA酶的活性,也可以防止样品氧化,因为酚类化合物很容
易被氧化形成以共价键连接的奎宁,更易于绑定核酸,这引起了对 RNA不可逆转的破坏[4]。β-巯基乙醇作
为强还原剂可以防止多酚的氧化,可以打断多酚氧化酶的二硫键使之失活[5]。SDS也是阴离子去污剂,可以
解离核酸与蛋白质的结合,并且蛋白质与带正电荷的侧链结合,在高盐存在下形成 SDS-蛋白质复合物而
沉淀[6]。在 SDS法中无 65℃水浴,这样也避免了 CTAB法中由于高温而引起 RNA降解的机会。
在 4种方法中使用了不同的 RNA沉淀方法,CTAB法使用等体积的 LiCl结合无水乙醇,冰上沉淀
10min。沉淀时间少,快速。LiCl可以选择性的沉淀 RNA,但是有 DNA污染,需要多次重复沉淀。同时残留
的 LiCl会抑制 RNA的体外翻译、反转录。因此所得的 RNA不能直接用来进行反转录或体外翻译[2,7],需要
重复沉淀和纯化样品。异丙醇沉淀也会使用 DNA沉淀下来,如果沉淀时间过长,也会沉淀其他杂质。SDS
法中使用了 3倍体积的无水乙醇、1/10体积 3mol/L的 NaAc(pH5.2),-70℃沉淀 15min。3mol/LNaAc可以
选择的沉淀 RNA,将 DNA留在溶液中,方法简单,有效,沉淀时间短。
RT-PCR方法是检测 RNA质量的良好方法,因为多糖等杂质的污染将抑制 RNA的反转录,反转录对
于 RNA的纯度是高度灵敏的,在 RNA中含有微量杂质都会干扰反转录。制备质量合格的 RNA是进行
cDNA文库等分子生物学研究的关键。本研究中通过 SDS法提取 RNA进行的 RT-PCR的结果说明制备的
RNA的完整性好,并且纯度较高。多糖等杂质污染小,表明该法提取的 RNA具有较强的反转录活性,完全
实用于常规的 RT-PCR检测。SDS法对红果人参叶片 RNA的成功提取,为人参植物的分子生物学研究以
及奠定良好的技术基础。
致谢:在人参材料采集的过程中,感谢中国农业科学院特产研究所的王英平研究员给予的大力支持和帮助,特此表示感谢!
参考 文献
1 陈亮,赵丽萍,高其康.农业生物技术学报,2005,13(1):21~25.
2 王昆,王颖,鲍永利,等.生物化学与生物物理进展,2006,33(1):95~99.
3 王壮伟,渠慎春,章镇,等.果树学报,2004,21(4):385~387.
4 WangDH,WangBC,LiB,DuanCR,ZhangJ.ColoidSurfaceB,2004,36:111~114.
5 ChangS,PuryearS,CaimeyJ.PlantMolecularBiologyReporter,1993,11:113~116.
6 张维铭.现代分子生物学手册[M].北京:科学技术出版社,2003.
7 顾红雅,瞿礼嘉,明小天,等.植物基因与分子操作[M].北京:北京大学出版社,1995.
杨成君等:红果人参叶片RNA的提取 139