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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
野生山梨基因组 DNA提取方法和部位比较
田路明　高源　曹玉芬
(中国农业科学院果树研究所 农业部果树种质资源利用重点开放实验室 ,兴城 125100)
　　摘 　要 : 　以野生山梨 ( Pyrus ussuriensis Maxim)嫩叶、一年生枝韧皮部和成熟叶片为材料 ,分别用 CTAB,改良 CTAB +高
盐 + 5% PVP和试剂盒 3种方法提取基因组 DNA,通过测 OD值、DNA琼脂糖凝胶电泳和 SSR引物扩增检验。结果表明 :韧皮
部和嫩叶是最理想的提取 DNA材料 ,改良 CTAB法是比较理想的方法 ,试剂盒是提取 DNA最简便快捷的有效方法。
关键词 : 　野生山梨 　基因组 DNA　SSR
Comparison of DNA Extraction M ethods
in D ifferent Parts of W ild Pyrus
Tian Lum ing　Gao Yuan　Cao Yufen
( Key Laboratory of Fruit Germ plasm Resources U tiliza tion, M inistry of Agriculture, R esearch Institute of Pom ology,
Chinese Academ y of Agricultural Sciences, X ingcheng 125100)
　　Abs trac t: 　Genom ic DNA were extracted by CTAB, imp roved CTAB + 3M NaAc + 5% PVP and DNA extraction Kit from young
leaves, phloem of one2year2old shoot and maturing leaves of wild Pyrus ussuriensis Maxim. The OD value of DNA were measured, and
DNA agarose gel electrophoresis and PCR amp lification of SSR were tested the results showed phloem and young leaves are the best ide2
al material for DNA extraction, imp roved CTAB + 3M NaAc + 5% PVP is a better method for DNA extraction, and DNA extraction Kit is
the most simp le, quickly and effective method.
Key wo rds: 　W ild Pyrus　Genom ic DNA　SSR
收稿日期 : 2009207213
基金项目 :中国农业科学院公益性科研院所基本科研业务费专项 (082060302208)
作者简介 :田路明 (19782) ,男 ,助理研究员 ,主要从事梨种质资源研究 ; E2mail: tlm158@163. com
通讯作者 :曹玉芬 ,女 ,研究员 ,国家现代梨产业技术体系岗位专家 ; E2mail: yfcaas@263. net　　提取高质量基因组 DNA是开展分子水平研究的关键。目前 ,提取植物基因组 DNA的方法主要有SDS、CTAB ,以及改良的 SDS和 CTAB 法等。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取 DNA的难度相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物 [ 1 ]。梨属 ( pyrus)野生种叶片形态、组织结构不同于栽培品种 ,研究发现梨属中的野生种杜梨 ( Pyrus betu laefolia Bge. )叶片多糖含量较高 [ 2 ] ,由于梨树叶片富含多糖、色素和酚类物质 ,这些物质易与 DNA结合 ,降低提取的基因组 DNA的质量和产率 ,因而给提取高质量的梨基因组 DNA增加了困难。关于栽培梨品种 DNA提取方法的研究已有不少报道 [ 3, 4 ] ,梨不同品种其总 DNA提取难易程度不同 [ 5 ]。山梨是梨 属秋子梨系统 ( Pyrus ussuriensis Maxim )的野生种 ,有关野生山梨的分子标记研究未见报道。通过 CTAB法、改良 CTAB法和试剂盒法提取野生山梨基因组 DNA的比较 ,摸索适合提取高质量野生山梨基因组 DNA的高效、简便途径 ,并对 DNA进行初步分析研究。获得高质量的野生山梨资源DNA,将是进一步开展野生山梨资源亲缘关系的分子水平研究的基础。1　材料与方法111　植物材料供试材料为不同产地的野生山梨资源 ,取自于中国农业科学院果树研究所国家果树种质兴城梨、苹果资源圃 ,编号为野生山梨 1、2、3、4、5、6、7、8和 9。
2009年第 11期 田路明等 :野生山梨基因组 DNA提取方法和部位比较
112　方法
11211　DNA 的提取 　分别以野生山梨的幼嫩叶
片、成熟叶片、一年生枝韧皮部为材料 ,取 011 g组
织样品 ,放入 210 m l离心管 ,以火烧的圆钝 1 m l枪
头为一次性磨样棒 ,添加液氮研磨。
改良的 CTAB法 : ( 1 )将研磨好样品的 210 m l
离心管 ,加入 2 m l添加 5% PVP的 CTAB提取缓冲
液 (已 65 o C预热 ) ,混匀后 ,放入 65℃恒温水浴中
保温 45 m in左右 ,水浴过程中多次颠倒混匀 ; (2)水
浴后加入等体积的酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25 /24 /1 ) ,缓
慢上下颠倒混匀 ,以 5 300 r/m in离心 15 m in; (3)取
上清 ,再加入等体积的氯仿 /异戊醇 (24 /1) ,缓慢上
下颠倒混匀 ,以 5 300 r/m in离心 10 m in; (4)取上
清 ,加入 2倍体积的冰冻的无水乙醇 ,同时加入 1 /10
体积的 3 M NaAc,于 20℃沉淀 30 m in; ( 5)挑出沉
淀 ,以 70%和无水乙醇分别清洗一次 ,自然风干 ,加
TE + RNase A (10 mg/m l) 400μl溶解 , 37℃水浴 30
m in; (6)再加入等体积的酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25 /24 /
1)颠倒混匀 , 12 000 r/m in离心 10 m in; (7)取上清 ,
再加入等体积的氯仿 /异戊醇 ( 24 /1) ,缓慢上下颠
倒混匀 ,以 12 000 r/m in离心 10 m in; (8)取上清 ,加
入 2倍体积的冰冻的无水乙醇 ,同时加入 1 /10体积
的 3 M NaAc,于 20℃沉淀 30 m in; (9)挑出沉淀 ,以
70%和无水乙醇分别清洗 1次 (每次约 15 m in) ,自
然风干 ,加 100μl TE溶解 ,置于 20℃保存。
CTAB法 [ 6 ]根据文献操作提取 DNA。Q IAGEN
DNA KIT试剂盒法按照说明书操作提取 DNA。
11212 　DNA电泳检测 　取 5μl DNA样品在 018
琼脂糖凝胶上电泳 , EB染色 ,紫外灯上观察、拍照。
11213　紫外分光光度计分析 　将初提的 DNA溶
液稀释 30倍 ,在 Spectrum 752型紫外分光光度计上
测定 A230、A260和 A280值 ,并作波长扫描。
11214　SSR引物的扩增 　PCR扩增反应在 PTC100
基因扩增仪上进行。采用降落 PCR 进行扩增。扩
增程序为 94℃预变性 4 m in; 94℃ 1 m in,起始退火
温度 60～55℃ 1 m in, 72℃延伸 2 m in,前 10个循
环 ,其中每个循环降 015℃; 然后 94℃ 1 m in,降落
最后的退火温度 55℃ 1 m in, 72℃延伸 2 m in循环
30次 ; 72℃延伸 10 m in; 4℃保存。
113　试剂与仪器
11311　主要试剂 　CTAB、Tris2HCl、EDTA、DNA
Marker、Taq聚合酶、dNTP、β2巯基乙醇、氯仿、异戊
醇、PVP和琼脂糖粉等购自北京鼎国生物技术有限
公司 , Q IAGEN DNA KIT试剂盒中购自于北京华美
生科生物技术有限公司 , SSR引物 KA14[ 7 ]由上海生
工合成。
11312　主要仪器 　UV 752型紫外分光光度计 , Sig2
ma1214离心机 , Swzz2Julabo水浴锅 , B io2Rad电泳仪
和电泳槽 , Gene2Genius凝胶自动成像系统 , B io2Rad
公司 PTC100基因扩增仪。
2　结果与分析
211　DNA凝胶电泳
经 UV752紫外分光光度计检测 ,计算 OD260 /
OD280和 D260 /OD230的比值如表 1。不同方法提取的
山梨不同部位的 DNA , 018 %的琼脂糖凝胶电泳图
如图 1。由表 1和图 1可以看出 ,韧皮部 DNA相对
含量最低 ,但是多糖和多酚等次生物质含量最少 ,韧
皮部 DNA总体较好 ;幼嫩叶片的 DNA相对含量最
高 ,多糖和多酚等次生物质含量较多 ;成熟叶片中
所提 DNA电泳拖尾现象严重 ,多糖含量最高 ,并
受多酚等次生物质影响最严重。从分析方法的角
度 , CTAB 法提取的 DNA 褐化问题严重 , 改良
CTAB法有效减少了褐化的问题 ,试剂盒提取 DNA
前几步均出现褐化现象 ,但通过两次过柱子洗脱 ,
能较好消除褐化物质 , 3种方法都不能有效除去成
熟叶片的多糖问题。试剂盒法提取嫩叶 DNA仍有
少量多糖存在 (图 1 ) ,该法试剂盒所提韧皮部
DNA纯度最高。
212　SSR引物扩增
SSR引物 KA14进行初步扩增结果如图 2。成
熟叶片由于受到多糖和多酚等次生物质的影响 ,扩
增条带较模糊弥散 ,基本不适合试验要求。韧皮部
含多糖和多酚等次生物质少 ,改良 CTAB和试剂盒
方法提取 DNA扩增效果较好 , CTAB法扩增结果基
本可以 , DNA质量对试验结果影响较少。试剂盒提
取的 DNA扩增效果均好于 CTAB和改良 CTAB法
提取的 DNA ,改良 CTAB和试剂盒法均能取得较好
的效果 ;改良 CTAB和试剂盒法提取的嫩叶和韧皮
部 DNA, SSR扩增结果良好 ,能满足试验要求。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
表 1　不同方法提取不同部位 D NA的比较
方法
DNA相对产量 (μg/g) 平均吸光值 OD260 /OD280 平均吸光值 OD260 /OD230 DNA颜色
嫩叶 成熟叶 韧皮部 嫩叶 成熟叶 韧皮部 嫩叶 成熟叶 韧皮部 嫩叶 成熟叶 韧皮部
CTAB 115 100 90 11729 11632 11753 11711 11601 11783 黄 褐黄 黄
改良 CTAB 125 110 100 11762 11653 11795 11957 11712 11983 灰白 黄 白色
试剂盒 145 120 105 11837 11786 11821 21081 11796 21219 白色 白色 白色
3　小结
木本植物由于其叶片组织结构和形态 ,不同于一
年生植物的叶片 ,其 DNA的提取往往受多糖和多酚
等次生物质的影响。通常采用幼嫩叶片提取植物基
因组 DNA ,一年生作物基本不受时间限制 ,对于多
年生的木本植物 ,尤其对于无性繁殖的梨树 ,由于嫩
枝封顶早 ,采集嫩叶受到时间限制。以半木质化的
韧皮部作为提取材料 ,很好地解决提取梨基因组
DNA的时间局限。韧皮部所提 DNA的纯度较高 ,
特别是该试剂盒所提 DNA纯度最高 ,说明韧皮部含
多糖和多酚等次生物质较少。在试验的基础上 ,改
良 CTAB提取方法中 ,添加 5% PVP,基本能有效防
治最后所提 DNA 褐化。改良 CTAB 法前几步以 5
300 r/m in低速离心 ,其目的是减少由于多糖下沉而
损失 DNA ,加入 3 M NaAc,高盐环境下利于 DNA的
沉淀分离 ,加入酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25 /24 /1)重复抽
提一次 ,更有效去除蛋白、多糖等杂质。CTAB和改
良 CTAB法 ,均是以化学反应和离心除去杂质 ,而试
剂盒中的层析柱 ,一般是硅胶滤膜做成 ,通过物理吸
附杂质提纯 DNA,试剂盒结合化学和物理吸附的方
法更有效去除杂质。通过 SSR 扩增检验 , 改良
CTAB法和试剂盒法所提的嫩叶和韧皮部的 DNA,
基本都能满足试验的要求。试剂盒是提取山梨基因
组 DNA的最简单、快速的有效方法 ,一年生半木质
化韧皮部是最理想的提取山梨基因组 DNA的材料。
参 考 文 献
1　 易庆平 , 罗正荣 , 张青林. 安徽农业科学 , 2007, 35 ( 25 ) :
7789～7791.
2　赵玉卉 ,赵小亮. 食品科技 , 2008, 8: 131～133.
3　胡春根 ,郝玉 ,邓秀新 ,等. 遗传 , 1998, 20 (4) : 31～33.
4　刘遵春 ,包东娥 ,廖明安. 华北农学报 , 2006, 21 (4) : 48～50.
5　乌云塔娜 ,张党权 ,谭晓风. 中国生物工程杂志 , 2003, 23 ( 7 ) :
98～101.
6　顾红雅 ,植物分子生物学实验手册. 北京 :高等教育出版社 ,
1998, 3～l2.
7　 Yamamoto T, Kimura T, Euphytica, 2002, 124 (1) : 129～137.
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