全 文 ：生物技术通报
· 研究报告 · 丑了口不已耳口乙 年增刊
仿刺参基因组 提取方法改进
冯志纲 于佳平 丁君 常亚青
大连水产学院农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室 , 大连
摘 要 开发 了利用仿刺参管足活体取样提取基因组 的方法 。 按照传统方法提取仿刺参基因组
需要杀死实验对象并剖取体腔 内纵肌通常 作为实验材料 , 并且实验过程中常常因为仿刺参的生物学性状
而影响最终实验效果 。 以仿刺参在生活状态下拔取少量管足 一 即可 作为取样源 , 在保持仿刺参的生 活
力 不受影响 的 同时提高了取样效率。 对仿刺参基 因组 的提取方 法进行 了改进优化 , 并在常规海洋动物基因
组 提取方法的基础上增加 了部分操作步骤。 与常规的基因组 提取方法相比 , 改进后的 方法获取的基因
组 完全符合后续实验要求。 而且可随时根据即时效果 中间检测 和后续实验要求调整实验步骤 , 更增加了
实验的可操作性。
关键词 仿刺参 基 因组
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动物 D N A 提取技术对于各种实验室实验以及
生产检测都是一项基本的技术 。 但是这项技术应用
于棘皮动物却是有些不同 , 由于仿刺参表面主要是
胶原蛋白和多糖 , 很难获取到足量含有基因组 D N A
的组织和细胞 。 因而棘皮动物提取基因组 DN A 的
传统取样方法就只能是剖取内部的肌肉组织 , 而实
验过程中或实验结束后 , 实验对象死亡 ,这样的结果
对于仿刺参育种选种研究工作的开展极为不利 。 此
外 , 由于仿刺参体内自溶酶体系的存在 ,仿刺参基因
组 DN A 的提取常常会因为各种偶然因素尤其是在
采样过程中低效率操作而导致最终实验失败 。
根据实践经验 , 提出了利用仿刺参管足活体取
样提取基因组 D NA 的方法 , 在保持受试个体活性的
情况下 ,剪取仿刺参的少量管足 , 进行基因组 D NA
的提取实验 。 由于接触个体进行取样的时间较短 ,
以及剪取的少量管足都对仿刺参生活状态影响较
小 ,可以在实验后反馈指导仿刺参选种工作 。
参照有关文献[‘一 4 ] , 对基因组 D N A 的提取过程
进行了优化改进 。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验所用仿刺参为大连水产学院农业部海洋
作者简介:冯志纲(19 77一 ) , 河南林州人 , 硕士研究生 , 主要从事海洋动物遗传育种与繁殖研究 。 Te l : 04 1 1 一4 7 6 21 3 1 , E 一m ail : fz 沙g@ ha t-
mail.eom
通讯作者:常亚青 , 教授 , E 一 m ail : y q ch an g @ 山加 · ed u · cn
年增刊 冯志纲等:仿刺参基因组 DN A 提取方法改进 35 3
水产增养殖学重点实验室养殖中国大连仿刺参群体
(C D )和韩国丽水仿刺参群体(K Y )。
1
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2 主要试剂和仪器设备
1.2.1 药品和试剂 本实验所使用药品和试剂
Tris平衡酚 、 氯仿 、异戊 醇 、 无水乙 醇 、 70 % 乙醇、
ro % SD
S
、琼脂糖均购自上海生工生物有限公司 。
肠ad in g Bu fe r、电泳缓冲液等试剂按照 “分子克
隆实验指南” ( 第 3版)配制 。
1
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2 仿刺参活体取样
1.2.1 取样 将仿刺参放在盛有少量海水的容器
中 , 海水刚没过海参为宜 , 待几分钟海参恢复生活状
态后用尖嘴镊子拔取仿刺参的管足少许(根据实际
情况大约能够获取约0.029)或触手 1 一 3 条(根据
海参的大小) , 带少许海水一起放人取样用 1.sml
离心管中 , 并用记号笔在离心管上做好标记备用 。
1
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2
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2 取样量及仿刺参活性处理 称量所取仿刺
参触手或者管足质量 ,取样量最少不得少于 0.019 ,
放人 1.snil 离心管中 , 按后面介绍的方法提取基因
组 D N A 。
仿刺参失去少量触手或者管足 , 对其正常生活
的影响较小 。 但为防止仿刺参因触手或管足受伤而
感染 , 取样时最好要直接拔取管足而不要用剪刀剪
取 , 以免造成仿刺参肌体的机械损伤而不容易愈合 ,
另外 , 可以按照 IL 海水加入 0.001 9 药品的剂量在
海水中加人青霉素消炎 。
1
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3 基因组 D N A 提取方法
1.3 .1 样品裂解 在盛有仿刺参样品组织的离心
管中 , 用滤纸条小心吸干离心管中残存的海水 , 加人
20 林l裂解液(20() 林岁m l的蛋白酶 K , 0 . 5 % S n S ,
l
o
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0
F L E D
TA
)
, 然后在溶液 中将组织充分剪
碎 , 5 ℃消化约 50 m in , 消化的同时每隔 ro m in 震荡
摇匀一次 , 以保证样品组织充分消化 。
1
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3
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2 萃取 消化结束后 ,在离心管中加人 20 闪
TE S 稀释溶液 。 按传统常规方法则不需要这一步 ,
而由于活体取样获得的组织往往会使消化后溶液过
于粘稠 , 在萃取时无法顺利进行水相转移 , 因此必须
在萃取之前进行稀释。
稀释之后 , 加人 20 闪 的 Tris 一 饱和平衡酚和
200 闪氯仿 一异戊醇(按 24 :1 比例混合) , 萃取 巧 -
30 m in (要轻轻的翻转摇晃 ) 。
1
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3
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3 离心 萃取结束后 , 7 5 0 0 r/ m i n 离心 10
m in , 用移液器抽取上清 , 放人一个新的对应编号的
1.s ml 离心管中 , 弃去中间层蛋白和下层有机溶
液 。 重复步骤 3 一4 一次 。 观察中间层和下层 ,如果
几乎没有中间层 , 且下层颜色浅 , 接近澄清 , 可接着
进行以下步骤 。 否则 , 加入 40 闪氯仿 一 异戊醇
(24 :1) 再萃取一次 。
1
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3
.
4 沉淀 DNA 在取出的上清中 , 加入两倍体
积即约80 闪的 ro o % 的预冷乙醇 (提前保存于 -
20 ℃ ) , 迅速摇晃混匀 , 之后放人 一 20 ℃冰箱中静置
4 h 以上 。
1
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3
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5 再次离心 取出冷藏的实验离心 管在 12
50 0 r/ mi n离心 巧 m in , 直接倒掉其中的溶液 , 基因
组 D N A 会留在离心管中 , 将离心管倒置在滤纸上 ,
吸干剩液 。
1
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3
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6 洗盐 加人 70 % 乙醇 80 闪 , 洗涤一次 , 12
5
0 r/
m in 离心 5 m in , 倒掉溶液 , 再重新低速离心
sm in , 用移液器抽出聚集在管底的液体弃掉 。 室温
晾干 , 至少 30 m in 以上 。
1
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3
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7 溶解 DNA 加人 0. l x花 100 林l , 轻轻振
荡 , 然后放人 4 ℃冰箱中溶解4 h 以上 。
1
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3
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8 检测 D NA 质量 用 1% 的琼脂糖凝胶 电
泳 ,取 2 闪 DN A 模板混合 2 闪上样缓冲液在琼脂
糖胶上点样进行检测 , 电泳结果经凝胶成像显示
DN A 的浓度与质量 。 也可用分光光度计测量 D N A
的浓度(OD , / ODZs。) , 0 D 2。/ o D Zso 的比值在 1.8 -
2.0 之间 , 则表示 D NA 纯度较高。
1
.
3
.
9 D N A 的保存 提取得到的 D N A 如果要长
期保存应放人 一 20 ℃环境或者 一 80 ℃冰箱中(前者
可保存 1年左右 , 后者可以保存 3年以上) 。 如果短
期内使用则可在 4℃冰箱中暂时存放 。
2 D N A 提取结果
用常规方法提取的新鲜仿刺参 D N A 和用改进
方法提取的仿刺参 D NA , 产物用 1.0% 琼脂糖凝胶
电泳检测 , 见图 1和图 2 。
3 讨论
3.1 仿刺参组织取样
海参是一种忱较特殊的棘皮动物 , 由于各种不
同原因 , 比如海参表面主要是胶原蛋白和多糖 ,很难
获取到足量含有基因组 D NA 的细胞 , 棘皮动物提取
吐物杖术通报 B 勿tec hn ole 盯 2008 年增刊
图 1 常规方法提取基因组 D N A 的 1.0% 琼
脂糖凝胶电泳结果(M :D皿0加)
图 2 管足取样提取 D N A 的 1.0% 琼脂糖凝胶
电泳结果(M :D u 仪x〕)
基因组 D N A 的传统取样方法就只能是剖取内部的
肌肉组织 , 而实验过程中或实验结束后 ,实验对象死
亡 。 这样的结果对于仿刺参育种选种研究工作的开
展极为不利 。 因为一旦研究对象死亡 , 所获得的个
体遗传信息在选种上来说已经没有实际意义 ;此外 ,
实验发现仿刺参基因组 D NA 极易降解 , 这可能与其
生物学性状有关 。 当有外物刺激或外界环境变化
时 , 表皮细胞自溶 、脱落 , 直至死亡;第三 , 海参基因
组 D NA 的提取常常会因为各种偶然因素尤其是在
采样过程中低效率操作而导致最终实验失败 。 所以
如果按照传统方法 , 为了有效地防止 D NA 降解 , 要
在鲜活时快速及时取样。 而利用海参幼苗提取的基
因组 D N A 更加容易降解仁’〕。
利用仿刺参管足活体取样提取基因组 DN A 的
方法 , 在保持受试个体活性不变的情况下 , 剪取仿刺
参的少量管足 ,进行基因组 DN A 的提取实验 。 由于
接触个体进行取样的时间较短 , 以及剪取的少量管
足都对仿刺参生活状态影响较小 , 可以在实验后反
馈指导仿刺参选种工作。 这样就使分子生物学技术
能真正成为遗传育种的辅助工具 。 另外 , 经实验检
测 , 使用改进方法提取获得的基因组 D NA 效果与传
统方法相比更优 , 考虑可能与仿刺参的生物学性状
有关 。
从图 1 和图 2 可看出 , 两种情况下得到的仿刺
参基因组 D NA 质量差不多 ,甚至采用改进后方法提
取的 D NA 效果要 比传统方法稍好 。 而改进后的取
样方法明显提高了整个实验进程的工作效率。 节省
了时间和节约了资源 。
利用仿刺参管足活体取样提取基因组 D N A 技
术 , 可以合理利用仿刺参资源 , 进行辅助育种 、养殖
状况监测 、基因筛选 、家系鉴别等工作 。 另外 , 对于
棘皮动物中很多濒危种的保护和研究 , 意义也十分
重大 。
3
.
2 仿刺参基因组 D N A 提取方法的改进
3.2.1 样品组织裂解温度和时间的优化 按照以
前文献采用的海洋动物基因组 D NA 提取方法 , 样品
裂解一般采用 50 ℃ [“〕。 但是实验中 , 仿刺参基因组
DN A 的提取 , 经多次试验最终将裂解温度优化为
5 ℃ 。 由于温度的提高 , 裂解时间就需要格外注意 ,
仿刺参样品组织的裂解一般确定每 ro m in 要颠倒混
匀一次 , 以保证样品组织和裂解液的充分接触 , 同时
也避免局部裂解液浓度过大而引起 D NA 降解 。 在
裂解过程中 , 要随时注意裂解的进行程度 , 在合适的
时候取消保温 , 以免引起 D NA 降解 。
3
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2
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2 萃取效果对 D N A 质量的影响 根据萃取离
心后的上清液在 1.0% 琼脂糖凝胶上的电泳结果同
时也根据获取 DN A 的用途决定萃取次数 。 如果得
年增刊 冯志纲等:仿刺参基因组 D N A 提取方法改进 35 5
到的 D N A 量大而杂质多 , 可单独用氯仿一异戊醇重
复萃取一次 。
3
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2
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3 基因组 DN A 的沉淀 根据 DN A 的质量要
求决定可选用两种不同的方法进行基因组 D NA 沉
淀 。 如果要求 DN A 纯度高 , 而经过萃取后得到的
D NA 量大 , 则可以在室温下沉淀 sm in 即可进行后
续步骤 , 这样得到的 D NA 会损失较大 , 但是纯度较
高。 如果要求的 D N A 纯度不需要太高 ,这时候通常
可以用 一 2 0 ℃ 环境进行低温沉淀 (至少 3 一 4 h 以
上) , 则得到的 D NA 量大 , 但是含有的其他盐类杂
质也相对较多 。
3
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2
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4 洗盐 通常方法用 70 % 的乙醇在 12 50 r/
mi n , 离心 5 m in 以除去 D N A 中的盐类杂质 ,但是 目
前所用的国内离心管一般的管壁处理不是太光滑 ,
因此在离心结束后倒掉 70 % 乙醇时经常会在管壁
上挂液而导致盐类杂质残留较多 , 采用倒掉70% 乙
醇后短暂低速离心(比如5 000r/ m in , s m i n ) , 然后再
用移液器吸取除去残存液体的方法 , 尽可能除去盐
杂质。
3
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2
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5 保存 对于 D NA 的保存问题有些矛盾 。 正
常情况下 , 如果要为了保证 D NA 的持久性效果 , 一
般采用 1 x TE 溶解 , 然后保存在 一 80 ℃ 冰箱或 -
20℃环境 。 但是由于 TE 溶液中 E DTA 的存在 , 在
后续实验中可能会因为鳌合金属离子而影响一些酶
的活性导致实验效果不佳 。 而如果直接用缓冲溶液
(如 d H ZO )溶解 , 又存在保存时效的问题 , 本实验
中采用 0.1 x TE 溶解 D N A 然后在 一 80 ℃冰箱或 -
20℃环境保存 ,然后根据实验要求用缓冲液稀释成
工作液使用 。
参 考 文 献
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