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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
高质量甘蔗基因组 DNA的简便快速提取方法研究
黄东亮 1 覃肖良 2 廖青 3 高轶静1 方锋学 1
( 1广西甘蔗研究所,南宁 530007; 2中国农业大学,北京 100083; 3广西农业科学院农业资源与环境研究所,南宁 530007 )
  摘  要:  甘蔗是世界上重要的糖料作物和能源作物。目前, 甘蔗分子生物学研究已成为甘蔗研究的热点之一。基因组
DNA的提取是进行甘蔗分子生物学研究的基础。本研究设计含一系列 SDS浓度的提取液, 同时设加液氮和不加液氮研磨的
对比试验, 提取甘蔗不同部位叶片的基因组 DNA并进行产量和纯度检测以及分子生物学分析。结果表明,所有提取液提取的
甘蔗基因组 DNA纯度均很高, A260 /A280在 1
8- 2
0之间, A 260 /A 230大于 2, 但提取液 I( 0
75% SDS)提取的甘蔗基因组 DNA产
量较低; 加液氮与否对甘蔗基因组 DNA的提取产量和纯度没有影响 ;以提取的甘蔗基因组 DNA为模板, 分别用一对扩增 SPS
(蔗糖磷酸合成酶 )基因部分片段的引物和一对 ISSR引物进行 PCR扩增, 所有 DNA均能扩增出预期的条带; 用不同的限制性
内切酶对所提取的甘蔗基因组 DNA进行酶切,所有 DNA样品均能完全酶切。本研究得出最佳甘蔗基因组 DNA提取方法如
下: 磨碎甘蔗叶片后, 加 DNA提取液 ( SDS: 1
5% ; T r is: 100 mM; EDTA: 20 mM; NaC :l 500 mM )于 65 裂解 30 m in, 经酚!氯仿
和氯仿各抽提一次, 可获得高产量高质量的甘蔗基因组 DNA, 能满足后续分子生物学研究的要求。
关键词:  甘蔗 基因组 DNA 提取
Simple and Rapid Procedure for Isolation ofH igh Quality
Genom ic DNA from Sugarcane
Huang Dongliang
1
Q in X iaoliang
2
L iao Q ing
3
Gao Y ijing
1
Fang Fengxue
1
(
1
Guangx i Sugarcane R esearch Institute, Nanning 530007;
2
China Agr icultural University, Beij ing 100083;
3
Agricultural Resources and EnvironmentR esearch Institute, GXAAS, N anning 530007)
  Abstrac:t  Sugarcane is an important k ind o f sugar crop and energy crop in thew or ld. Nowaday s, research in mo lecu lar b io logy of
sugarcane had becom e one of the focuses. And iso lation o f genom ic DNA is the basic operation for m o lecular b io logy study on suga r
cane. In this study, genom ic DNA was iso lated from d ifferent po sition leaves o f sugarcanew ith so lu tions conta in ing a ser ies o f concentra
tions o f SDS. M eanwh ile, gr ind ing w ith o rw ithout liqu id n itrog en w ere com pared dur ing iso lation procedure. The quality and y ield o f all
genom ic DNA was detec ted, and analysis on m o lecular leve lw as conduc ted. De tection of OD value show ed that the qua lity of all DNA
w ere h igh, because the va lues of A 260/A280 of a ll DNA were be tw een 1
8 to 2
0, and the va lues o f A260 /A230w ere larger than 2. But the
y ield of DNA ex tracted by so lu tion Iw as low er than that o f DNA extracted by other so lutions. The qua lity and y ie ld of DNA show ed no
d ifference betw een extraction procedure w ith liqu id n itrog en and w ithout it. A llDNA could be used as temp late to am plify puta tive prod
ucts w ith a pa ir o f SPS gene amp lified pr im ers and a pa ir of ISSR prim ers. A llDNA could be digested by d ifferent restr iction endonuc le
ase. F rom th is study, optim al procedure fo r iso lation of high quality sugarcane genom ic DNA w as obta ined, tha t is, ex traction so lution
( SDS: 1
5% ; T ris: 100 mM; EDTA: 20 mM; NaC:l 500 mM ) w as added to sugarcane leaves after g rind ing, incubated at 65 fo r 30
m inutes, ex trac ted by pheno l chloro form and ch lo ro form once, respectively.
Key words:  Sugarcane Genom ic DNA Isolation
收稿日期: 20091203
基金项目:广西青年科学基金项目 (桂科青 0991046) ,广西甘蔗研究所基本科研业务专项项目 ( G2009002 )
作者简介:黄东亮,男,助理研究员,博士,研究方向为甘蔗分子遗传与品种改良; Ema i:l hdl666@ 163. com
覃肖良,男,副研究员,硕士,研究方向为植物病虫害及植物营养; Em ai:l qx@l cau. edu. cn
黄东亮和覃肖良为同等贡献作者
通讯作者:方锋学,男,研究员,从事甘蔗和蔬菜育种及栽培研究; Em ai:l fx8111@ 126. com
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
甘蔗是世界上重要的糖料作物和能源作物。随
着研究理论与技术的发展, 甘蔗分子生物学研究快
速发展起来,已成为甘蔗研究的热点,在甘蔗品种改
良中发挥着越来越重要的作用 [ 1 ]。甘蔗基因组
DNA的提取是进行甘蔗分子生物学研究的基础。
获得完整、纯度高的甘蔗基因组 DNA对后续研究,
如 PCR、酶切等的成功起着十分重要的作用。特别
是进行基因组绘图或分子标记辅助育种等研究,需
要提取大批量样品 DNA时, 简便快速的高质量基因
组 DNA方法显得尤为重要。
1961年, M anuur[ 2] 首先用十二烷基磺酸钠
( SDS)和氯仿从细胞中分离提取 DNA样品。1980
年, Murray[ 3]首先用 CTAB法提取植物 DNA。这两种
方法成为提取植物基因组 DNA的经典方法。但是,
由于不同植物或者是同一植物不同部位的化学成分
或组织结构等的差异,在提取基因组 DNA时往往需
要对经典方法作一些改良或对材料作一些特殊处
理 [ 4]。目前,在这两种经典方法的基础上,已经发展了
许多改良的方法,成功地从植物叶片、愈伤组织、组培
苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出基因组 DNA [ 5]。
甘蔗是蔗糖含量最高的作物,且富含多糖、纤维
及酚类、醌类、色素等物质。这些物质会影响甘蔗基
因组 DNA 的提取质量。目前, 有关甘蔗基因组
DNA提取的报道不多。游建华 [ 6]首先报道用碱裂
解法提取甘蔗基因组 DNA并用于转化。2004年姚
伟 [ 7]报道用改良的 CTAB法可以从少量的转基因甘
蔗叶片中简便快速地提取高质量的 DNA。而同年
王爱勤 [ 8]的研究表明改良的 SDS法提取的甘蔗基
因组 DNA优于 2 ∀ CTAB法。 2008年, 王英 [ 9]进一
步对 CTAB法进行改进,建立了甘蔗基因组 DNA的
CTAB提取方法 III。对甘蔗基因组 DNA提取方法
总结后发现,目前甘蔗基因组 DNA提取方法仍为改
良的 CTAB法 [ 7, 9 ]和 SDS法 [ 8]。 CTBA法试剂成分
复杂、操作烦琐 [ 2, 3] , 而 SDS法使用的 SDS浓度又过
高 [ 4] ,不仅操作不便, 还浪费试剂。所以, 研究一种
简便快速的甘蔗基因组 DNA提取方法极为重要。
本研究在总结前人研究成果的基础上, 设计含
不同 SDS浓度的 DNA提取液,并简化操作程序,经
试验获得一种简便快速的甘蔗基因组 DNA提取方
法。用该方法可以提取出高产量、高质量的甘蔗基
因组 DNA,还节省试剂和时间,特别适用于大批量
样品的的研究,如基因作图、分子标记等。
1 材料与方法
1
1 材料与试剂
甘蔗品种为本所育成的桂糖 21号,于田间随机
采 5个月龄大的甘蔗顶部用于试验。Taq酶、dNTP
购自大连 TaK aRa公司,限制性内切酶 BamH I、H ind
III购自 Ferments公司,
DNA /H in d III、1 kb p lus
DNA Ladder、100 bp DNA Ladder plus购自 TIANGEN
公司, PCR引物合成由上海鼎安公司完成, 其它试
剂按常规方法配制。
1
2 试验设计
本研究采用 SDS法提取甘蔗基因组 DNA。SDS
是一种阴离子去垢剂, 在高温 ( 55- 65 )条件下能
裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性, 同时 SDS与蛋
白质和多糖结合成复合物, 释放出核酸。已报道的
方法中 SDS浓度在 3
0% - 20%之间。本研究设计
SDS浓度: 0
75%、1
5%、3
0%、6
0%。生物缓冲
剂 T risHC l的浓度大多为 100 mmol /L。本研究也
用此浓度。
乙二胺四乙酸 ( EDTA )用于抑制金属离子依赖
性的酶 (螯合 Mg2+、Ca2+ )的活性。一般使用 20
mmo l/L, 本研究也用此浓度。 CTBA法的提取液中
NaC l浓度一般为 1
4 mol /L, SDS法中 N aC l的浓度
一般为 0
5 mo l/L。本研究设计了 4种提取液 (表
1)。叶片中 DNA含量丰富, 且取样方便,大多数研
究均采用叶片作为提取 DNA的样品,但不同叶位的
叶片由于叶龄不同成分有所差异。本研究分别取心
叶、正 1叶、正 2叶、正 3叶用不同提取液提取基因
组 DNA。前人研究大多使用液氮研磨样品,为了研
究不使用液氮对 DNA提取的影响, 本研究同时设不
用液氮研磨的处理。
表 1 DNA提取液配方
提取液 SDS浓度
(% )
TrisHC l( pH8
0)
(mm ol)
EDTA
(mmo l)
N aC l
( mm ol)
I 0
75 100 20 500
II 1
5 100 20 500
III 3
0 100 20 500
IV 6
0 100 20 500
102
2010年第 5期 黄东亮等:高质量甘蔗基因组 DNA的简便快速提取方法研究
1
3 DNA提取步骤
取 0
1 g甘蔗叶片,先用剪刀剪成碎片, 加液氮
(或不加 )继续研磨, 加入 1mL预热至 65 的 DNA
提取液,继续研磨混匀; 将匀浆液转入 1
5 mL离心
管; 65 温浴 30 m in, 期间颠倒混匀 2次; 冰浴 5
m in; 12 000 r/m in离心 5 m in; 将上清转入 1
5 mL
离心管中;加入 1 L RNA酶 ( 10 mg /mL) , 37 , 30
m in;加入等体积酚!氯仿 !异戊醇 ( 25!24!1)抽提 1
次; 12 000 r/m in离心 5m in;将上清转入 1
5 mL离
心管中,加入等体积氯仿抽提 1次; 12 000 r/m in离
心 5m in;将上清转入 1
5 mL离心管中;加入 2倍体
积无水乙醇, 颠倒混匀,室温沉淀 10 m in; 12 000 r/
m in离心 10 m in; 弃上清,用 75%酒精洗沉淀 2次;
加 100 L水溶解,即为基因组 DNA溶液。
1
4 OD值检测
取 2 L DNA用水稀释至 100 L, 用水作为空
白对照,在核酸蛋白质含量测定仪 ( B io photom eter,
Eppendorf)上读出 A 260 /A 280、A 260 /A 230值和浓度。
1
5 琼脂糖凝胶电泳
取 1 L DNA跑 %l 琼脂糖凝胶电泳。
1
6 PCR反应
反应体系: 10 ∀ PCR bu ffer ( 15 mM M g2+ )
2
0 L, 10mmol /L dNTPM ixture 1
6 L, 10 mo l/L
sense primer 1 L, 10 mol/L ant isense primer 1 L,
Taq DNA polymerase 0
2 L, Template DNA 0
2
L,加水至总体积 20 L。反应条件: 95 预变性 3
m in, 95 变性 30 s, 60 退火 30 s, 72 延伸 3m in,
共 30个循环, 72 延伸 5 m in。取 PCR产物 3 L
在 1
5%琼脂糖凝胶上电泳。
1
7 酶切反应
用 BamH I+ H in d III和 BamH I分别对甘蔗基
因组 DNA进行酶切, 37 反应过夜。酶切产物在
1
5%琼脂糖凝胶上电泳。
2 结果与分析
2
1 不同提取液提取的甘蔗基因组 DNA纯度和产量
取不同处理的甘蔗基因组 DNA在核酸蛋白质
含量测定仪上测出 A 260 /A 280和 A 260 /A 230值 (表 2)。
结果表明,用 4种提取液提取的 DNA其 A260 /A280均
在 1
8 - 2
0之间, 而 A 260 /A230 > 2, 表明所提取的
DNA纯度均很高。但用提取液 I提取的 DNA产量比
其它 3个提取液的低, 说明极低的 SDS浓度影响
DNA的产量, 可能是由于细胞裂解不完全所致。而
其它 3种提取液所提取的 DNA产量并没有显著差
异,说明提取液中 SDS浓度达到 1
5%即可达到最佳
提取效果, 继续提高 SDS浓度也不会再增加 DNA
产量。
表 2 DNA纯度和产量测定
提取液 I( 0
75% SDS) 提取液 II( 1
5% SDS) 提取液 III( 3
0% SDS ) 提取液 IV ( 6
0% SDS )
叶位 液氮 A260 /
A280
A 260 /
A 230
DNA浓度
( ng/L)
A 260 /
A 280
A 260 /
A 230
DNA浓度
( ng /L)
A260 /
A280
A 260 /
A 230
DNA浓度
( ng /L)
A 260 /
A 280
A260 /
A 230
DNA浓度
( ng /L )
心叶 + 1
873 2
173 253 1
834 2
394 766 1
803 2
166 875 1
943 2
047 873
- 1
921 2
481 224 1
963 2
248 789 1
933 2
271 778 1
856 2
258 854
正 1叶
+ 1
945 2
161 254 1
891 2
345 821 1
942 2
273 798 2
048 2
137 792
- 1
890 2
421 253 1
883 2
058 769 1
842 2
391 745 1
879 2
386 735
正 2叶
+ 1
801 2
368 274 1
866 2
159 738 1
847 2
347 737 1
858 2
246 727
- 1
865 2
189 246 1
837 2
326 799 1
798 2
237 773 1
940 2
173 742
正 3叶
+ 1
829 2
318 189 1
849 2
167 746 1
903 2
273 832 1
884 2
223 856
- 1
947 2
077 163 1
930 2
391 735 1
863 2
387 765 1
947 2
345 797
+表示加液氮研磨叶片,–表示不加液氮研磨叶片
103
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
  研究结果表明,用液氮研磨与否对 DNA的质量
和产量并没有显著影响 (表 2 ), 说明甘蔗基因组
DNA的提取完全可以不用液氮研磨。但在试验中
观察到,对于叶龄长的成熟叶片 (如正 3叶 ), 加液
氮更易磨碎叶片。所以, 对于研磨大量叶龄长的叶
片时, 液氮可以提高效率。但对少量样品,多花点力
气研磨,也可以达到很好的提取效果;而对于幼嫩叶
片,没必要加液氮研磨。
2
2 甘蔗基因组 DNA的凝胶电泳检测
将提取的所有甘蔗基因组 DNA进行电泳 (图
1)。结果表明,所有 DNA均跑出清晰的带, 没有拖尾
现象,且加样孔内没有 DNA残留, 表明 DNA结构完
整,没有多糖污染。但提取液 I所提取的 DNA条带
有点淡,表明提取液 I所提取的甘蔗基因组 DNA产
量低于其它 3个提取液,这与产量检测结果一致。
2
3 甘蔗基因组 DNA的 PCR检测
提取基因组 DNA最常用的一项后续研究是进
行 PCR扩增。为验证几种提取液提取的基因组
DNA是否适合于 PCR扩增, 将提取的基因组 DNA
稀释 10倍后取 2 L作为模板,用一对扩增 SPS(甘
蔗蔗糖磷酸合成酶 )部分片段的引物进行扩增
(图 2)。结果表明,所有模板均能扩增出清晰的条
带,说明所有提取液抽取的基因组 DNA均能满足后
续 PCR扩增的要求。
M 1.
DNA /H ind III; M 2. 1 kb plu s DNA ladd er; 1 - 8. 基
因组 DNA
图 1 甘蔗基因组 DNA的电泳检测
M 1. 1 kb p lus DNA ladder; M 2. 100 bp Ladd er plu s; PCR
产物位于 2 - 3 kb之间
图 2 甘蔗基因组 PCR检测
  分子标记技术是近年发展起来的一种基于
DNA变异的新技术手段。分子标记技术研究中通
常需要提取很多品种的基因组 DNA, 所以简便快捷
的基因组 DNA提取方法显得尤为重要。为验证本
方法提取的甘蔗基因组 DNA是否适合分子标记技
术研究,选用了一对 ISSR ( In tersimp le sequence re
peats)引物对提取的甘蔗基因组 DNA进行 PCR
扩增。
同样所有模板均能均能扩增出清晰的条带 (图
3),说明本方法提取的甘蔗基因组 DNA完全能满足
甘蔗分子技术的研究需要。虽然质量和纯度检测表
明, 提取液 I提取的基因组 DNA产量比其他提取液
的低,但经 PCR检测表明,提取液 I提取的 DNA也
能扩增出清晰的条带,说明所有提取液提取的基因
104
2010年第 5期 黄东亮等:高质量甘蔗基因组 DNA的简便快速提取方法研究
组 DNA均能作为 PCR的模板, 能满足基因扩增以
及分子标记等研究的要求。
2
4 甘蔗基因组 DNA的酶切检测
为进一步检验所提取的甘蔗基因组 DNA的质
量, 用几种限制性内切酶对不同提取液提取的甘蔗
基因组 DNA进行酶切。结果表明,所有 DNA均能
被完全酶切 (图 4) ,说明所有提取液提取的 DNA均
满足后续的分子生物学研究的需要。
M 1. 1 kb p lu sDNA ladder; M 2. 100 bp Ladder p lu s
图 3 甘蔗基因组 DNA的 PCR检测
 
M 1.
DNA /H ind III; M 2. 1 kb p lus DNA ladd er;
图 4 甘蔗基因组 DNA的酶切验证
3 讨论
目前报道的植物基因组 DNA提取方法主要有
CTAB(十六烷基三乙基溴化铵 )法、SDS (十二烷基
硫酸钠 )法、碱裂解法、高盐低 pH法 [ 10]。CTAB法
和 SDS法是提取植物基因组 DNA的传统方法。后
来发展起来的大多方法都是在这两种传统方法基础
上改进而来 [ 11- 19 ]。这是由于不同植物或者是同一
植物不同部位的化学成分或组织结构等的差异,在
提取基因组 DNA时往往需要对经典方法作一些改
良或对材料作一些特殊处理 [ 4]。
目前甘蔗研究进入分子水平, 特别是分子标记
研究是当前的热点。分子标记研究往往需要提取大
量样品的基因组 DNA。目前报道的少数几例甘蔗
基因组 DNA提取方法也是在 CTBA法和 SDS法的
基础上改进而来。但总结后发现, 要么试剂成分复
杂, 要么使用的试剂浓度过高, 而且操作都比较烦
琐 [ 2- 4]。所以, 研究一种简便快速的甘蔗基因组
DNA提取方法极为重要。
本研究在总结前人研究成果的基础上,设计了
含一系列浓度 SDS的甘蔗基因组 DNA提取液裂解
细胞,然后经简化的纯化操作。研究表明,提取液中
SDS含量达到 1
5%, 提取的 DNA产量和质量都能
达到最佳效果。即使提取液中 SDS 含量只有
0
75% ,也能提取出纯度很高的甘蔗基因组 DNA,
只是产量降低。用液氮研磨是提取甘蔗基因组
DNA一直使用的操作步骤 [ 2- 4]。但使用液氮研磨
与否对甘蔗基因组 DNA提取质量的影响还无人
报道。
本研究在使用不同的提取液的同时, 设加液氮
与不加液氮研磨的对比试验。结果表明,不加液氮
105
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
研磨提取的甘蔗基因组 DNA产量和质量与加液氮
研磨没有差别。表明,在加液氮研磨是没有必要的,
这不仅简化了操作步骤,节约成本,还对难以购买到
液氮地区或提取样品数量很少的研究很有意义。
不过在试验过程中发现,对于叶龄长的成熟叶
片,加液氮更易磨碎叶片。所以,当研磨大批量叶龄
长的成熟叶片时, 加液氮可以提高效率。但对少量
样品, 多花点力气研磨,同样可以达到很好的提取效
果;而对于幼嫩叶片, 没必要加液氮研磨。
参 考 文 献
[ 1] M ing R, M oore PH, W u KK, DH on tA, G laszmann JC, T ew TL. Sug
arcane Im provem en t th rough Breed ing and B iotechnology. P lan t
Breed ing R eview s, 2006, 27: 15118.
[ 2] M anuur J and Doty P. A P rocedure for be isolat ion of deoxyribonucle
ic acid from m icroorgan ism s. JM ol B io, 1961, 3: 585941.
[ 3] Mu rray MG, Thom psonWF. Rapid isolation of h ighm olecu lar w eigh t
p lan t DNA. Nucleic A cids Res, 1980, 8 ( 19) : 43214325.
[ 4] C saik lUM, B ast ian H, B rettschn eider R, et a.l Com parative analysis
of d ifferent DNA extraction protocols: a fast, un iversalm ax iprepara
tion of h igh quality p lantDNA for genet ic evaluation and phy logenet
ic stud ies. P lan tMo lecular B io logy Reporter, 1998, 16: 6986.
[ 5] 易庆平,罗正荣, 张青林. 植物总基因组 DNA提取纯化方法综
述.安徽农业科学, 2007, 35( 25 ) : 77897791.
[ 6 ] 游建华,何新民,李松,曾慧,刘红坚.甘蔗近缘植物 DNA的提取
及导入研究初报.广西农业科学, 1999, 6: 287288.
[ 7] 姚伟,耿广良,余爱丽,张木清,陈如凯. 一种改良的转基因甘蔗
基因组 DNA提取方法.热带亚热带植物学报, 2004, 12 ( 3 ):
257260.
[ 8] 王爱勤,杨丽涛, 王自章, 韦字拓, 何龙飞, 李杨瑞. 甘蔗基因组
DNA提取方法的比较.中国糖料, 2004, 3: 14.
[ 9] 王英,邱海燕,高和琼,黄东益,庄南生.甘蔗基因组 DNA提取方
法的研究.中国农学通报, 2008, 24 ( 12) : 4449.
[ 10] V arm a A, PadhH, Sh rivastava N. Plant genom ic DNA isolat ion: an
art or a science. B iotechnology Journa,l 2007, 2( 3) : 38692.
[ 11] 黄建安,黄意欢,罗军武,等. 茶树基因组 DNA的高效提取方
法.湖南农业大学学报 (自然科学版 ) 2003, 29( 5 ): 402405.
[ 12] Edw ardsK, Johnstone C, Thom pson C. A sim p le and rap id m ethod
for th e p reparation of genom ic p lan tDNA for PCR an alysis. Nu cleic
A cids Res, 1991, 19: 13491352.
[ 13] Thom son D, H enry R. U se of DNA from d ry leaves for PCR and
RAPD ana lysis. P lant M olecular B io logy Reporter, 1993, 11 ( 3 ):
202206.
[ 14] S tew art CN Jr, V ia LE. A rap id CTAB DNA isolation techn ique use
fu l for RAPD f ingerp rint ing and oth er PCR app licat ion s. B io T ech
n iques, 1993, 14: 748751.
[ 15] H ein ze B. RAPD react ion s from crude plant DNA. M ol B iotechnolo
gy, 1994, 1( 3 ): 307310.
[ 16 ] 王珍,方宣钧. 植物 DNA分离. 分子植物育种, 2003, 1 ( 2 ):
281288.
[ 17] 卢振宇,李明顺,谢传晓,等.玉米叶片 DNA快速提取方法改进
研究.玉米科学, 2008, 16 ( 2) : 5053, 55.
[ 18] 魏琦超,畅丽萍,周岩,宫俊丽,王慧娟.一种简便实用的玉米干
种子基因组 DNA提取方法.广东农业科学, 2009, 6: 165167.
[ 19 ] 黄冰雪,李唯,姜寒玉,等.抗旱型小麦基因组 DNA的提取及
RAPD反应体系优化.甘肃农业大学学报, 2009, 44( 1 ) : 5559.
(上接第 100页 )
[ 5 ] M inafra A, H adidi A. Sens itive d etect ion of grapev ine v iru s A, B, or
leafrollassociated III from viru liferou sm ealybugs and in fected t issue
by cDNA am pl if icat ion. V iro lM eth, 1994, 47: 175188.
[ 6 ] Sh iB J, Nured in, H ab il,i et a.l Extens ive variat ion of sequen ce w ith in
isolates of Grapevin e V iru s B. V irusG enes, 2004, 29 ( 2) : 279285.
[ 7] Nassu th A, PolariE, H elm eczy K, et a.l Im proved RNA extract ion and
on etub e RTPCR assay sim u ltaneou s detection of control p lan t RNA
p lus several viruses in p lan t extracts. Jou rnal ofV irolog icalM ethodes,
2000, 90: 3749.
[ 8] Nak aune R, Nak ano M. E ff icient m ethods for sam p le processing and
cDNA synthes is by RTPCR for th e detect ion of grapevin e v iru ses and
viroids. Journal ofV irologicalM ethodes, 2006, 134: 244249.
106