全 文 ：2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
收稿日期:2007-10-13
基金项目:生物环境科学与技术研究所科研启动项目“纳米生物技术在重金属污染生物修复中应用的研究”(编号:06A02)
作者简介:刘义(1982-),男,湖南衡阳人,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学专业
通讯作者:何钢(1965-),男,湖南湘潭人,教授,硕士,从事生物技术教学和科研;E-mail:hegong262@yahoo.com.cn
当前我国农业环境恶化现象十分严重,据统
计,我国每年因重金属污染导致的粮食减产超过
1000万 t,被重金属污染的粮食多达 1200万 t,合
计经济损失至少 200亿元。据农业部环境监测系统
近年的调查,当前我国大多数城市土壤都受到了不
同程度的污染,污染面积近 1000万 hm2。锌是一种
重要的污染来源[1]。
对锌工业污染的治理,传统的方法有化学沉淀
法、电解法、离子交换法和膜技术分离法等,这些方
法最突出的缺点在于处理低浓度废水时,操作繁
琐,运行费用较高,能耗大,且易造成二次污染。而
以耐锌细菌对锌化合物的特异性转化为基础的生
物吸附法却具有经济、高效,无二次污染等优点,尤
其适于处理低浓度污染或大面积污染等,促使人们
转而分离耐锌菌株,研究抗锌机制,并探索将其应
用于生物修复的可行性[2]。
1 耐锌菌株的锌抗性机制
作为对锌污染全球性蔓延的反应,许多微生物
进化出一套耐锌基因系统以适应在含锌环境中的
生存,称为锌抗性基因。其机理为:锌抗性基因编码
蛋白-ABC(ATPbindingcassete)蛋白家族以依赖能
量的方式而实现对锌的输出,有的输出系统是 ATP
酶,有的是阳离子或质子反向转运体[3]。
ABC家族首次在革兰氏阴性菌中发现,到
1990才在革兰氏阳性菌中发现[3]。ABC家族包括100
多种膜转运体或通道,涉及到许多功能,如有毒物
细菌的锌抗性基因及其在生物修复中的应用
刘义 1,2 何钢 1,2 陈介南 1 周再魁 1 王义强 1,2
(1中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙 410004;
2中南林业科技大学生命科学与技术学院,长沙 410004)
摘 要: 随着工业时代的发展,人源性排放已成为环境锌污染的主要来源。这不但破坏了生态系统的稳定,更经食
物链富集,对人类健康造成严重威胁。利用含锌抗性基因的(重组)细菌等进行锌治理是生物修复的途径之一。阐述了细菌
锌抗性基因的结构、表达产物和一些相关的作用机制,展望其在生物修复方面的应用。
关键词: 细菌 锌抗性基因 生物修复
Zinc-ResistantGeneofBacteriaiaandItsEfectin
BiologicalRestoration
LiuYi1,2 HeGang1,2 ChenJienan1 ZhouZaikui1 WangYiqiang1,2
(1InstituteofBiologicalandEnvironmentalScience&Technology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,
Changsha410004;2ColegeofLifeSciences&Technology,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,
Changsha410004)
Abstract: Withthedevelopmentofindustry,themainresourceofenvironmentalzinc-polutionwasman’sdischarge.This
notonlydestroyedthestabilityofecologybutalsoposedaseriousthreattoman’shealthbyfoodchain.Onewaytocontrol
environmentalzinc-polutionwastheusingofbacteriawithzinc-resistantgene.Thestructure、product、mechanismandapplication
inbiologicalrestorationofzinc-resistantgenewerereferedto.
Keywords: Bacteria Zinc-resistantgene Biologicalrestoration
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
质的外排,营养物质的吸收,离子、肽转运和信号传
递。广泛存在细菌、植物、动物中[4]。ABC家族转运
体结构包括 4个核心区域,一般这 4个核心区域都
是作为一个独立的多肽而被编码,而且,这 4个区
域彼此分离,推测有一个区域具有这个转运体的全
部功能[5](图 1)。
ABC转运蛋白(图 2)是在进化过程中非常保
守,其中 NBDs在各种有机体中,高度保守[6]。大多
数细菌利用带有溶质结合蛋白的 ABC转运体而实
现对 Zn2+的高吸收。
2 锌抗性基因的结构和表达
2.1 位于质粒上的锌抗性基因结构和表达
革兰氏阴性细菌 Ralstonia.eutropha是锌抗性
基因位于质粒上的主要代表,同时也是兼性化能无
机营养菌的代表。这种营养菌适应性很强,对重金
属离子具有很高的抗性水平。该菌种一般都携带抗
锌质粒:pMOL30。抗锌 czc操纵元位于 pMOL30质
粒上。R.eutropha有很多金属抗性系统:3个锌抗性
系统,一个铬酸盐抗性系统,两个二价阳离子抗性
系统。其中阳离子抗性系统包括一个抗锌的 czc基
因抗性系统和一个抗 Ni和 Co的 cnr基因抗性系
统。
2.1.1 Ralstonia.eutropha锌抗性基因czc R.eutropha
czcNICBADRS抗锌基因家族包括8个ORF编码多肽
CzcN,CzcI,CzcC,CzcB,CzcA,Cz,CzcR和CzcS。CzcC、
CzcB和 CzcA蛋白构成一种含 3个组成部分的化学
渗透的反向转运体输出系统,这种输出系统可以实现
离子输出,并导致细胞膜外的碱性增强,最终形成金
属碳酸盐沉淀。生产上已经利用这个特点来处理工业
废水[8]。
2.1.2 锌抗性基因表达蛋白 Czc Czc输出泵由内
膜(CzcA)、外膜(CzcC)和跨膜(CzcC)组成,它们共
同发挥作用运送细胞外(图 3)。其中 CzcA是一个
中心蛋白和质子泵,属于一种阳离子反向转运体。
CzcB是离子结合亚基,CzcC是一种修饰蛋白,这种
修饰蛋白能决定结合金属底物的特异性。czcN和
czcI是 czc操纵元的上游调节序列,cz,czcR和
czcS是 czc操纵元的下游调节序列[9]。
2.2 位于染色体上的锌抗性基因结构和表达
革兰氏阴性细菌 Pseudomonas.aeruginosa原称
绿脓杆菌,是锌抗性基因位于染色体上的主要代
图 1 ABC转运体的结构[5]
ABC蛋白包含一个由 TMDs(twotransmembrancedomains)
形成的水孔,该水孔在细胞膜外侧形成一个很大的开口;
NBDs((nucleotidebindingdomains蓝色部分)在细胞膜内
侧靠近 TMDs并有部分镶嵌在细胞膜内
图 2 ABC蛋白转运底物[7]
①没有结合的 ABC蛋白识别底物②结合 ATP③结合的
ATP促使底物进入膜内通道,这个过程伴随快速的 ATP
水解反应④ABC同源二聚体分离,回到原始状态
图 3 Czc模型[8]
质子/阳离子反向转运体由内膜(CzcA)、外膜(CzcC)和跨
膜(CzcC)组成
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表。在自然界分布广泛,为土壤中存在的最常见的
细菌之一。对重金属离子也具有很高的抗性水平。
其抗锌基因编码蛋白与 R.eutropha中 czc基因编码
的蛋白很相似。为了区别,有时也称 P.aeruginosa中
抗锌基因为 czr基因。
2.2.1 Pseudomonas.aeruginosa锌抗性基因 czrczr
基因包括 5个:czrS,czrR,czrC,czrB,czrA(图 4)。约
长 12.8kb。预测基因 czrS、czrR编码蛋白与传感调
节蛋白 CopS/CopR和 PcoS/PcoR(由质粒上的抗 Cu
基因编码)具有明显的相似性。克隆的 czr序列包
含 czrCBA下游的 ORF序列,其预测基因产物涉及
到芳香族化合物的分解作用。czr基因有很强的保
守性,且定位于菌株 P.aeruginosa染色体上 2400kb
和 2550kb之间。
2.2.2 锌抗性基因表达蛋白 Czr CzrC蛋白与 R.
eutropha的 CzcC、Cnr和 Ncc蛋白功能非常相似,所
以也与代谢产物或有毒物质输出的外层膜因子有
高度的同源性。最明显的特征是 CzrC的氨基酸序
列的 N端有一个脂蛋白信号肽剪接位点[10]。
CzrB显示了与细菌膜融合蛋白 (有助于阳离
子、有毒物质、代谢产物等转运输出)有非常明显的
同源性。CzrB的 N端更短,这样就缺失了锌结合位
点的富集 His的单元,但是,这些富集 His的单元
并不是必须的[11]。
CzrS和 CzrR蛋白与云南烟草野火病病原细菌
Pseudomonassyringae质粒编码的 Cu抗性蛋白 CopS
和 CopR、E.coli中 PcoS和 PcoR的 Cu抗性蛋白、R.
eutropha-likeCH34的有非常高的相似性。czrS和
czrR基因在 czrC基因上游 500bp处,预测编码蛋白
有 224和 472个氨基酸,与细菌两种自磷酸化成份
有明显的相似性。通过分析 CzrR氨基酸序列,发现
其具有保守的调节天冬氨酸活性的自磷酸化位点。
第 6种 ORF编码的蛋白,在 czrA基因的下游,
与 E.coli转录促进子家族 Xy1S蛋白有 62%~74%
的相似性,这种苯甲酸甲苯金属剪接途径的转录激
活因子被不同的 TOL质粒编码。第 7种 ORF,是从
第 6个 ORF下游的 20bp处开始,并显示了与检测
苯甲酸甲苯的 xylX和 benA基因有很高的相似性。
czrSR基因的下游和边缘序列,是 ORF8的一部分,
预测 ORF8编码蛋白的氨基酸序列与 P.aeruginosa
PAO1有毒物质排出系统的 OprM有很高的相似
性。
orf7和 orf9,目前没有发现与之有相似性的
ORF。Orf8和 orf9转录方向与 czrSR基因相反[12]。
czr系统和上述 czc,cop和 pco系统最主要的
区别在于调节基因的位置和转录的起始方向。在 P.
aeruginosa中,czrSR处于 czrCBA基因的上游,而且
是从相反的方向开始转录,而 copRS,pcoRS和
czcRS被定位于金属抗性基因的下游,两个基因同
方向并由一个相同的启动子起始转录。
3 锌抗性基因的转移
虽然目前已分离到的耐锌菌不少,但真正能够
大规模直接用于生物治理的却不多,比如有些菌营
养要求较高或增殖周期长,有些菌降解能力偏低不
能满足实际应用等。随着近年来分子生物学技术的
飞速发展,人们已能按自己的意愿,运用基因工程
技术构建具有超强锌富集能力及高选择性的基因
重组植物及微生物。其分子机制就在于锌抗性基因
的可转移性,而且实验证实:耐锌质粒的转化能赋
予宿主菌与野生型相似的耐锌性。
4 耐锌菌株在生物修复方面的应用
耐锌菌株的分离以及基于锌操纵元的转移性
所构建的基因工程植物和微生物为锌污染的生物
治理提供了丰富的物质基础。目前开展的工作主要
图 4 P.aeruginosa抗锌操纵元的克隆和基因结构[13]
A:czr带 有 pLAFR3 重 组 粘 粒 ,pMOL864, pMOL865,
pMOL866,pMOL867,pMOL864亚克隆以及 CMG103#13功能
互补锌和抗性序列的限制性酶切图谱;B:pMOL888详细的限
制性图谱和 ORF的位置,从图中还可以看出转录的方向
刘义等:细菌的锌抗性基因及其在生物修复中的应用 37
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
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包括基因工程菌对工业废水的生物清洁、基因工程
植物对土壤的生物修复。很早以前,以微生物的锌
抗性机制为基础进行生物清除的潜能就已被承认;
1984年已有报道,但未给出具体操作。直到 1993年
才初次尝试利用耐锌(重组)菌形成的生物膜清洁
污水中的锌,证明了用微生物进行锌污染的生物修
复的可行性[2]。其后,人们又把锌抗性细菌的纯培
养物移植于多孔载体介质上形成生物膜,再将载体
填充于柱形生物反应器内,可使滤过水中锌的清除
率高达 90%~98%[14]。至于利用基因工程植物对土
壤进行生物修复,人们已经做了大量的工作。如从
高积累植物 Thlaspijaponicum中克隆到与金属转运
有关的基因,转化到酵母菌中表达,发现酵母的抗
Zn2+、Ni2+和 Mn2+的能力大大提升[15]。
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