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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
ELISA测定中 TMB显色体系的优化及其稳定性研究
李红梅  陈佳  徐斐  曹慧  M aria Eugen ia
(上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093 )
  摘  要:  通过对间接酶联免疫测定中显色体系的各影响因素的研究 ,确定了酶联免疫测定的最优显色体系为二甲基亚
砜 ( DM SO )配制四甲基联苯胺 ( TM B)浓度为 0. 3 m g /mL的溶液为 A液, pH 5. 5, 0. 2 mo l/L磷酸氢二钠与 0. 1 mo l/L柠檬酸缓
冲液配制过氧化脲素浓度为 0. 74 m g /mL的溶液为 B液, 两者按一定比例混合后使用。试验结果表明, 此显色体系在 25 -
40 内进行都可得到较为准确的结果,且 A、B液混合后在室温下放置 4 h仍可使用。A液及 B液分别在 4 放置 60 d后混合
使用仍不影响测定结果。
关键词:  酶联免疫测定  显色  辣根过氧化物酶  TM B
Optim ization of TMB Substrate Chromogenic System in
ELISA and the Study of Its Stability in Storage
L iHongm ei Chen Jia Xu Fei CaoHu i M aria Eugen ia
( Schoo l of M edical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and T echnology, Shanghai 200093)
  Abstrac:t  By the study o f the factors wh ich influence the chromogen ic reac tion in ind irect EL ISA, the optim al chrom ogen ic system
w as obta ined. So lution A w as prepared by TMB disso lved in DM SO w ith the concentra tion of 0. 3 m g /mL, so lution B w as prepared by
hydrogen perox ide urea d isso lved in pH 5. 5, 0. 2 mo l/L Na2H PO4 - 0. 1 m ol/L c itr ic acid buffe rw ith the concentration o f 0. 74 m g /
mL, and the substrate chrom ogen ic system was prepared bym ix ingA and B in certa in ra tio. The experim ent resu lts show ed that this sub

strate chrom ogen ic system cou ld indicate the result accurate ly, and A, B m ixturewas still e ffective after 4 hours sto rage at room tem pera

tu re. Them ix ture o f so lution A and B still cou ld be ab le to use in EL ISA after be ing stored in 4 for 60 days.
Key words:  ELISA Chrom ogen ic HRP TMB
收稿日期: 2009
10
20
基金项目:上海市教委重点攻关项目 ( 072284 )
作者简介:李红梅,博士,研究方向为食品安全与检测、酶工程及分子进化; E
m ai:l sunnysand@ 126. com
通讯作者:徐斐,女,教授,博士,研究方向为食品安全快速检测技术; E
m ai:l xufe.i f irst@ 263. net
酶联免疫测定法 ( ELISA )是基于抗原抗体结合
的高度特异性及酶的高效催化性的一种免疫分析
法 [ 1] ,由于动物机体天然存在产生各种抗体的能
力,因此,根据抗原抗体特异性结合原理设计的这种
免疫分析方法,几乎可以应用于所有的可溶性抗原
的检测。并且, 随着单克隆抗体技术的发展应用,
ELISA已广泛应用于临床医学、动物检疫、食品科
学、植物病毒、药物残留、病虫害防治等领域,它的最
小可测值可达到 ng甚至 pg水平 [ 2, 3]。与放射性免
疫测定 ( R IA )相比, 酶免疫测定中待测物的含量是
通过酶标记物的酶催化显色反应来判断的, 其优点
是标记试剂比较稳定,且无放射性的危害,能够客观
的显示结果, 因此其应用范围更广。 ELISA常用的
标记酶有辣根过氧化物酶 ( HRP )、碱性磷酸酯酶
( AP)和

D半乳糖苷酶 ( Ga l)等 [ 4- 6]。其中 HRP
一方面易于提取, 价格相对低廉, 另一方面性质稳
定, 耐热及有机溶剂的作用, 与抗原或抗体偶联后,
活性很少受损失。因此, 是迄今为止在 EL ISA中应
用最为广泛的标记用酶。
在由标记酶显色程度深浅来反应测定结果的
ELISA光度分析中, 除去 ELISA本身及操作误差外,
测定过程中最后一步显色体系的灵敏度和准确性,
对确保 ELISA测定结果的准确性也十分必要。而
由于目前关于 ELISA底物的文献及资料较为有限,
2010年第 2期 李红梅等 : EL ISA测定中 TMB显色体系的优化及其稳定性研究
在实际应用中很容易因底物体系的选择不当而影响
测定结果的准确性。本研究以盐酸克伦特罗间接
ELISA测定的显色体系为研究对象,对以 HRP作为
标记酶的显色体系进行优化,以得到可在绝大多数
ELISA测定中适用的显色体系。
1 材料与方法
11 材料
酶标板购自天宇有机玻璃制品高分子技术公
司;包被抗原为本实验室采用重氮化方法制备的 CL
完全抗原;抗 CL单克隆抗体由本实验室自制; 阴性
血清为未经免疫的小鼠血清;辣根过氧化物酶标记
的羊抗鼠 IgG, 购自上海西唐生物科技有限公司;
TMB购自上海伯奥生物科技有限公司;过氧化脲购
自美国 A lfa; KC l、N aC l、K 2HPO4、N aH 2PO 4
12H 2O、
N aHCO3、Na2 CO3、H 2 SO4、H 2O 2 ( 30% )、吐温 20等
均为分析纯,购自上海国药化学试剂有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 间接 ELISA操作  包被: 用 pH9. 6, 0. 01
mo l/L的碳酸盐缓冲液将本实验室自制的 CL完全
抗原稀释至蛋白浓度为 20 g /mL,以 100 L /孔包
被酶标板, 于 4 放置过夜; 洗板: 用含有 0. 05%
Tween20的 pH7. 2, 0. 01 mo l/L的磷酸盐缓冲液
( PBS)洗涤酶标板 5次,每次 1 m in; 封闭:随后加入
3%的明胶作为封闭液, 37 作用 2 h;加抗 CL单克
隆抗体:用 PBS洗涤酶标板 5次后, 用含有 0. 05%
Tween20的 PBS( PBST)洗涤酶标板 5次, 随后加入
用 PBS 1!1 000稀释的抗体及阴性参照血清, 100
L /孔,每个样品设置 5个平行对照, 37 作用 2 h;
加酶标二抗: 用 PBST 洗涤酶标板 5次后, 加入用
PBST稀释后的酶标二抗, 100 L /孔, 37 作用 l h;
显色: 洗板后, 将显色液加入到反应板中, 100 L /
孔;比色:在一定温度下反应一定时间后, 用 2 mo l /L
的 H2 SO 4, 50 L /孔,终止反应, 用酶标仪测定各反
应孔在 450 nm处的 OD值。
1. 2. 2 显色液配制  底物体系为固体 3, 3∀, 5, 5∀

四甲基联苯胺 ( TMB)溶于溶剂中得到的 TMB溶液
为 A液; 含有 H 2O2的 pH5. 5, 0. 2 mo l /L磷酸氢二钠
与 0. 1 mol /L柠檬酸缓冲液的混合液为 B液; 使用
时 A、B两种溶液按比例混合现配现用。
1. 2. 3 显色液中最适 TMB浓度的选择  用乙醇分
别配制 TMB含量为 0. 5、1、2、3、4、5mg /mL的溶液,
即 A液; 将 H2O 2 30%水溶液溶解在缓冲液中使 H 2
O2浓度为 0. 74 g /mL,为 B液。反应时按一定比例
混合,现配现用,在相同稀释度下对同一份单克隆抗
体进行间接 ELISA测定, 在 30 下显色 15 m in, 采
用酶标仪进行读数后记录各孔 OD450的值。
1. 2. 4 显色液中最适 H 2O2浓度的选择  采用不同
浓度的 H2O2配制底物, 研究其对偶联物酶活的影
响。从 1. 2. 3试验步骤确定最佳 TMB浓度配制 A
液, 改变 H 2O2 30% 溶液分别为 0. 21、0. 53、0. 74、
1. 05、1. 26、1. 68 g /mL 为 B液, 进行同上间接
ELISA操作,记录各孔 OD450的值。
1. 2. 5 TMB溶剂种类对显色的影响  分别用 DMSO
和乙醇依据 1. 2. 3中的最适 TMB浓度配制 A液,并
确定 1. 2. 4中的最适 H 2O2配制 B液, 进行同上间接
ELISA操作,分别对比不同反应时间及底物溶液配制
后不同放置时间下两种不同溶剂对显色的影响。
1. 2. 6 H2O2与 H2O 2脲素配制底物对显色的影响 
分别用 H 2O2 30%溶液和 H2O 2脲素依据 1. 2. 4中的
最适 H2O2浓度配制 B液,进行间接 ELISA测定, 分
别对比不同反应时间及底物溶液配制后不同放置时
间下两种不同溶剂对显色的影响。
1. 2. 7 反应温度对显色的影响  依据前几步最终
确立的试验结果配制显色底物溶液,分别在 15、20、
25、30、35、40 下进行间接 ELISA的最后一步显色反
应,采用酶标仪进行读数后记录各孔 OD450的值。
1. 2. 8 ELISA体系中底物灵敏度的测定  将单克隆
抗体从 1!1 000开始进行 2倍系列稀释到 1!1 024 000,
根据前几步优化结果配制显色液,进行间接 ELISA测
定,采用酶标仪进行读数后记录各孔 OD450的值。
1. 2. 9 A液及 B液保存稳定性的研究  按照前几
步优化结果分别配制 A液和 B液, 将其置于 4 冰
箱内,定期使用其进行间接 ELISA测定, 以确定本
配方的保存稳定性及使用有效期。
2 结果与分析
2. 1 最适 TMB浓度的确定
可作为 HRP供氢体的底物主要有邻苯二胺
( OPD)和 3, 3∀, 5, 5∀
四甲基联苯胺 ( TMB )等 [ 7- 10]。
TMB由于其高检测灵敏性和无致突变特性而成为
HRP最常用的新型色原底物。在 ELISA反应体系
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 2期
中,标记酶的酶量通常是固定的,因此显色底物 TMB
的量相对于酶量而言必须过量。由图 1可见, 当
TMB浓度为 3 mg /mL时相对于标记酶的量已过量,
故采用此浓度配制显色液可得到准确的试验结果。
而当 TMB浓度增加时读数略有下降,分析可能是由
于含有 TMB的 A液和 B液混合后, 溶解度下降造
成的, 且在试验中也发现随着 TMB浓度的增加溶液
中产生肉眼可见的沉淀。
图 1 TMB浓度对显色的影响
2. 2 最适 H 2O2浓度的确定
根据 HRP的催化特性, ELISA中一般使用过氧
化氢 (H2O 2 )作为 HRP底物之一, 在供氢体存在时,
HRP与 H2O2的反应迅速且专一。在 HRP催化过程
中,当 H2O2过量时将形成一种能抑制酶活性的复合
物。故 H2O2即是 HRP的底物, 也为其抑制剂, 因而
ELISA要想得到满意的测定结果, H2O2必须限定在
一定的浓度范围内,然而在实际研究工作中,一般很
少注意这一点。因此根据上步所确定的 TMB浓度,
为保证在此体系下所使用 H 2O2的浓度在相对于酶
过量的前提下还不影响酶活,本试验采用不同浓度
的 H2O2配制底物溶液, 确定 A液中 TMB浓度为 3
mg /mL,进行显色反应,结果如图 2所示。
图 2 H
2
O
2
浓度对显色的影响
从图 2中可以看到, H2O2最适浓度为 0. 74 g /
mL, 浓度过高或过低都会降低 ELISA测定的灵敏
度。H 2O2的浓度过低时, 酶促反应不能进行彻底,
而 H2O2的浓度过高时又会对酶活有一定的抑制
作用。
2. 3 最适 TMB溶剂的确定
TMB虽然性质较为稳定, 但其溶解度相对较
低,在试验中会出现溶解又析出的现象。故为了解
决 TMB溶解度低影响显色液的灵敏度这一问题, 本
试验综合考虑 TMB的溶解度及溶剂对酶活的影响。
根据 TMB脂溶性较强的原理, 采用 DMSO溶解
TMB配制 A液与乙醇所配制的 A液进行对比,结果
如图 3所示, TMB的溶剂为 DMSO时显色的产物更
稳定,随着反应时间的增加不会有明显的下降。而
且 TMB可迅速溶解在 DMSO中, 而在无水乙醇中完
全溶解则需要较长时间。
同时对两种混合显色液放置不同时间对显色的
影响也进行了研究,结果如图 4所示,用 DMSO作为
A液溶剂的显色液在 2 h内都可以使用,而无水乙
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2010年第 2期 李红梅等 : EL ISA测定中 TMB显色体系的优化及其稳定性研究
醇作为 A 液溶剂的显色液则需现用现配, 放置
30 m in以上则灵敏度下降很快。在试验中发现 DM

SO作为 TMB溶剂时, 所配制底物的空白值随时间
增加略有升高,但是对测定结果并无影响。
2. 4 H2O2溶液与 H2O2脲素配制底物显色效果对比
30% H 2O 2并不稳定,在试验中大多数研究者所
使用的 30% H2O2溶液的浓度常较理想反应所需的
量大 2- 4倍,且吸附于固相的 HRP较游离的 HRP
更易受过量 H2O2的抑制, 故本试验还使用了同浓度
的 H2O2脲素来代替 H 2O2水溶液进行了测定,结果
如图 5所示。图 5中可以看出,由 H 2O2脲素配制的
底物溶液的稳定性更好,在 4 h内都可以使用, 且显
色稳定。
2. 5 反应温度对显色的影响
温度是酶促反应的重要参数, 在最适反应温度
下酶催化反应效率最高, 为研究在不同室温环境下
进行 ELISA操作对酶反应显色的影响, 本试验在不
同温度下进行了 ELISA中最后一步的酶催化反应,
结果如图 6所示。从图 6可以看出,在 15- 40 的
温度范围内 OD值都没有明显波动, 说明酶标二抗
中辣根过氧化物酶具有较宽的最适反应温度, 在此
温度范围内进行 ELISA测定都可以得到较为准确
的结果。
2. 6 ELISA体系中底物灵敏性的测定
为了验证显色体系在 ELISA测定中的灵敏度,
采用本实验室自制的腹水和一份阴性血清, 起始稀
释度为 1!1 000, 然后倍比稀释, 使用优化后的显色
液, 进行间接 ELISA法测定其效价 (图 7)。结果显
示优化后的显色液可灵敏的显示 EL ISA测定的结
果, 且本实验室自制腹水的效价在 10万以上。
图 7 腹水效价测定结果
2. 7 A液及 B液保存稳定性的研究
为了避免每次使用前都需要现配 A液和 B液,
且在市售试剂盒及仪器测定中都需要显色液有一定
的保存期,故本试验中将优化后 A液和 B液均放在
4 冰箱内, 每隔 1 d将其取出进行间接 ELISA测
定, 结果表明所优化的显色液成分在不加任何保护
剂的情况下可稳定保存 60 d仍不影响测定结果。
TMB贮存液在 30 d时会有颜色产生,但不影响测定
结果。
3 结论
固相结合酶的显色反应也是 EL ISA测定中很
关键的一步, 本试验则对 ELISA测定中 HRP酶标抗
体催化 TMB
H2O2体系的反应条件进行了研究, 得
到了较为灵敏的底物显色体系, 同时在不加保护剂
的情况下此显色液有一定的保存期, 可以满足绝大
多数实验室 ELISA研究, 并且这一研究方法可用于
确定任何某一特定 ELISA的显色体系。然而本试
验结果应用于市售试剂盒或检测仪器还不能够达到
其保质期要求,故需对其贮存保护剂再进行深一步
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 2期
研究, 以期为制备长期保存的试剂盒或相应检测仪
器显色试剂的研制奠定试验基础。
参 考 文 献
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