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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
侵染辣椒的黄瓜花叶病毒 CP基因的序列分析、
原核表达及抗血清制备
刘金亮1  王凤婷1  侯春喜 2  魏毅 1  张世宏 1  潘洪玉 1
( 1吉林大学植物科学学院,长春 130062; 2吉林大学超分子材料与结构国家重点实验室,长春 130012)
  摘  要:  从吉林长春感病辣椒上获得一黄瓜花叶病毒 (Cucum ber m osaic virus, CMV )分离物 ( CMV
CC), 根据 GenBank中
已登录的 CMV外壳蛋白 ( coa t prote in, CP )基因核苷酸序列设计简并引物, 通过 RT
PCR的方法克隆到了长度为 657 bp的目的
片段。序列分析表明, CMV
CC与 CMV I组各分离物核苷酸同源性为 93. 2% - 97. 9%。根据完整 CP基因核苷酸序列构建的
系统进化树显示: 38个 CMV分离物可分为 3个组, CMV
CC属于 CMV的 IB亚组。将 CMV
CC CP基因与原核表达载体 pET

22b( + )连接, 在大肠杆菌 BL21 ( DE3)诱导表达出分子量约 27 kD的融合蛋白。表达的融合蛋白经树脂纯化后免疫家兔制
备了抗血清。用间接 ELISA测定抗血清效价为 1 /4 096。W este rn blotting分析表明制备的抗血清对 CP有高度特异性, 为准
确、快速地检测 CMV奠定了基础。
关键词:  黄瓜花叶病毒  辣椒  CP基因  序列分析  原核表达  抗血清制备
Sequence Analysis, Prokaryotic Expression of CP Gene of Cucumber
M osaic V irus Infecting Pepper and Antiserum Preparation
L iu Jin liang
1  W ang Fengt ing1  H ou Chunx i2  W eiY i1  Zhang Shihong1  PanH ongyu1
(
1
College of P lant Sciences, J ilin University, Changchun 130062;
2
StateK ey Laboratory of Supramolecular Structure and Materials, J ilin University, Changchun 130012)
  Abstrac:t  One iso la te o fCucumberm osaic virus, CMV
CC, w as obta ined from infec ted pepper plants in Changchun, Jilin prov ince.
The 657 bp coat pro tein ( CP) g ene of CMV
CC w as amp lified by RT
PCR. The obta ined CP gene sequences w ere com pa red w ith se

quences of CMV tha t are ava ilab le in the GenBank. Resu lts showed tha t the CP gene o f CMV
CC shared sim ilarity of 93. 2% - 97. 9%
w ith those o f other CMV iso lates in g roup I at nuc leo tide ac id leve .l The phy logenetic tree constructed w ith the com plete nucleotide se

quence of the CP genes show ed that 38 CMV isolates w ere div ided into 3 groups, and CMV
CC be longed to subg roup IB. The CP gene of
CMV
CC w as inse rted into expression vec to r pET
22b ( + ) and transferred intoE. coliBL21 ( DE3). SDS
PAGE show ed tha t CMV
CC
CP gene was expressed as a 27 kD fusion prote in when induced w ith IPTG. H igh spec ific antiserum aga inst to CMV w as prepared after
the rabb itw as immunized w ith the pur ified recom binant prote in. The titerw as 1: 4096 in indirect EL ISA test. Resu lt o fW estern blotting
show ed that the antiserum obta ined cou ld spec ifica lly react w ith CMV CP.
Key words:  Cucum berm osaic virus Pepper Coat prote in gene Sequence ana lysis P rokaryotic expression Antiserum prep

a ration
收稿日期: 2010
04
07
基金项目: 十一五 !国家科技支撑计划项目 ( 2006BAD08A08) ,吉林大学博士科研启动基金项目 ( 4305050102B 2) ,吉林大学基本科研业务费项
目 ( 200903376 )
作者简介:刘金亮,男,博士,讲师,研究方向:植物病毒学与分子植物病理学; E
m ai:l jlliu@ jlu. edu. cn
通讯作者:潘洪玉,教授,博士生导师,研究方向:分子植物病理学; E
m ai:l panhongyu@ jlu. edu. cn
辣椒 (Cap sicum fru tescens)是具有重要经济价值
的蔬菜,现已发现大约 45种病毒能侵染辣椒, 其中
以黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus, CMV )、烟
草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus, TMV )和马铃薯 Y
病毒 (Potato virus Y, PVY )为主, 并且往往是多种病
毒复合侵染。 CMV寄主范围极其广泛, 能侵染 85
2010年第 8期   刘金亮等:侵染辣椒的黄瓜花叶病毒 CP基因的序列分析、原核表达及抗血清制备
科 365属 1 000多种植物, 是造成危害和经济损失
最为严重的病毒之一,可由至少 75种蚜虫以非持久
方式传播 [ 1] , 或以种子带毒传播 [ 2]。近年来, 由于
保护地栽培、品种引进及气候变化, 使 CMV的危害
更加猖獗 [ 3]。
CMV属于雀麦花叶病毒科 (B romoviridae )黄瓜
花叶病毒属 ( Cucumovirus )的典型种。CMV基因组
包括 3种 RNA ( RNA 1- 3)和亚基因组 RNA ( RNA
4) ,有些分离物还含有第 5种 RNA, 即卫星 RNA;含
有 5个开放阅读框 ( open reading frame, ORF) , 分别
编码 5种蛋白: 1a、2a、2b、3a和 CP(外壳蛋白 )。由
于 RNA病毒变异较快, CMV寄主范围广、不同株系
之间易发生重排及卫星 RNA的作用, 使 CMV株系
较多 [ 4- 6]。CP亚基组成病毒粒子的外壳,起到保护
核酸的作用,还与病毒的寄主范围、症状、长距离移
动及蚜虫传播有关,所以, CP基因对 CMV分组和株
系划分有重要意义。根据 CP基因序列和 RNA3 5∀
端重组的情况可以把 CMV分为 3个亚组: IA、IB和
II
[ 7, 8]
, 其中亚组 IB以东亚分离物为主,其它亚组遍
布于世界各地 [ 9, 10]。我国已先后从十字花科、茄科、
百合科及葫芦科等植物上分离到 CMV并测定了其
CP基因序列,众多研究显示,侵染我国植物的 CMV
以亚组 #为主 [ 11- 13]。但近年来, 亚组 II病毒株系
在我国发生的报道频率明显增加 [ 12, 13- 17 ] ,具有与亚
组 I病毒混合爆发的趋势 [ 15]。
本研究利用 RT
PCR的方法,对分离自辣椒的 1
个 CMV长春分离物 ( CMV
CC)的 CP基因进行了克
隆,并通过序列分析和同源性比较,确定了其归属地
位。在此基础上构建了 CMV
CC CP基因的原核表
达载体,使其在大肠杆菌中得到了正确表达,并利用
其纯化的蛋白作为抗原制备了抗血清,为 CMV的准
确快速检测奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
辣椒病毒样品采自吉林省长春市;原核表达载
体 pET
22b ( + )、大肠杆菌 BL21 ( DE3)由山东农
业大学植物保护学院李向东教授提供; 克隆载体
pMD18
T、限制性内切酶等分子生物学试剂产品购
自 TaKaR a公司; PCR产物回收试剂盒、Trizol
rea

gent试剂购自 Inv itrogen公司; 硝酸纤维素膜为 Pa ll
Ge lman公司产品; N i2+
NTA H is
B ind
树脂购自
Novagen公司; 碱性磷酸酯酶标记的 A蛋白、弗氏不
完全佐剂购自 S igma公司。
1. 2 RT
PCR扩增目的基因
按照 Trizo l
reagent试剂盒提供的方法从系统症
状明显的辣椒叶片中提取总 RNA。根据 GenBank
中已登录的 CMV CP基因核苷酸序列设计简并引
物。 5∀端引物 ( P1) : CGG GAT CCG GAC AAA TCY
GRA TCA ACC AG, 3∀端引物 ( P2) : GCG AGC TCT
CAA CTG GGA GCA CNC CNG ATG TGG。为便于
表达载体的构建, 在 P1和 P2引物中分别引入
BamH I和 Sac I酶切位点 (下划线部分 )。以提取
的总 RNA为模板, 采用 RT
PCR方法扩增 CMV
CC
CP基因。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产
物, 并用回收试剂盒纯化回收。
1. 3 CP基因的克隆与序列分析
PCR产物回收后与 pMD18
T连接, 连接产物转
化 E. coli DH5
感受态细胞,提取质粒,经 PCR扩增
和酶切鉴定为阳性的重组质粒 ( pMD18
CP)送上海
博亚有限公司测序。将所得核苷酸序列输入 Gen

Bank进行 B last检索,采用 DNASTAR 6. 0和 MEGA
4. 0软件对所得核苷酸序列与 GenBank中收录的
CMV CP基因的核苷酸序列进行比较和分析, 并构
建系统进化树。
1. 4 CP基因的原核表达
用简并引物 P1和 P2, 以重组质粒 pMD18
CP
为模板进行 PCR扩增。 PCR产物回收后, 按文献
[ 18]的方法构建表达质粒 pET
CP, 转化 E. coli
BL21, 挑取单菌落接种于 5 mL LB液体培养基中
(含 50 g /mL氨苄青霉素 ) , 37∃ 活化过夜, 1%100
稀释到 10 mL含氨苄青霉素的 LB液体培养基中,
37∃ , 227 r /m in培养 3 h, 加 IPTG至终浓度 1mmo l/
L,继续于 37∃ 培养 3 h。离心收集菌体,加适量 TE
溶液 ( pH 8. 0) , 振荡悬浮, 再加入等体积的 2 & SDS
上样缓冲液, 100∃ 煮沸 5 m in, SDS
PAGE电泳检测
基因表达情况。
1. 5 融合蛋白的纯化
取 100 mL诱导表达的菌液, 经 8 000 r /m in离
心 10 m in, 收集 菌 体, 于 25 mmo l/L T ris
HC l
( pH7. 0) , 150 mmo l/L N aC l缓冲液中反复洗涤 2
111
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
次,重悬于 10mL的 1 &N i2+
NTA结合缓冲液 ( 0. 3
mo l/ L N aC ,l 50 mmo l/L N a3 PO4, pH8. 0, 10mmo l/ L
咪唑, 0. 5mmo l/L苯甲基磺酰氟 ( PM SF) , 1mmo l /L
溶菌酶 ) ,冰浴条件下超声破碎菌体, 18 000 r /m in,
4∃ 离心 40m in,弃沉淀, 将上清液转移至新离心管
中。参考 Novagen提供的 N i2+
NTA H is
B ind
树
脂纯化说明进行融合蛋白的纯化。
1. 6 抗血清的制备、效价测定及 Western b lo tt ing
检测
经纯化后的融合蛋白用生理盐水适当稀释后,
加入等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化, 采用肌肉
注射结合皮下注射免疫家兔。每隔 1周注射 1次,
共 5次。最后一次注射 1周后耳静脉采血, 收集抗
血清, 分装后 - 20∃ 贮存。
按文献 [ 18, 19]的方法,用间接 ELISA测定制备
的抗血清的效价,并用W estern b lott ing测定抗血清的
特异性,一抗为原核表达制备的抗血清,二抗为羊抗
兔 IgG(碱性磷酸酶共价结合 ), BC IP /NBT显色。
2 结果与分析
2. 1 基因的扩增及克隆
以发病辣椒叶片总 RNA为模板, 经 RT
PCR扩
增,得到长度约为 650 bp的目的片段 (图 1) ,与预
期大小一致。扩增产物经纯化后克隆到 pMD18
T
载体上。经蓝白斑筛选和酶切鉴定, 得到含有目的
片段的重组子 pMD18
CP。
1. DNA M ark er∋ ; 2. CP基因
图 1 CP基因 RT
PCR扩增产物电泳结果
2. 2 CP基因序列分析
测序结果表明, 分离物 CMV
CC的 CP基因序
列 ( GenBank登录号: GU979890)大小为 657 bp,含
1个开放性阅读框, 编码 218个氨基酸。 CMV
CC
与 GenBank中其它 37个 CMV分离物核苷酸序列的
同源性为 76. 7% - 97. 9%, 氨基酸序列同源性为
799% - 98. 6%。其 中 CMV
CC 与 韩 国 AB I
( L36525)分离物核苷酸同源性最高 ( 97. 9% ),它们
可能有共同的起源。在根据 CP基因核苷酸序列构
建的系统发育树 (图 2), 发现 38个 CMV分离物在
系统进化树上形成 3个大的组 ( I、II和 III组 )。 I组
是最大的一个组包含了 27个分离物,组内各分离物
核苷酸同源性为 97. 4%- 98. 9%, I组可以进一步分
为 IA亚组和 IB亚组。 IA亚组包含 11个分离物,
其中有代表性分离物 Fny( GU453918)、Ny( U22821)
和 Y( D12499)等; IB亚组包含 16个分离物,其中有
代表性分离物 NT9( D28780)、TR15(A J810264)、AB I
( L36525)和 Sa (AB109909), 以及本研究中的 CMV

CC分离物。 II组由代表性分离物 Xb (AF268598)、
Del(EU191025)、Sn(U22822)和 T rk7( L15336)等 8个
分离物构成,组内各分离物核苷酸同源性为 90. 3% -
99. 5%。浙江的 PH z( EU723569)、BX ( DQ399550)和
Dasheen(AF535156) 3个分离物形成 III组。CMV
CC
与 I组、II组和 III组各分离物核苷酸同源性分别为
93. 2%- 97. 9%、76. 7%- 77. 9%、91. 5%- 92. 7%。从
进化树上分析, 包括本研究中的 CMV
CC在内的 14
个中国 CMV分离物在 3个组中均有分布,说明中国
CMV具有丰富的遗传多样性。
2. 3 CP基因遗传多样性分析
为了明确 CMV分离物 CP编码区所承受的选
择压力水平和方向,根据系统进化发育树上显示的
3个组,利用 MEGA 4. 0中 PBL法分析了 38个分离
物 CP基因的非同义突变 ( non
synonymous)和同义
突变 ( synonymous)位点之间的突变率 ( dN /dS)以及
各个亚组内的核苷酸多样性 (表 1)。对于各个组,
组内和组间的 dN /dS值均小于 1,表明 CMV CP编
码区均处于负向或纯化选择。 II组组内 dN /dS最
小 ( 0. 033) ,约是 I组和 III组的 1 /3( I组和 III组相
差不大 ), 说明 II组内 CMV分离物承受的选择压力
最小,具有较小的多样性。但 II组分别与 I组和 III
组组间的 dN /dS最大 (均为 0. 14) ,是 I组和 III组
组间 dN /dS的 2倍, 说明 II组与其它两组 CMV分
离物多样性相差较大。
112
2010年第 8期   刘金亮等:侵染辣椒的黄瓜花叶病毒 CP基因的序列分析、原核表达及抗血清制备
Bootstrap值 (% )大于 50的显示;低于 50的节点被隐藏;系统树上各个分离物依次为登录号、病毒名称、分离物名称、地理来源;分
离物黑体显示;番茄不孕病毒 (T oma to aspermy viru s, TAV) CP基因作为外组 ( outgroup)
图 2 根据 CMV CP核苷酸序列构建的系统进化树
表 1 CMV分离物不同亚组组内和组间 CP基因遗传多样
性分析
组别 #组 (组 )组
#组 dN 0. 02 ∗ 0. 00
dS 0. 18 ∗ 0. 02
dN /dS 0. 11
(组 dN 0. 13 ∗ 0. 02 0. 01 ∗ 0. 00
dS 0. 91 ∗ 0. 12 0. 03 ∗ 0. 01
dN /dS 0. 14 0. 033
)组 dN 0. 02 ∗ 0. 00 0. 13 ∗ 0. 02 0. 01 ∗ 0. 00
dS 0. 30 ∗ 0. 04 0. 97 ∗ 0. 13 0. 11 ∗ 0. 02
dN /dS 0. 07 0. 14 0. 09
核苷酸多样性用 MEGA 4. 0软件中的 PBL法计算非同义突变与同义
突变位点之间的突变率 ( dN /dS ); 遗传距离用 K im ura tw o
param eter
方法
2. 4 CP基因的原核表达及融合蛋白的纯化
将已构建好的表达重组子 pET
CP转化大肠杆
菌 BL21, 并进行诱导表达。根据表达载体 pET
22b
( + )自身起始密码子位置、C端 H is6标签序列, 推
知表达的融合蛋白的分子量为 27. 151 kD。将诱导
表达的蛋白 (沉淀和上清 )及纯化蛋白经 SDS
PAGE
电泳检测,结果 (图 3)表明在 27 kD处出现一条特
异性蛋白带,与预期大小一致,表明 CP蛋白在大肠
杆菌中得到了正确表达。诱导表达的菌液离心
( 6 000 r/m in, 5 m in)后, 在上清和沉淀中均含有目
的蛋白,说明诱导蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种
形式存在。
2. 5 抗血清制备及W estern blotting分析
将纯化的蛋白作为抗原免疫家兔制备抗血清。
113
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
在琼脂免疫双扩散试验中,该抗血清只与 CMV毒原
有沉淀反应, 而与健康对照没有反应。用间接
ELISA测定抗血清效价为 1 /4 096。Western b lo tt ing
分析发现,与 SDS
PAGE中融合蛋白相对应的位置
处出现一条明显的条带, 而在 pET
22b( + )诱导产
物处没有特异的条带出现 (图 3), 表明原核表达制
备的抗血清能与诱导产物起特异性反应, 与菌体自
身蛋白几乎无反应。
1.蛋白分子量标准; 2, 7. pET
22b ( + )诱导产物 (沉淀
菌体 ) ; 3. pET
CP诱导产物 (沉淀菌体 ) ; 4, 8. pET
22b
( + )诱导产物 (上清 ) ; 5. pET
CP诱导产物 (上清 ) ; 9.
pET
CP诱导产物 (纯化 )
图 3 表达产物的 SDS
PAGE检测和抗血清的
W estern b lotting分析
3 讨论
CMV具有极强的进化和适应能力, 不同地区、
不同植物寄主上分离的 CMV在生物学性状和分子
生物学特性上差异很大,这导致 CMV基因组序列变
异较大,株系繁多,使抗 CMV育种工作难度加大,因
此,开展 CMV的亚组鉴定和株系分析具有重要的理
论和实践意义。本研究通过 RT
PCR方法获得了
CMV吉林长春辣椒分离物 CMV
CC的 CP基因,并
通过序列分析确定了其归属地位,该分离物与 CMV
亚组 IB各分离物的核苷酸同源性最高, 与亚组 II
各分离物的核苷酸同源性最低,从而将该分离物划
为 CMV亚组 IB。根据 CP基因序列构建的系统进
化树显示, CMV分离物可分为 3个组 ( I、II和 III
组 ) ,亚组 I又可分为 IA和 IB, 这与 L iu等 [ 20]根据
1a、2a、CP和 MP基因序列划分的结果一致。浙江
的 PHz ( EU723569 )、BX ( DQ399550 )和 Dasheen
(AF535156) 3个分离物形成 III组, 这三个分离物
中, PH z和 BX来自半夏,而 Dasheen来自芋,同属于
天南星科植物,推测这 3个 CMV分离物在特殊的寄
主和环境中可能具有自己独立的进化历程 [ 20, 21]。
通过对 CMV 3个组分离物遗传多样性分析发现, II
组内 CMV分离物承受的选择压力最小,具有较小的
多样性,说明 II组内 CMV株系间的变异程度较小,
同时表现出亚组 II病毒在不同环境条件下对寄主
适应能力、生存能力较强 [ 15]。
由于 CMV可侵染多种重要的经济作物,所以建
立一种快速可靠的检测技术对于控制该病毒的传播
和蔓延尤为重要。由于血清学方法具有简单、快速、
可同时检测大量样品等特点, 因而在植物病毒检测
中占据重要地位。传统方法利用提纯病毒制备的抗
血清中含有寄主蛋白的抗体,容易导致假阳性反应,
而且一些病毒难以提纯, 很难获得高纯度的病毒。
通过纯化原核表达的外壳蛋白制备抗血清简便, 而
且特异性强 [ 22]。本研究在大肠杆菌中高效表达了
CMV的 CP,发现 CMV的 CP表达量较高, 这可能与
密码子的偏好性有关 [ 23]。本研究还利用其纯化的
蛋白制备了特异性抗血清, 为 CMV准确、快速检测
提供了参考。
参 考 文 献
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