全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
四数獐牙菜 ISSRPCR反应体系的正交优化
杨路存 1, 2 陈桂琛1 周国英 1 宋文珠 1 李春丽 1, 2 许璟瑛 1, 2
( 1中国科学院西北高原生物研究所,西宁 810001; 2中国科学院研究生院,北京 100039 )
摘 要: 采用正交试验与单因素设计相结合的方法, 对四数獐牙菜 ISSRPCR反应体系中的 4种主要因素 ( Mg2+、Taq
DNA聚合酶、dNTP及引物 )进行优化筛选, PCR结果用统计软件 SPSS16. 0分析。结果显示, M g2+、Taq DNA 聚合酶、dNTP这
3因素的不同水平对 PCR反应结果都有显著影响,其中 Mg2+的浓度影响最大。筛选出各反应因素的最佳水平,建立四数獐牙
菜 ISSRPCR反应的最佳体系 ( 25 L )为 3. 0 mm ol/L M g2+ , 250 mo l/L dNTP, 0 6 mo l/L引物, 1U Taq DNA聚合酶, 40 ng
DNA, 2 5 L 10 bu ffer。这一体系的建立为今后利用 ISSR技术进行四数獐牙菜遗传多样性分析以及物种保护奠定了技术
基础。
关键词: 四数獐牙菜 ISSRPCR 正交设计 体系优化
Optim ization for ISSRPCR Reaction System in
Swertia tetrap tera U sing OrthogonalDesign
Yang Lucun
1, 2 Chen Guichen1 Zhou Guoy ing1 SongW enzhu1 L iChunli1, 2 Xu Jingy ing1, 2
(
1
Northw est Plateau Institute of B iology, ChineseA cademy of Sciences, X ining 810001)
(
2
Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039)
Abstrac:t An orthogona l des ign comb ined w ith sing le factor exper iment w as applied to optim ize ISSR ( inte r s imp le sequence re
peat) PCR ( po lym erase cha in reaction) amp lification system o fSw er tia tetrap tera. The effec t of the fourm a in reaction sy stem e lem ents
( M g2 + , Taq DNA po lym erase, dNTP and prim e r) on ISSRPCR w ere tested. The result o f PCR analyzed by so ftware SPSS16. 0, show ed
tha t the different leve ls o fMg2+ , Taq DNA po lym erase, dNTP had an s ignificant effect on the PCR reaction resu lt and the concentra tion
o fM g2+ w as the m ost effective factor to the result of PCR. A m ost su itab le ISSRPCR system for S. tetrap tera con taining 3. 0 mmo l/L
M g2 + , 250m ol/L dNTP, 06 mo l/L pr im er, 1 U Taq DNA po lym erase, 40 ng DNA temp la te and 2 5 L 10 buffe r in the tota l
vo lume o f 25L w as established. The resu lt cou ld prov ide the basis for the ana lysis o f diversity and protection o fS. tetrap tera.
Key words: Sw ertia tetrap tera ISSRPCR O rthogona l design Sy stem optim ization
收稿日期: 20100618
基金项目:国家中西部专项项目 ( 2001BA901A47 )
作者简介:杨路存,女,在读博士,研究方向:分子生态学; Em ai:l qhylc2000@ yahoo. com. cn
通讯作者:陈桂琛, Em ai:l gcchen@ nw ipb. ac. cn
四数獐牙菜 ( Sw ertia. tetrap tera M ax im )是龙胆
科 ( Gen tianaceae)獐牙菜亚族 ( Subtribe Sw ertiinae)
獐牙菜属一年生草本植物, 为青藏高原特有种 [ 1]。
特有种负载着适应特殊环境的基因, 这些基因对
物种的进化、新种的产生和物种的绝灭都具有重
要意义。因此, 四数獐牙菜在青藏高原生物多样
性保护方面具有重要的学术价值。同时, 四数獐
牙菜是藏医广泛使用的治疗肝、胆疾病的药物之
一 [ 2]。近年来,随着藏药生产的工业化, 使藏药材
的需求量越来越大, 加上日益强烈的人类活动干
扰导致的森林片断化及生境的不断恶化, 其生存
已经受到了严重的威胁。而目前对四数獐牙菜除
在化学成分、解剖学和胚胎学等方面有过研究报
道外 [ 3 - 6] , 其它学科的研究尤其是对该物种在
DNA水平上的遗传多样性等保护生物学的相关研
究至今尚未见报道。
ISSR( intersimple sequence repeats, 简单重复序
列区间扩增 )是 Z ietkiew icz等 [ 7] 1994年创建的新型
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
分子标记技术, 与 RFLP ( restriction fragment leng th
po lymorph ism )、RAPD ( random amplified po lymor
phism DNA )、SSR相比, ISSR技术可以揭示更多的
多态性, 但比 SSR技术简单, 并具有更高的稳定性
和重复性 [ 8]。 Jonsson等 [ 9]的研究认为, 在进行植物
遗传多样性和保护遗传学的研究时, 可优先考虑使
用 ISSR。国内近年来在药用植物研究方面也开始
采用此方法 [ 10]。
由于 ISSR是基于 PCR的一种标记,易受多种
因素的干扰,其最佳扩增条件在不同物种中各异,为
了获得重现性、可靠性较高的结果,应先对各因子的
最佳反应条件进行探索,建立一个合适的 ISSRPCR
反应体系。目前, 对 ISSRPCR反应体系建立及优
化主要采用单因子试验或正交设计两种方法。正交
试验设计具有均衡分散、综合可比及效应明确等特
性,能最快找到最优水平组合。单因素试验虽然比
较费时,但能对正交的优化组合起到进一步的微调
作用。本研究以 CTAB法提取的四数獐牙菜叶片
DNA为模板, 采用正交与单因素相结合的方法对
ISSR反应体系进行优化, 以建立适合四数獐牙菜
ISSR反应的最佳体系,为今后研究四数獐牙菜地理
种源的群体遗传多样性, 进行系统的保护提供分子
水平上的参考和借鉴。
1 材料与方法
11 材料
2008年 8月, 从青海省达日县 ( N 3348
360, E 9944554, a lt 3 952m )采集四数獐牙菜
鲜嫩叶片,置于盛有硅胶的塑胶袋中干燥保存,并提
取其 DNA作为 PCR扩增的模板。试验用于 ISSR
PCR反应的 Taq酶、Mg2+和 dNTP购自上海生物工
程公司。选用的引物为 UBC825, 其碱基序列为
ACA CAC ACA CAC ACA CT。
12 DNA的提取
采用改良过的 CTAB[ 11 ]法提取基因组 DNA。
用 08%的琼脂糖电泳检测 DNA质量, DNA的浓度
通过紫外分光光度计测定, 并将 DNA浓度稀释为
10 ng /L, - 20 保存备用。
13 PCR反应条件
在 PCR仪上进行扩增, 扩增程序为 94 预变
性 5 m in;然后进行以下 35个循环: 94 变性 45 s,
56 退火 45 s, 72 延伸 2m in, 35个循环; 72 延伸
7m in, 4 终止反应保存。 PCR产物在 15%琼脂糖
凝胶上电泳分离, 电极缓冲液为 1 TBE; 用 100 bp
LadderDNA marker作为标准相对分子量对照。溴
化乙锭 ( EB)染色显带,紫外光下 UV凝胶成像系统
观察并成像。
14 正交设计 PCR体系
采用 L16 ( 44 )正交试验设计 [ 12 ] ,对影响 ISSR
PCR的主要因素, 包括 Taq DNA 聚合酶, dNTPs ,
引物, M g2 +浓度进行 4因素 4水平的筛选分析, 共
16个处理, 每个处理 3次重复, ISSRPCR各反应
成分的因素水平及正交试验见表 1。反应体系中
总体积为 25 L , 包括 10 buffer 25 L, 其它各
成分按照表 1加样, 不足体积用 ddH2O 补足至
25 L。
表 1 PCR反应的因素水平 L16 ( 44 )正交试验设计
处理组合
影响因素
dNTPs
(mmo l/L )
引物
(m ol /L )
Mg2+
( mm ol /L )
Taq酶
( U /25 L)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
150
150
150
150
200
200
200
200
250
250
250
250
300
300
300
300
02
03
04
05
02
03
04
05
02
03
04
05
02
03
04
05
15
2. 0
25
3. 0
2. 0
15
3. 0
25
25
3. 0
15
2. 0
3. 0
25
2. 0
15
05
1. 0
15
2. 0
15
2. 0
05
1. 0
2. 0
15
1. 0
05
1. 0
05
2. 0
15
单因素试验是根据正交试验结果初步选出最佳
体系,在其它因子保持不变的情况下,按一定梯度变
化单个因子,逐个筛选出各因子的最优扩增条件,组
成适合于四数獐牙菜的 ISSRPCR反应体系。 4因
子浓度梯度处理见表 2。
124
2010年第 9期 杨路存等:四数獐牙菜 ISSRPCR反应体系的正交优化
表 2 各因子浓度梯度
影响因素
因素水平 (体系终浓度 )
1 2 3 4 5
dNTPs(mm ol/L )
引物 ( mo l/L)
M g2+ (mmo l/L )
T aq酶 (U /25 L)
015
02
15
05
02
04
2. 0
1. 0
025
06
25
15
03
08
3. 0
2. 0
035
1. 0
35
25
2 结果与分析
21 DNA检测结果
琼脂糖凝胶电泳检测四数獐牙菜 DNA质量,试
验结果如图 1。图 1中 DNA电泳带没有拖尾现象
且图象较为清楚, 可知本次所提 DNA纯度较高,
RNA和蛋白质含量较少或者没有。
图 1 四数獐牙菜基因组 DNA电泳检测
22 正交试验结果的直观分析
参照何正文等 [ 13]的方法,根据 L16( 44 )正交试验
PCR产物电泳结果 (图 2), 按遗传多样性分析的要
求,将 16个处理从高到低依次记分, 分数越高, 表示
敏感性、特异性越好。四数獐牙菜的 3次重复分别独
立统计,依处理顺序得到的四数獐牙菜样品的 3次重
复的分数分别记为: 1, 3, 7, 16, 12, 13, 11, 6, 8, 10, 2, 5,
14, 15, 9, 4; 2, 1, 9, 16, 12, 10, 8, 7, 6, 15, 4, 5, 14, 11, 13,
3; 3, 2, 9, 15, 14, 4, 6, 7, 13, 12, 5, 1, 16, 11, 8, 10。
1- 16.处理代号,参见表 1; M100 bp ladderM arker
图 2 ISSRPCR正交试验结果
23 正交试验设计结果的方差分析
利用统计软件 SPSS 16. 0将上述独立记分结果
进行方差分析,结果见表 3。由 F值可知,在本试验
设置的因素水平范围内, M g2+的量对反应结果影响
最大, 引物的影响最小, 各因素水平变化对 PCR反
应的影响从大到小依次为 Mg2+ , Taq酶, dNTP, 引
物。E ta平方值显示, 各因素对总变异的贡献顺序
为 引物 > dNTP > Taq酶 > M g2 + ; 4因素的观察效
能均较高,表明其检验效能也高, 无须增加样本量。
统计分析结果 (表 3)还显示出 Taq酶及 Mg2+水平
间差异达到极显著水平, dNTP水平间差异达到显著
水平, 进一步进行因素内多重比较。
24 因素内各水平对 ISSRPCR结果的影响
241 Mg2+浓度对 PCR结果的影响 Mg2 +主要
是通过改变聚合酶的活性对 PCR反应结果产生影
响, M g2 +各浓度水平对 PCR结果的影响有差异,表现
为 15- 3. 0mmo l/L范围内,反应结果均值随 Mg2+
浓度的增加呈正比例递增。多重比较分析结果 (图
3)表明, M g2+的 2. 0mmo l/L与 25mmol /L水平间差
异不显著, 其余每二者组合间的差异均达到显著水
平。同时,结合单因素试验的结果 (图 4), M g2+浓度
较低时 ( 15- 25mmo l/L )扩增产物带型较弱, 浓度
为 3. 0 mmo l/L时,扩增条带较为清晰;随浓度逐渐增
大,由于酶活性过高,产生大量非特异性的弥散带,甚
至扩增产物消 失。本 试验确定 Mg2+ 浓度在
3. 0mmol /L时能保证聚合酶的适当活力, PCR扩增
效果良好。
125
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
表 3 四数獐牙菜 ISSRPCR反应各因素间方差分析
变异来源 自由度 d f 方差 SS (型 ) 均方 M S F值 S ig E ta平方 观察效能 ( b)
校正模型 12 695. 000a 57917 6237 0. 000 0681 1. 000
截距 1 3 468. 000 3 468. 000 373477 0. 000 0914 1. 000
dNTP 3 110. 000 36667 3949 0. 016 0253 0787
引物 3 30333 10111 1. 089 0367 0. 085 0268
Taq酶 3 169667 56556 6. 091 0. 002 0343 0939
Mg2+ 3 385. 000 128333 13821 0. 000 0542 1. 000
误差 35 325. 000 9286
总和 48 4 488. 000
校正和 47 1 020. 000
a. R Squared= 681( Ad justed R Squared= 572 ); b. Com puted us ing alpha= . 05
图 3 Mg2+浓度与结果均值关系图
图 4 Mg2+浓度对 ISSRPCR扩增
效果的影响 (引物为 U825)
242 Taq DNA聚合酶浓度对 PCR结果的影响
Taq酶对 PCR反应的影响在所选梯度范围呈正相
关,即随着 Taq酶量增加,结果均值呈上升趋势 (图
5)。Taq酶 05U与 1. 0 U, 15 U与 2. 0 U水平间
差异不显著,其余每二者组合间的差异均达到显著
水平。由反应结果均值与酶量的关系图以及对 Taq
酶进行的单因子试验结果 (图 6)可见, 酶量过低,
PCR反应的敏感性差, 扩增的条带少, 所能提供的
信息少;酶量过高, 则扩增反应的特异性降低, 不利
于条带的观察分析。中间的两个浓度则比较合适,
二者对反应结果的影响差异不大, 从经济的角度考
虑, 可选择 1. 0 U /25 L作为四数獐牙菜 ISSRPCR
反应体系中酶的最佳浓度。
图 5 Taq酶量与结果均值关系图
图 6 Taq酶浓度对 ISSRPCR
扩增效果的影响 (引物为 U825)
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2010年第 9期 杨路存等:四数獐牙菜 ISSRPCR反应体系的正交优化
243 dNTP浓度对 PCR结果的影响 dNTP是
ISSR扩增的底物, 其浓度直接影响扩增产物的合
成。浓度过低则产率下降,浓度过高则错误率增加,
并竞争 M g2 + ,从而影响 Taq聚合酶的作用效率。多
重比较结果显示 (图 7), dNTP浓度对 PCR反应结
果的影响具有较明显的规律, 即在 02 mmo l /L与
025mmol /L水平上整体效果较好,且具缓慢上升
趋势, 在 015 mmo l/L与 03 mmo l/L水平上 PCR
结果则较差。本试验 5个浓度梯度的单因素结果
(图 8)显示, dNTP浓度小于 02 mmo l/L时无扩增
产物 ( 015 mmol /L )或扩增产物带型较弱条带很
弱;在 025mmo l/L与 03mmo l /L浓度内条带明亮
且多态性较高,为理想的用量范围; 035 mmo l/L时
虽然条带清晰,但伴有个别非特异性扩增出现且较
浪费 dNTP原料。最后确定四数獐牙菜扩增反应中
dNTP浓度为 025mmol /L较适宜。
图 7 dNTP浓度与结果均值关系图
图 8 dNTP浓度对 ISSRPCR扩增
效果的影响 (引物为 U825)
244 引物浓度对 PCR结果的影响 引物 02
mo l/L、04 mo l/L、06 mo l/L、08 mo l/L水平
间均无差异。根据引物不同浓度的单因素试验的结
果 (图 9), 将引物浓度定为 06 mo l/L。
图 9 引物浓度对 ISSRPCR扩增效果的
影响 (引物为 U825)
25 ISSRPCR体系稳定性的检测
选择 ISSR引物 U825对优化确立的四数獐牙
菜 ISSRPCR反应体系的稳定性进行检测, 结果如
图 10所示。选用的引物 U 825对所检测的 1个居群
的 21个四数獐牙菜个体都能扩增出清晰、重复性好
的谱带,表明优化确立的四数獐牙菜 ISSRPCR体
系是稳定可靠的。
图 10 四数獐牙菜达日居群 21个个体的扩增结果
3 讨论
由于 ISSR分子标记技术基于 PCR反应, 其扩
增谱带虽较 RAPD标记稳定, 但同样受反应条件和
扩增程序变化以及物种不同的影响 [ 14]。同时,由于
每个人在拟订因素水平时的差异以及方法的不同,
使不同因素对 ISSRPCR的影响大小亦有所不同。
谢运海和张雷凡等 [ 15, 16]的研究认为 Taq酶的浓度
变化对 PCR影响最大, 古松等 [ 10 ]的研究表明 PCR
对引物最为敏感, 而穆立蔷等 [ 17]的研究结果显示
dNTP对 PCR的影响最大。经统计分析本试验结果
显示 M g2 +对 PCR的影响最大, 这与王彦华等 [ 18]在
不结球白菜 ISSRPCR扩增体系中的结果一致。此
外,大量的研究表明 ISSRPCR对 DNA模板的要求
并不严格 [ 19- 21 ] ,因此本试验中未将 DNA浓度作为
影响因素来考虑。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
利用正交设计能迅速得到 ISSRPCR反应的最
佳试验条件的组合,但该方法亦存在一定的局限性,
如对试验结果本身优劣的判断依据带有主观上的成
分,不能很好地估计试验误差, 使各因素最佳反应水
平的确定缺乏可靠性。采用单因子试验可较为直观
快速的得出该因子对试验结果的影响, 但其忽视了
各因子间的互作效应,就很难得到最佳的反应体系。
本试验分别用两种方法分析影响四数獐牙菜 ISSR
PCR体系的因素, 并综合分析优化反应体系, 可在
一定程度上有效克服两种方法各自的局限性, 所得
到的 Mg2 +、dNTP最佳浓度是一致的, 表明了试验
的可信度;在另外两种成分 Taq酶和引物最佳浓度
的确定上, 两种方法的结果存在差异, 这可能与
PCR反应的不稳定性有关, 也可能是由于两者各自
局限性所造成,所以在最佳因素水平的确定上,结合
试验实际,综合了两种方法的结果,以尽可能地减少
试验误差。最后采用最佳因素水平组合进行的 IS
SRPCR扩增结果也较好, 说明两种方法相结合能
有效地保证试验的可靠性。
4 结论
ISSR分子标记技术基于 PCR反应, 其扩增结
果受 Mg2 +浓度、引物浓度、Taq酶用量和 dNTP浓
度等诸多因素的影响。本研究利用 L16 ( 44 )正交
试验设计结合单因素试验方法, 对影响 ISSRPCR
反应的主要因素进行优化筛选分析。结果显示,四
数獐牙菜 ISSR扩增时引物 UBC825经优化后的理
想扩增反应体系为: 25 L 反应体系中, 模板 DNA
40 ng , 3. 0 mmol /L M g
2 +
, 250 mo l/L dNTP, 06
mo l/L引物, 1U Taq DNA聚合酶, 25 L 10
buffer。该反应体系的建立将为后续试验和遗传分
析奠定技术和理论基础。
参 考 文 献
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