全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-27
基金项目:国家自然科学基金项目(30571154)
作者简介:张东阳(1984-),女,硕士生,从事植物蛋白质组研究
通讯作者:晏月明(1960-),男,研究员,博士生导师;E-mail:yanym2004@163.com
蛋白质翻译后修饰是影响蛋白质结构和功能
的重要因素,在细胞生长、分裂、分化、代谢和癌症
的产生等生命活动中起着关键的作用[1~3]。然而,目
前仅有有限的翻译后修饰蛋白是已知的,其中的主
要原因在于其分析技术的限制。而毛细管电泳技术
由于其准确、稳定、简单、快速、高灵敏度和低样品
上样量等优点,在蛋白质翻译后的研究中发挥了重
要作用。
1 毛细管电泳技术及其发展
毛细管电泳技术是从传统电泳发展而来的,是
电泳技术与色谱技术的结合。它是以高压下产生的
强电场为驱动力,以小内径的石英毛细管为分离通
道的液相分离技术[4]。毛细管中带电粒子的移动方
向和速度是由电泳(Electrophoresis)和电渗(Electroo
smosis)2个因素决定的。正离子由于运动方向和电
渗方向一致,最先流出;中性粒子不泳动,随电渗方
向而行;负离子运动方向和电渗方向相反,所以最
后流出。带同种电荷具有不同荷质比的混合物,若
所带电荷为正,则荷质比大者最先分离;若所带电
荷均为负值,则荷质比大者最后泳出[5]。
虽然毛细管电泳在分离样品方面有优势,但经
分离后样品的鉴定却并不容易。毛细管电泳的检测
器主要有荧光检测器、电导检测器、紫外可见检测
器和放射性同位素检测器等几种[6]。近 10年来,随
着质谱技术的发展,特别是当其他检测器不适用
时,质谱作为毛细管电泳的检测器逐渐被关注,它
也越来越广泛地应用到蛋白质组的研究中[7]。质谱
可能是毛细管电泳最有效的检测器,因为每一个荷
毛细管电泳技术在蛋白质翻译后修饰中的应用
张东阳 晏月明
(首都师范大学生命科学学院,北京 100048)
摘 要: 蛋白质中翻译后修饰蛋白的鉴定是蛋白质组学研究的主要内容之一。毛细管电泳技术由于其高分辨能
力、低样品上样量、易操作性和较少的分析时间等特点,迅速发展成为一种重要的分离技术。通过毛细管电泳与质谱连用,
可以得到许多关于蛋白质鉴定、纯化和结构改变方面的十分有价值的信息。对毛细管电泳技术进行了简单介绍,并且就
其在蛋白质磷酸化和蛋白质糖基化研究中的应用进行了综述。
关键词: 毛细管电泳 翻译后修饰 磷酸化蛋白质 糖基化蛋白质
TechnologyofCapilaryElectrophoresisUsedinProteinPost-
translationalModifications
ZhangDongyang YanYueming
(ColegeofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100048)
Abstract: Protein post-translationalmodificationsisamajorpartin the research on proteome.Capilary
electrophoresishasbeendevelopedasanimportantseparationtechnique,whichfeatureshighresolvingpower,smalsample
volumes,simplepretreatment, andshortanalysistime.Byusingcombination ofcapilaryelectrophoresiswith mas
spectrometry,itcanbeabletoobtainvaluableinformationonidentity,purityandstructuralchangesofproteins.This
papergaveanintroductionofcapilaryelectrophoresis,andareviewoverapplicationofphosphoproteinsandglycoproteins.
Keywords: CapilaryelectrophoresisPost-translationalmodificationsPhosphoproteinsGlycoproteins
2008年第5期
质比值都可以看作是一个特定的检测器。但需要注
意的是,毛细管电泳与质谱联用时,所用选择的缓
冲液不仅要适于样品分离,且不能影响鉴定过程中
质谱的信号。毛细管电泳分离中常常遇到的迁移时
间变化等问题,可由质谱的选择性和特异性得到解
决[8]。把质谱作为检测器还可以显著提高样品检测
的极限,并且简化分析结果的过程 [9]。
毛细管电泳包括多种分离模式,如区带电泳
(capilaryzoneelectrophoresis,CZE)、等电聚焦(cap-
ilaryisoelectricfocusing,CIEF);等速电泳(capilary
isotachophoresis,CITP)、胶束电动毛细管电泳(mi-
celarelectrokineticcapilaryelectrophoresis,MECE)
等。近几年来新出现的有像 Coradini[10]所报道的脂
质体毛细管电泳(Liposomecapilaryelectrophoresis,
LCE),通过对比试验发现在磷酸盐缓冲液的 pH值
为 7.4时,通过部分或者全部填充脂质体可以得到
很好的分离分析蛋白质和多肽的结果。
2 毛细管电泳在蛋白质翻译后修饰研究中
的应用
2.1 毛细管电泳分析磷酸化蛋白质
蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最普遍
的一种。在细胞中,大约有 1/3的蛋白质被认为是
经过磷酸化修饰的[1]。在人类基因组中,大约有 2%
的基因编码了 500种激酶和 100种磷酸酶[11]。蛋白
质磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物细胞表达
调控的关键环节,对许多生物的细胞功能起开关调
控作用。据估计在生物机体中,大约 90%的磷酸化
出现在丝氨酸残基,9.9%出现在苏氨酸残基,0.1%
则出现在酪氨酸残基[12,13]。
传统的研究方法是利用放射性标记 32P,但这
种方法对于实验的安全性要求很高,不易操作。车
发云等[14]利用毛细管电泳技术,在非放射性的条件
下,成功对 3个模型磷酸化肽以及天然的磷酸化蛋
白 β-酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了
分析。首先要在电泳前先对样品进行部分酸水解和
PTH-衍生反应。由于在强酸性的缓冲液中只有这 3
种 PTH-磷酸氨基酸带负电,其他 PTH-氨基酸都带
正电或者不带电,所以在施加负压的时候则只有
PTH-磷酸氨基酸向电渗流方向的反方向移动,可以
通过检测器被检测到。而通用毛细管电泳间隙进样
技术可以同时检测浓度不同的相同磷酸氨基酸
PTH-衍射物,从而快速而准确的得到定量结果[15]。
在一定的水解条件下,不同的蛋白质相对于同
一磷酸氨基酸的水解回收率是不同的,所以水解条
件是在蛋白质磷酸化的分析中最重要的因素。其中
磷酸丝氨酸回收率非常依赖于肽序列,并且在强酸
下容易发生水解,使其分析相对困难[16]。所以,水解
条件的优化是利用毛细管电泳分析蛋白质磷酸化
最关键的问题所在。在分析磷酸氨基酸的时候,可
以先把蛋白质降解成多肽,要注意所用的蛋白水解
酶不能含有磷酸酯酶蛋白,然后再对多肽混合物进
行酸水解,从而获得较高的磷酸氨基酸回收率[17]。
Eriksson等[18]利用毛细管区带电泳成功分析胎
盘中的碱性磷酸酶及其降解产物。在 65℃的高温、
强酸及强碱的条件下都可以看到峰面积的减少和
降解产物的增加,并且呈线性关系。使用有效长度
为 30cm的未经涂布的石英毛细管,电泳缓冲液为
包含 2mM腐胺的 50mM硼酸,在电泳前先用 0.1M
NaOH、ddH2O和电泳缓冲液分别冲洗 30min,分离
电压为 15kV,温度为 25℃。
2.2 毛细管电泳分析糖基化蛋白质
蛋白质糖基化是蛋白质翻译后修饰中最关键
的一种。糖不仅仅是生物体的能量来源,也是许多
代谢过程的中间产物。蛋白质糖基化在生物机体的
细胞识别、免疫应答和保持生物分子的稳定性等方
面都起着不可代替的重要作用。糖蛋白的寡糖链通
过糖苷键共价的结合在一起,影响着糖蛋白的特性
和生物活性。由于寡糖链的类型、数量和位置的不
同所造成的糖蛋白的多态性,被称为微观不均一
性。所以蛋白质糖基化的分析相对困难,需要灵敏
度高的分析技术。分析糖蛋白的方法主要有 2种:
一种是直接分析糖蛋白的糖型(glycoform),另一种
是酸水解糖蛋白释放单糖然后再对其进行分析。而
毛细管电泳是分析不同种类糖蛋白的重要技术的
一种,早在 1989年,Kilar和 Hjerte′n[19,20]就利用高
效毛细管电泳,分析了人类血清转铁蛋白(transfer-
rin)的糖型。
利用毛细管电泳分析糖蛋白,缓冲液的组成及
其 pH值得确定非常重要。由于首先就要使样品带
电,但是除酸性糖外,大多数糖蛋白的酸性非常弱,
张东阳等:毛细管电泳技术在蛋白质翻译后修饰中的应用 73
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
只能在强碱性的环境中带部分电荷[21],所以可以采
用络合的方式使糖蛋白变成带电络合物。目前最常
用的方法,即是选用硼酸盐作为毛细管电泳缓冲
液,从而使糖蛋白根据其自身结构的不同分先后顺
序流出得到分离。这样,所需要优化的参数就只有
pH值,而最适合的分离条件一般在 pH8~10之间。
糖蛋白的检测通常分为衍生和非衍生 2种。非
衍生法包括 3种[22]:一是电化学检测法,但只能用
于有电化学活性的分子并且重现性不好;二是紫外
检测法,但是不能进行定量分析并且容易出现一些
意外的峰;三是荧光检测法,然而大多数糖蛋白通
常没有荧光基团,若用激光诱导产生荧光,则要考
虑激光对于荧光背景的影响,且价格昂贵。所以在
检测糖蛋白时,最常用最灵敏的方法是衍生法。衍
生试剂的选择应该既能适于分离又不影响检测,常
用的有 2-氨基啶酮(2-Aminooacridone,AMAC)和 8-
氨 基 萘 基-1,3,6-三 磺 酸 盐 (8-aminonaphthalene-
1,3,6-trisulfonate,ANTS)2种。
大多数 AMAC衍生物可以在 100mMNa2B2O7,
pH10.5的毛细管缓冲液进行分离,当单糖浓度在
5~25μM范围内的时候,该方法可以得到很好的定
量结果[17]。Xia等[23]在 300mMH3BO3,pH10.5为毛细
管电泳缓冲液的条件下,成功对酸性单糖 AMAC衍
生物(主要是唾液酸)进行了分离。对于 ANTS衍生
物,在酸性缓冲液中,由于毛细管内电渗流很弱,而
ANTS衍生物带近 3个负电荷,导致其电迁移率远
大于电渗流且方向相反,所以,需施加负极性电压
并且使检测器在阳极一侧。在碱性缓冲液中,电渗
流速度很快,则需要把检测器放到阴极一端,而出
峰的顺序与在酸性缓冲液中相反[17]。
毛细管的长度、进样方法、电泳电压和试验温
度等条件均会对结果产生影响,但相对较小,主要
只对分辨率有所影响。由于糖蛋白结构非常复杂,
包括糖基化位点数量和位置的不同、含糖量的多
少、有无唾液酸等等问题,所以很难有一种对于所
有糖蛋白都适用的分离模式。因此,需要根据所要
分析的糖蛋白的特性,优化最佳的、最稳定的、最易
于操作的分离条件。
3 展望
随着蛋白质组学的发展,毛细管电泳作为一种
新的制控分析手段越来越受到重视。利用毛细管电
泳可以较为容易的区分磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸,
特别是当使用荧光检测器的时候,可以显著提高其
分析磷酸氨基酸的灵敏度[24]。利用毛细管电泳可以
分析糖蛋白糖型、单糖和寡糖序列组成,在一定条
件下甚至可以对糖蛋白结构具识别能力。近年来,
Suzuki等[25]报道的微芯片毛细管电泳技术,有望成
为快速、高通量、高自动化的分离分析方法。在结合
质谱为其检测器后,可以增强其分析能力,获得更
多的样品信息[26]。随着毛细管电泳技术的发展,各
种操作模式的日益优化完善,必将在大规模高通量
的蛋白质翻译后修饰研究中得到越来越广泛的应
用。
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了耐草甘膦的转基因玉米,所以 2mG2-epsps基因在转基因玉米研究中是有效的筛选标记基因。
以草甘膦抗性基因 2mG2-epsps为选择标记基因,转化玉米的转化率为 45%,高于谢龙旭等[11]以 aroA-
M12基因作为选择标记基因在烟草上得到的 27%的转化率,低于 Howe等[8]获得的 100%的转化率。除了与
所选用的基因不同有关外,与筛选时间短也有关系。所以可以考虑适当加长筛选时间来提高转化率。另外,
耐草甘膦基因转化植株可以用高浓度的草甘膦喷洒,假阳性会黄化并慢慢死亡,这样可以在早期鉴定真正
的转化体,对后期的分子检测提供了阳性率较高的抗性群体。试验中所用草甘膦筛选浓度为 1mM,这一剂
量高于中山大学在烟草[11]、棉花[12]及油菜[13]的遗传转化中所用的 0.03~0.08mM的剂量,但比国外在转基因
小麦[9,10]及玉米[8,14,15]等的筛选中所用的草甘膦浓度要低,说明对不同的耐草甘膦基因及受体材料而言,以
草甘膦作为筛选剂的适宜剂量是不同的,需要通过预试验来确定。
将具有自主知识产权的耐草甘膦基因 2mG2-epsps与抗虫基因 Btcry1Ah构建到同一载体上,将 2个
基因转入玉米,成功获得了耐草甘膦抗虫的转基因玉米(另文发表),建立了一个以草甘膦为筛选剂,
2mG2-epsps基因为筛选标记基因的新型的筛选体系。所以 2mG2-epsps基因既可以用于耐草甘膦转基因玉
米的研究开发,也为抗虫、抗病及营养改良等转基因玉米研究提供安全有效的筛选标记基因,对提高玉米
及其他单子叶植物转化水平具有重要意义。
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