全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
大苞萱草 ISSRPCR反应体系的
建立与优化
沈鹏 董丽
(北京林业大学园林学院,北京 100083 )
摘 要: 分别采用正交设计和单因子试验两种方法对影响大苞萱草 ISSRPCR反应体系的 4个因素 ( Taq酶, M g2+ ,
dNTP, 引物 ) 在 3个水平上进行优化试验。正交设计选用 L9 ( 34 )方案, 采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平。单因子
试验分别研究各因素对 ISSRPCR反应的影响情况,找出最佳反应水平。两种方法所得影响因素最佳水平存在差异, 通过综
合比较与分析,最终建立了大苞萱草 ISSRPCR的最佳反应体系。在 20 L的反应体系中: Taq酶 1 U, Mg2+ 1. 5 mm o l/L, dNTP
0. 20 mm ol/L, 引物 0. 4m ol/L , 1 PCR buffe r, 30 ng模板 DNA。在此基础上筛选出 10个扩增稳定、多态性丰富的 ISSR引
物, 并通过梯度 PCR试验,确定引物最佳退火温度。
关键词: 大苞萱草 ISSRPCR 正交设计 单因子试验
Establishment and Optim ization of ISSR PCR Reaction System
forHemerocallism iddendorf ii
Shen Peng Dong L i
(Beijing Forestry University Forestry Institute, Beijing 100083)
Abstrac:t There are tw om ethods to op tim ize ISSRPCR am plifica tion system, includ ing orthogonal design and sing le factor test. In
this study, tw om ethods w ere used to optim ize ISSRPCR amp lification system onH emerocallism iddendorf ii in three lev els of four factors
( Taq DNA po lym erase, M g2+ , dNTP, prim er), respectively. F rom the resu lts, w e found tha t there w ere som e differences betw een two
m ethods in su itab le leve ls o f factors. By deep ana ly ze, a su itab le ISSRPCR reaction system w as estab lished. 20L reac tion system con
ta ins 1. 0 U Taq DNA polym erase, 1. 5 mmo l/LM g2+ , 0. 20 mm ol/L dNTP, 0. 4 m o l/L prim er, 1 PCR buffer, 30 ng DNA tem plate.
10 prim ers w ith stable am plification and rich polym orph ism for ISSR we re screened. The optim a l annealing temperature fo r ISSRPCR
reaction w as propo sed by grad ient PCR. The resu lt prov ided a standard izing ISSRPCR program fo r the analysis of genetic d iversity ofH.
m iddendorfii.
Key words: H emero callism iddendorf ii ISSRPCR Orthogonal des ign S ingle factor test
收稿日期: 20090114
基金项目:国家林业局 ! 948∀项目 [ 2002- 08 ( 2) ]
作者简介:沈鹏,男,在读硕士,研究方向:园林植物种质资源; Em ai:l b ird1985@ 163. com
通讯作者:董丽,教授, Em ai:l Dongleah@ yahoo. com
萱草 (H em erocalli spp. )为我国的传统名花, 是
优良的地被绿化及庭院观赏植物, 素有 !中国母亲
花 ∀之称。中国是世界萱草的起源中心, 也是萱草
属植物的分布中心。大苞萱草 (H em erocallism idden
dorf ii Trau.t et M ey. )是现代萱草的原始亲本之
一 [ 1, 2] ,集药用、食用和较高的观赏价值。目前, 关
于大苞萱草的研究主要集中在引种栽培、细胞生物
学等方面 [ 3, 4] , 针对其居群遗传多样性的研究尚属
空白。
ISSR ( intersimp le sequence repeat)又称简单序
列重复区间扩增, 是近年来在微卫星技术上发展
起来的一种新型分子标记技术, 具有多态性高, 稳
定性好, 不需预知基因序列, 检测快速, 产物特异
性强, DNA用量少, 技术要求低, 技术成本低等特
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
点, 现已在物种的遗传多样性、物种形成和种质鉴
定等研究领域得到了广泛应用 [ 5, 6 ]。不足之处在
于稳定性易受到 Taq酶、Mg2 +、引物、退火温度等
多个因素的影响, 在利用 ISSR技术进行遗传多样
性分析时, 为保证结果的清晰、可靠和准确, 必须
对反应体系进行优化。目前, 对 ISSRPCR反应体
系进行优化主要采用单因子试验和正交设计两种
方法。单因子试验是指分别研究影响因素对 IS
SRPCR反应的影响情况, 找出各自的合适条件,
通过各因素的组合建立 ISSRPCR反应的最优体
系, 目前, 此方法已被广泛应用于 PCR反应体系的
优化中 [ 7, 8 ]。何正文等 [ 9 ]首次将试验统计学上的
正交设计应用到 PCR反应体系优化中。此后陈亮
明等、穆立蔷等 [ 6, 10 ]也采用正交设计分别对广玉
兰和紫椴 ISSRPCR反应体系进行了优化, 确立了
较为可靠的反应体系。此方法能综合考查各因素
及其交互作用并快速找到影响因素的最佳水平
组合。
朱云华 [ 11]和黎海利 [ 1 2]曾对萱草属部分野生种
和园艺品种进行过 ISSRPCR反应体系优化, 其筛
选的引物和反应体系无法对大苞萱草基因片段进行
有效的扩增。本研究采用两种方法对影响大苞萱草
ISSRPCR反应体系的 4个主要因素 (Taq酶用量、
M g
2 +浓度、dNTP浓度、引物浓度 )在 3个水平上进
行优化试验,通过对两种试验方法的综合比较与分
析,选取最佳因素水平, 建立大苞萱草 ISSRPCR最
佳反应体系,并为今后 PCR反应体系优化方法的选
择提供必要参考。同时,根据最佳体系筛选出 10个
扩增稳定、多态性丰富的 ISSR引物, 通过梯度 PCR
确定引物的最佳退火温度。最后, 对扩增反应的延
伸时间以及循环次数进行优化,得到了大苞萱草 IS
SRPCR反应的最佳扩增程序, 为今后大苞萱草地
理种源的群体遗传多样性研究及系统保护提供分子
水平上的借鉴与参考。
1 材料与方法
11 材料
2009年 6月初采集辽宁省本溪市桓仁县, 吉林
省通化市、吉林市红叶谷、长白山国家自然保护区 4
个地区的大苞萱草, 样本个体间距大于 50 m, 新鲜
叶片经硅胶干燥后,保存于 4# 。
12 主要试剂及仪器
DNA提取试剂盒购自天根生物公司; 用于 IS
SRPCR反应的 dNTP、Taq酶、Mg2 +、分子量标准
DL 2000购自全式金公司; 引物由北京奥科生物公
司合成。 PCR反应在美国伯乐公司的 PTC200型
PCR循环仪上进行。
13 方法
131 大苞萱草 DNA的提取 采用 T INGEN试剂
盒提取大苞萱草 DNA, 方法按照说明书进行。
132 ISSRPCR反应因素水平的确定与正交表
的设计 针对影响 PCR 反应的 Taq 酶、Mg2+、
dNTP、引物 4个因素, 选用 L9 ( 34 )正交表在 3个
水平上试验。引物为 U825, L9 ( 34 ) 正交设计方
案见表 1。
表 1 PCR正交试验设计表
编号
影响因素
T aq酶
(U )
M g2+
(mmo l/L )
dNTP
(mmo l/L)
引物
( mm ol/L)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
05
05
05
10
10
10
15
15
15
10
15
20
10
15
20
10
15
20
010
015
020
015
020
010
020
010
015
02
03
04
04
02
03
03
04
02
反应体系总体积为 20 L。反应条件参考萱草
ISSRPCR 最佳反应程序 [ 12 ] : 94# 预变性 5m in;
94# 变性 45 s, 54# 退火 1 m in, 72# 延伸 2m in, 循
环 40次; 72# 延伸 7 m in , 4# 保存。PCR产物用
20%琼脂糖凝胶电泳检测。对结果进行直观分析,
确定大苞萱草 ISSRPCR 反应各影响因素的最佳
水平。
133 单因子试验 根据影响 ISSR PCR反应体
系的 4个因素, 每个因素水平做 4个梯度试验。
ISSRPCR反应体系及扩增程序与正交试验相
同。对结果进行直观评价, 并与正交试验结果进
行比对, 建立大苞萱草 ISSRPCR 反应的最佳
体系。
130
2010年第 8期 沈鹏等:大苞萱草 ISSRPCR反应体系的建立与优化
134 引物筛选 从 100个引物中在优化好的反
应体系中进行扩增筛选。
135 退火温度的确定 根据所选引物序列计算
理论退火温度 Tm, Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A +
T)
[ 13 ]
,设定退火梯度 ( Tm ∃ 6) # , 仪器自动形成
1- 12个梯度, 确定最佳退火温度。
2 结果与分析
21 PCR正交设计直观分析
根据 L9 ( 34 ) 正交试验 PCR产物电泳结果 (图
1) ,按照遗传多样性分析要求,对 PCR扩增结果从
高到低依次打分。条带数量丰富、清晰度高的最佳
产物记为 9分,与此相反, 最差的记为 1分。 9个组
合的分数依次为 1、2、8、3、9、5、6、7、4。根据
分数求出每个因素同一水平下的试验值之和 k i以
及每一因素水平下的数据平均值 k,i并求出同一因
素不同水平间平均值的极差 R (表 3)。
极差 R反映了影响因素对反应体系的影响情
况, R 越大,影响越显著。由表 3可知各因素水平的
变化对大苞萱草 PCR反应的影响从大到小依次为
dNTP、Mg2 +、Taq酶、引物。
每一因素水平下的数据平均值 k i反映了影响
因素各水平对反应体系的影响情况, k i值越大, 反
应水平越好。由表 3可知 ISSRPCR反应中 4个影
响因素的最佳反应水平: Taq酶 10 U, M g2+ 15
mmo l /L, dNTP 02 mmo l/L, 引物 04 mol/L 。 4
个因素的最佳水平组合并没有在正交表中出现,但
与分值最高的 5号组合接近, 仅引物的用量不同。
因此, 在使用正交设计进行反应体系优化时,可根据
电泳结果直接选择,不经过直观分析,也能够得到较
好的反应体系。
1- 9.处理编号同表; M.标准分子量 DL 2000
图 1 正交试验 PCR产物电泳结果
表 2 正交设计直观分析
结果
影响因素
Taq酶 M g2+ dNTP 引物
K1
K2
K3
k1
k2
k3
R
11
17
17
11 /3
17 /3
17 /3
2
10
18
17
10 /3
6
17 /3
8 /3
13
9
23
13 /3
3
23 /3
14 /3
14
13
18
14 /3
13 /3
6
5 /3
22 单因子试验结果分析
221 Taq酶用量对 ISSRPCR的影响 Taq 酶
的用量是影响 PCR的一个重要因素, 浓度过低不
能扩增, 浓度太高产生非特异性扩增。本试验从
05U、10U、15U、2U 4个水平分别进行扩增
(图 2) , 发现 4个 Taq酶用量所得到的扩增结果
不一致。当 Taq酶用量为 10U时, 扩增条带明显
好于其它水平, 这与正交试验中 Taq 酶的最佳水
平相一致。
222 Mg2+浓度对 ISSRPCR的影响 Mg2+ 浓度
是影响 PCR结果的重要因素之一, M g2+ 不仅影响
Taq酶活性, 还能与反应液中的 dNTP、引物及模板
相结合,影响引物与模板的结合效率、产物特异性及
引物二聚体的形成 [ 1 4 ]。从图 2中可以看出, M g2+
浓度在 20、25 mmo l/L 2个水平间扩增无显著差
异, 同时正交试验结果表明, M g2+浓度在 15和 20
mmo l/L时对 PCR反应结果影响基本一致, 因此选
择 20 mmo l/L作为 ISSRPCR反应体系中 Mg2+的
最佳浓度。
223 dNTP浓度对 ISSRPCR的影响 dNTP 是
PCR的原料, 浓度过高会产生错误掺入, 浓度太低
导致产率下降。从图 2中可以看出, dNTP浓度为
010 mmo l/L时扩增条带弱; 浓度为 020 mmo l/L
时条带清晰,多态性好, 为反应最优水平。这与正交
试验中 dNTP的最佳浓度相吻合。当 dNTP浓度为
025 mmo l/L 时, 出现非特异性条带。因此选择
020mmol /L作为 ISSRPCR反应体系中 dNTP的最
佳浓度。
224 引物浓度对 ISSRPCR的影响 引物浓度
131
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
关系到扩增产物的质量, 浓度偏高会引起错配和非
特异性产物扩增, 增加引物二聚体的形成几率。浓
度太低则无法进行有效扩增。从图 2中可以看出在
各引物浓度下,都能扩增出一致的条带,随着引物浓
度的升高, 扩增条带由弱到强。当浓度为 04、
05 mo l/L时,反应稳定,条带清晰。在正交试验中
引物的最佳浓度为 04 mo l/L。因引物浓度为
04、05 mo l/L时, 扩增效果无显著差别,所以选
择 04 mo l/L作为 ISSRPCR反应体系中引物的最
佳浓度。
1- 4.引物浓度分别为 02, 03, 04, 05 mol /L; 5 - 8.
dNTP浓度分别为 010, 015, 020, 025 mm ol /L; 9 -
12. M g2+浓度分别为 10, 15, 20, 25 mm ol /L; 13 -
16. Taq酶浓度分别为 05, 10, 15, 2U; M.标准分子量
DL 2000
图 2 不同水平引物、dNTP、M g2+及 Taq酶的
ISSRPCR电泳结果
综上所述, 大苞萱草 ISSRPCR反应的最佳体
系:反应体系总体积为 20 L, 94# 预变性 5 m in,
94# 变性 45 s, 54# 退火 1 m in, 72# 延伸 2 m in,循
环 40次, 72# 延伸 7 m in。Taq 酶 10 U, M g2+
20mmo l /L, dNTP 020 mmo l/L, 引物 04 mo l/L,
1 PCR buffer, 30 ng模板 DNA。用其对大苞萱草
群体的模板 DNA进行扩增, 取得了较好的扩增效果
(图 3)。
图 3 ISSRPCR最佳反应体系扩增结果
23 引物筛选及退火温度的确定
本试验根据大苞萱草 ISSRPCR反应的最佳体
系,从 100个 ISSR引物中筛选出 10个扩增稳定、重
复性强的引物用于 PCR扩增;再针对筛选出的引物
逐个进行梯度退火试验, 确定引物的最佳退火温度
(表 3)。图 4为引物 U860的梯度退火 PCR,从图 4
可以看出,退火温度过低,扩增特异性差,背景深;退
火温度过高,引物与模板结合差,电泳条带弱, 甚至
没有扩增。对其他引物进行梯度 PCR,也得到同样
结果。在选择最佳退火温度时,如扩增结果相近,宜
选择较高退火温度,以提高反应的特异性。
表 3 大苞萱草 ISSR引物序列及退火温度
引物 序列 Tm ( # )
UBC809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 550
UBC815
UBC818
CTCTCTCTCTCTCTCTG
CACACACACACACACAAG
550
52. 2
UBC821
UBC825
UBC834
CACACACACACACACAAT
ACACACACACACACACT
AGAGAGAGAGAGAGAYT
501
539
539
UBC855
UBC860
ACACACACACACACACYT
TGTGTGTGTGTGTGTGRA
501
522
UBC864 AGCAGCAGCAGCAGC 55
UBC890 VHVGTGTGTGTGTGTGT 550
Y= ( C, T) R= ( A, G ) V = (A, C, G ) H= ( A, C, T )
1- 12. 退火温度依次为 45, 45. 3, 46. 1, 47. 0, 48. 4,
501, 52. 2, 53. 9, 55. 0, 56. 1, 56. 8, 57. 0#
图 4 引物梯度退火电泳图
24 延伸时间对 ISSRPCR的影响
在 ISSRPCR反应中延伸温度一般为 72# , 除了
退火温度外,延伸时间是另外一个重要的影响因素。
时间过短,无法完成扩增,产量低;时间过长, 会产生
非特异扩增。本试验进行了 45 s、1 m in、15m in和 2
m in 4种尝试,发现在 2m in时,获得了稳定扩增。因
132
2010年第 8期 沈鹏等:大苞萱草 ISSRPCR反应体系的建立与优化
此,在本研究中采用 2 m in的延伸时间。
25 循环次数对 ISSRPCR的影响
选择适宜的循环次数将会获得良好的扩增图
谱。从理论上说, 循环次数越多, 扩增产物产率越
高,但实际上会受到各反应成分的用量限制。在原
来的反应程序的基础上,其它条件不变,分别试验了
30、35、40、45个循环对扩增结果的影响。发现随着
循环次数的增加,扩增产物的量也增多, 相比之下,
40个循环得到的条带强弱合适, 清晰可辨, 为最佳
循环次数。
3 讨论
在影响 ISSRPCR扩增结果的因素中, 酶是最
关键的影响因素, 直接影响扩增的成功与否。使用
高浓度的 Taq酶不仅增加试验成本, 而且极易产生
非特异性扩增产物; 浓度过低则会导致产物的合成
效率下降, 因此应选择合适的酶用量。同时 Taq
DNA聚合酶是 Mg2+依赖性酶, 对 Mg2+浓度非常敏
感, 选择最适合酶活性的 Mg2+ 浓度至关重要。
dNTP分子中的磷酸基团能定量地与 Mg2+结合,使
游离的 Mg2+ 浓度降低, 因此需要通过试验确定
M g
2 +浓度与 dNTP浓度之间的最佳比例以确保得到
清晰的图谱。对于引物, 浓度偏高会引起错配和非
特异性产物扩增,增加引物二聚体的形成几率,浓度
过低则会导致无法扩增。此外, ISSRPCR对模板的
要求并不严格, 本研究采用的模板浓度为 30 ng /L
能取得良好的扩增效果。
ISSR的引物较长,通常在 16- 25 bp, PCR扩增
需要较高的退火温度,本研究所采用的引物,最低退
火温度为 50# ,最高为 55# ,均高于相应引物的 Tm
值,这种高温度条件下的扩增大大降低了非特异性
扩增的概率,保证了扩增结果的可重复性。
本研究针对目前常见的两种 ISSRPCR试验方
法进行反应体系优化,两种方法所得到的因素最佳
水平不完全相同。这既与 PCR反应的不稳定性有
关, 也与正交设计采用的主观打分有关。因此,如果
能对 PCR扩增结果建立客观的评价标准, 将会更好
地促进该方法的应用。
参 考 文 献
[ 1] Corliss PG. Cu lt ivars ofD aylilies. Th e Am ericanH orticu lturalM aga
zin e, 1968: 152163.
[ 2 ] H u SY. The species ofH em eroca llis. Th e Am erican H orticu ltural
M agzin e, 1968: 86111.
[ 3] 熊治延.北萱草与大苞萱草区分为不同物种的核型证据.植物分
类学报, 1998, 36( 1 ): 5357.
[ 4] 熊治延,陈心启,洪德元.国产萱草属夜间开花类群的分类研究.
植物分类学报, 1996, 34 ( 6) : 586591.
[ 5] B arth S, M eich inger AE, Lubberstedt T. G enetic d iversity inA rabi
dopsis tha liana L. H eynh. inves tigated by cleaved am pl if ied polym or
ph ic sequence ( CAP ) and in tersim p le sequence repeat ( ISSR )
m arkers. M olecu lar E cology, 2002, 11: 494505.
[ 6] 穆立蔷,刘赢男,冯富娟,等. 紫椴 ISSRPCR反应体系的建立与
优化.林业科学, 2006, 6 ( 42) : 2731.
[ 7] 赵杨,陈晓阳,李桐森,等.胡枝子属 ISSRPCR反应体系的建立
与优化.西南林学院学报, 2006, 26 ( 2) : 6 23.
[ 8] 邢建宏,陈存及,张国防,等.樟树 ISSRPCR反应体系优化研究.
福建林业科技, 2006, 33 ( 3) : 96100.
[ 9] 何正文,刘运生,陈立华,等. 正交设计直观分析法优化 PCR条
件.湖南医科大学学报, 1998, 23 ( 4) : 403404.
[ 10] 陈亮明,相阳,张冬林,等.两种方法对广玉兰 ISSRPCR反应体
系的优化比较.种子, 2008, 6( 27 ) : 1014.
[ 11] 朱云华,朱生树,苏倩,等.萱草属植物 ISSRPCR反应体系的优
化.林业科技开发, 2007, 21( 4 ) : 4548.
[ 12] 黎海利,董丽,谭飞理,等. 萱草 ISSRPCR最佳反应体系的建
立.安徽农业科学, 2008, 36( 12 ) : 48844885.
[ 13] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术 (第 2版 ) [ M ] .北京:中国
协和医科大学出版社, 1999: 5758.
[ 14] 席嘉宾,郑玉忠,杨中艺.地毯草 ISSR反应体系的建立与优化.
中山大学学报:自然科学版, 2004, 43( 3 ): 8084.
133