全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
野生黄花苜蓿冷诱导基因克隆及序列分析
刘亚玲1, 2 王俊杰 1, 2 云锦凤 1, 2 赵彦1, 3 石凤敏 1, 2
( 1内蒙古农业大学生态环境学院,呼和浩特 010019; 2内蒙古草品种育繁工程技术中心,呼和浩特 010019;
3内蒙古农牧业科学院, 呼和浩特 010031 )
摘 要: 根据紫花苜蓿抗寒基因 cas15B (登录号: L12462) 的 cDNA序列,设计 1对特异引物, 以经过低温胁迫的黄花
苜蓿总 RNA为模板,采用 RTPCR方法克隆获得了 550 bp的 cDNA片段。测序和序列分析结果表明, 扩增片段长度为 550
bp, 编码 159个氨基酸。主要由 Gly (甘氨酸 )、G lu(谷氨酸 )、H is(组氨酸 )、Lys(赖氨酸 )这 4种氨基酸组成, 占总量的 70%。
含 1个重复了 5次的 10肽基序, 其序列为 LysGlyG luG lnH isG lyH is( Phe) V al( Leu ) G lyG ly。经序列比较分析,该片段与
紫花苜蓿冷诱导基因 CAS15B的核苷酸、氨基酸的同源性均为 90% ,命名为 M f CAS151。亚细胞结构定位分析结果显示, M f
CAS151是一种定向到核的蛋白 ,在调节或维持核的结构与功能方面起作用。本研究在黄花苜蓿中成功获得了抗寒基因同源
序列, 为最终克隆黄花苜蓿 M f CAS151抗寒基因全长奠定了基础。
关键词: 黄花苜蓿 冷诱导基因 克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Cold Resistance Gene
fromW ildMed icago falcata
L iu Yaling
1, 2
W ang Junjie
1, 2
Yun J infeng
1, 2
Zhao Yan
1, 3
Sh iFengm in
1, 2
(
1
College of Ecology and Environmental Science, InnerM ongolia Agricultural University,H uhhot 010019;
2
InnerM ongo lia Engineering and Technique Center for Forage B reeding and Reproduction, H uhhot 010019;
3
InnerM ongolia A cademy of Agriculture and AnimalH usbandry Sciences,H uhhot 010031)
Abstrac:t According to cDNA sequence of cas15B ( Accession number: L12462) ofM edicago sativa, a pa ir of specific prim ers
w ere designed, by wh ich a new cDNA fragm ent o f 550 bp w as am plified by RTPCR from to tal RNA o fM ed icago falcate that suffe red
from co ld stress. Sequenc ing result and sequence ana lysis show ed that this am plified fragm ent encoded 159 am ino ac ids, four o f wh ich
w ereG ly, G lu, H is and Lys, accounting fo r 70% pred ic ted. The po lypeptide conta ins a decapeptide m otif repeated five tim es a t regu lar
interva ls w ith the fo llow ing consensus sequence LysGlyG luG lnH isG lyH is( Phe) V al( Leu) G lyG ly. The am plified fragm en t wh ich
o f the homo logy of nucleotide sequences and deduced am ino ac ids sequences w ere bo th 90% w ith the co ldinduced gene cas15B of
M ed icago sativa, w as nam ed as M f CAS151, and the encoded prote in w as directed to the nuc lear due to the subce llu lar location ana ly
sis. M f CAS151 m ay play an im portant ro les in gene regu la tion and the stab ilization of nuc lear structure and function in the pro cess of
co ld acc lim ation. In th is study, homo logous sequences of co ld resistance gene w ere rece ived fromM edicago falcata, wh ich cou ld prov ide
the foundation fo r clon ing the full leng th of co ld resistance gene(Mf CAS151 ) o fM edicago falcata.
Key words: M ed icago falca ta Co ld resistance gene C lone Sequence ana ly sis
收稿日期: 20091214
基金项目:国家科技支撑项目 ( 2008BADB3B0603 ) ,国家自然科学基金项目 ( 30760159) ,内蒙古农业大学博士科研启动基金项目 ( B J087 )
作者简介:刘亚玲,女,硕士研究生,研究方向:牧草种质资源与遗传育种; Em ai:l liuyal ing0719@ 163. com
通讯作者:王俊杰,男,教授,硕士生导师,研究方向:牧草种质资源与遗传育种; Em ai:l jjw62@ 163. com
黄花苜蓿 (M edicago falcata L. )是豆科苜蓿属
多年生草本植物,又称野苜蓿、镰荚苜蓿, 在亚洲和
欧洲都有较广泛的分布。黄花苜蓿草质优良, 营养
价值与紫花苜蓿接近,适口性好, 但其抗性是紫花苜
蓿不可比拟的, 尤其是抗寒性 [ 1- 3]。M cKenzie等 [ 4]
的研究显示,黄花苜蓿的抗冻能力要比相同生长时
2010年第 4期 刘亚玲等: 野生黄花苜蓿冷诱导基因克隆及序列分析
期的紫花苜蓿强。基于黄花苜蓿的各种优良特性,
国内外学者都把黄花苜蓿作为苜蓿遗传改良和新品
种选育的重要基因源。
随着分子生物学的发展,人们对植物抗寒分子
机理的认识不断加深, 国内外对苜蓿抗寒性的研究
颇受关注。国外对苜蓿抗寒分子机理的研究比较
早, M ckersie[ 5] 用根癌农杆菌介导, 把烟草的 Mn
SOD DNA导入到苜蓿中,结果转基因的植株冻害的
抗性增强; Sam is [ 6]发现,导入 MnSOD基因的紫花
苜蓿, 膜稳定性增大, 同时还使植物的生物量得到增
加。 Ivashuta等 [ 7]利用 RAPD技术检测了 4株苜蓿,
其中两株是对冻害敏感的品种 Moapa69, 另外两株
是抗寒性强的苜蓿品种 Ramb ler, 在 4株苜蓿中检测
到高水平的多态性和影响苜蓿耐冻性和秋眠性的数
量性状位点。大量研究已证实,低温锻炼可以诱发
许多抗冻基因的表达和抗寒特异性蛋白质的新合成。
现已克隆了苜蓿 CAS15A、CAS15B、CAS17、CAS18等
CAS基因家族成员 [ 8- 11]。 Castonguay等 [ 12 ]从苜蓿
中分离到了第一个编码富含脯氨酸低温诱导蛋白的
基因 msaC IC。我国对苜蓿抗寒性分子机理的研究
起步较晚,马春平等 [ 13]根据 G enB ank登陆的紫花苜
蓿,抗寒基因 cas18 ( L07516) 的 mRNA序列设计引
物,克隆了 7个不同品种的紫花苜蓿的 cas18抗寒
基因,结果表明, 紫花苜蓿中 cas18基因的表达量
在 7个品种间存在显著的差异, 肇东苜蓿、龙牧
801苜蓿和敖汉苜蓿最高。蔡烔亮等 [ 14 ]利用抑制
性消减技术分析了黄花苜蓿相应低温的基因表达
模式,构建了含有 2 016个克隆的低温上调基因的
cDNA文库和含 192个克隆的低温下调基因的 cD
NA文库。通过对基因文库的筛选,在调文库中获得
了 87个单一序列。克隆了 M fEREBP等 18个基因
的 cDNA全长, 获得了 MFM IPS、M ISAM、MFEREBP
等 3个基因的转基因烟草植物。初步试验结果表
明, 过量表达 M fEREBP基因的转基因烟草 T1代植
株提高了抗旱, 抗盐性。由此可见, 利用基因工程
手段解决苜蓿抗寒性问题已成为国内外研究的
热点。
本研究以内蒙古寒冷草原区 呼伦贝尔草原
的野生黄花苜蓿为材料,克隆其抗寒相关基因,为研
究黄花苜蓿抗寒分子机理和探索苜蓿抗寒性遗传改
良奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 供试材料及处理
供试材料黄花苜蓿 (M edicago falcata L. )种子
于 2008年在呼伦贝尔草原野外采收, 2009年于内
蒙古农业大学温室育苗,将 28- 35 d苗龄的植株放
在 - 20 冰箱 48 h取茎段提取总 RNA。
1. 2 引物的设计及合成
根据 G enB ank 登陆的紫花苜蓿抗寒基因
cas15B ( L12462)的保守氨基酸序列, 参考国内外资
料报道的引物设计原则, 运用 DNAman软件辅助分
析设计 1对特异引物。设计的引物如下:
CAS15BL: 5CAAGATTGGTGATGCCCTTCA3
CAS15BR: 5ACATAGGAGATTGCCGTCGC3
1. 3 总 RNA的提取及 cDNA的合成
采用北京天为时代公司的总 RNA提取试剂 Tr
izo l(目录号: DP405) , 具体操作步骤参照说明书。
反转录反应参照北京天为时代公司 Quant Reverse
Transcriptase试剂盒要求进行反转录。
14 PCR扩增
以反转录所得 cDNA为模板进行 PCR扩增, 扩
增产物用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应
的 25 L反应体系包括: P rem ixTaq 12. 5 L, cDNA
模板 lL(约 30 ng), 左、右引物各 2 L,灭菌超纯
水补齐体积。反应程序: 94 预变性 4 m in; 94 变
性 1m in, 58 退火 1m in, 72 延伸 1m in 30 s, 35个
循环, 72 10 m in, 4 保存。制备凝胶时加入 5%
的核酸染料,成像仪上观察照相。
1. 5 RTPCR产物的回收、连接及连接产物转化
DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天为时
代公司, 具体操作参照说明书。连接试剂使用
pGM T克隆试剂盒,购自北京天为时代公司具体操
作按试剂盒说明书进行。连接产物转化至大肠杆菌
感受态细胞中, 37 培养 16 h,挑取单菌落于液体培
养基中培养,提取质粒送至上海生工生物技术服务
有限公司测序。
2 结果与分析
2. 1 RTPCR结果
以黄花苜蓿茎总 RNA (图 1 )为模板, 在 Gen
Bank中查找紫花苜蓿的 CAS15B基因序列,根据该
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
序列保守区设计特异引物, 经 PCR扩增, 获得大小
约为 500 bp特异条带 (图 2)。将该条带回收, 经过
连接、转化、培养, PCR检测 (图 3) ,将鉴定为阳性的
单克隆送至上海生工进行测序。
图 1 总 RNA凝胶电
泳 ( 0. 8% )结果
M. 100 bpM ark er; 1. PCR扩增产物
图 2 RT- PCR
M. 100 bpM arker; 1、2.阳性克隆 PCR扩增结果
图 3 阳性克隆的 PCR检测结果
22 序列分析
测序结果显示, 该序列长度为 550 bp。利用
NCBI中的 ORF F inder软件对该序列的开放阅读
框进行查找, 结果表明, 该序列编码 159个氨基酸
(图 4) , 利用 DNAm an软件分析氨基酸特征及组
份显示, 分子量 MW 为 7 0431, 等电点为 633。
在氨基酸组成中, G ly (甘氨酸 )占 281% , G lu(谷
氨酸 )占 125% , H is(组氨酸 )占 165%, Lys(赖
氨酸 )占 138% , 这 4种氨基酸含量较高, 约占总
量的 70%。含 1个重复了 5次的 10肽基序,其序列
为 LysG lyG luG lnH isG lyH is ( Phe ) Va l ( Leu )
G lyG ly。
图 4 ORF预测结果
2. 3 同源性比较
对测定结果在 NCB I的 G enB ank中进行 BLAST
分析 (图 5) , 发现它与紫花苜蓿克隆 PM SAC IB
CAS15( L12462)、紫花苜蓿冷诱导蛋白 CAR1、Bud
CAR6、BudCAR4 ( AF072932、AF220458、AF220456 )
基因同源性均为 90%。与紫花苜蓿 PACS2201
CAS15( L12461. 1) BudCAR4 ( AF220101. 1)基因同
源性均为 89%。由此推测该序列为 CAS家族成员,
将其命名为 M f CAS151。
图 5 同源性比较
2. 4 M f CAS151与已克隆的冷诱导蛋白的系统进
化树分析
利用 NCB I中的 BLAST软件和 DNAman软件,
对该片段与已知的 5种植物冷诱导基因在氨基酸水
平上进行聚类分析并绘制系统进化树 (图 7) 。结
果显示,冷诱导基因蛋白进化树明显的分为两个分
化群,双子叶植物和单子叶植物。而在双子叶植物
中 M f CAS151基因与紫花苜蓿各种冷诱导基因的
进化距离都非常近。
2. 5 CAS15亚细胞定位预测
蛋白质在细胞中的定位与蛋白质执行的功能密
切相关。用合适的工具预先对基因编码产物在细胞
中的定位做出预测, 将对其功能预测有所帮助, 然
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2010年第 4期 刘亚玲等: 野生黄花苜蓿冷诱导基因克隆及序列分析
图 7 CAS151与已克隆的低温诱导蛋白的进化树
而从试验的角度检测蛋白亚细胞定位比较困难。几
乎每个蛋白质在其结构中带有标明其细胞正确定位
的信息,细胞定位就是利用各种算法对这些特定信息
进行识别。由日本人类基因中心开发的 PSORT程序
联合了许多不同算法进行预测,预测结果比较全面,
成为最流行的细胞定序之一 [ 10]。对 M f CAS151进
行亚细胞定位分析, 结果表明, M f CAS151位于细
胞核的可能性最大,其次是微体 (过氧化物酶体 )。
表 1 M f CAS151亚细甩定位分析结果
定位 可能性 (% )
细胞核 70
微体 (过氧化物酶体 ) 64
线粒体基质 10
溶酶体 10
3 讨论
本研究从黄花苜蓿中克隆到了低温诱导基因
M f CAS151, 该基因在同源性和分子系统进化树分
析中都表现了高度的保守性和同源性, 人们通常都
是利用这些具有保守性且进化速率恒定的蛋白质或
其 DNA序列进行分子进化的研究。苜蓿的低温诱
导基因为苜蓿在分子水平的研究奠定了基础。
在 M f CAS151基因编码的的氨基酸组成中,
G ly (甘氨酸 )的含量比较高, 占总量的 28%, 而高
比例的 G ly含量可以使蛋白质具有高度柔性和流动
性,使蛋白分子具无规卷曲构型,可以在各个方向上
拉长、弯曲和伸展,由此来保护细胞结构免遭冰冻或
严重脱水的伤害,增强植物的抗寒能力 [ 15]。在序列
中含有 1个重复了 5次的 10肽基序, 其序列为 Lys
G lyG luG lnH isG lyH is ( Phe ) Va l ( Leu ) G lyG ly,
比紫花苜蓿 CAS15基因序列多重复了一次,这可能
是黄花苜蓿比紫花苜蓿更抗寒的原因之一。
对 M f CAS151基因编码的蛋白质亚细胞定位
分析表明,该基因定位在细胞核的可能性最大,推测
该基因在调节或维持细胞核的结构与功能方面起
作用。
低温是影响植物生长发育的主要逆境之一。在
低温胁迫下,植物体内会引发起一系列分子反应和
信号传递,诱导特异基因表达一些重要的功能蛋白
和调节蛋白以保护细胞不受低温胁迫伤害。近年
来, 迅速发展的分子生物学、分子遗传学为进行植物
抗寒性的遗传研究提供了有利的工具,使植物抗寒
性研究得到逐步深入。黄花苜蓿是我国北方草原的
优良牧草,具有许多紫花苜蓿不具备的优良特性,是
苜蓿抗性育种的重要基因库。采用分子生物学手段
研究黄花苜蓿低温胁迫的分子机理, 对于苜蓿抗性
育种具有十分重要的意义, 也是国内外苜蓿育种研
究领域的发展趋势。
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