全 文 ：植物学通报 2005, 22 (4): 456~462
Chinese Bulletin of Botany
①通讯作者。Author for correspondence. E-mail: 1-hongyan@163.com
收稿日期: 2004-03-24 接受日期: 2005-01-21 责任编辑: 崔郁英, 于昕
专 题 介 绍
核糖体失活蛋白研究进展
1李洪艳① 1王关林 2李建国 1李 红 1陈陆琴
1(辽宁师范大学生命科学学院 大连 116029) 2(大连高新技术产业园区 大连 116021)
摘要 核糖体失活蛋白是一类毒蛋白, 主要存在于植物当中, 在真菌和细菌中也有发现。 其共同特点是
具有N-糖苷酶活性, 能水解生物核糖体大亚基rRNA颈环结构上特定位点的腺嘌呤, 使核糖体失活, 从而
抑制了蛋白质合成。本文对核糖体失活蛋白的主要性质、应用以及国内外有关这类蛋白的研究进展加以
概述。
关键词 核糖体失活蛋白, N-糖苷酶, 蛋白合成
Advances in Studies of Ribosome-Inactivating Proteins
1LI Hong-Yan① 1WANG Guan-Lin 2LI Jian-Guo 1LI Hong 1CHEN Lu-Qin
1(College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116029)
2(High-Tech Zone of Dalian, Dalian 116021)
Abstract Ribosome-inactivating proteins (RIPs) are found in plants, certain fungi and bacteria. RIPs
are toxic N-glycosidases that depurinate the universally conserved a-sarcin loop of large rRNA. This
depurination inactivates the ribosome, thereby blocking its further participation in protein synthesis.
The properties, application and advances in research into RIPs are summarized in this paper.
Key words Ribosome-inactivating-proteins, N-glycosidases, Protein synthesis
1 核糖体失活蛋白的物理性质及
分类
核糖体失活蛋白(ribosome inactivating
proteins, RIPs)首先是在蓖麻(Ricinus communis)
中被发现的, 随后在其他植物及真菌和细菌中也
发现它的存在。科学家们还从蘑菇(Lyophy-
llum shimeji)(Lam and Ng, 2001)和藻类(Liu et al.,
2002)中分离出RIPs。到目前为止, 人们已在许
多植物中发现并命名了近百种RIPs, 在植物不
同组织、不同生理状态以及不同的外界环境
下 RIPs的含量和活性均有所不同。
根据 RIPs的物理特性可将其分为 3 类
(Nielsen and Boston, 2001): 1型、2型 和 3型
(图1), 其中1型只有一条多肽链, 如商陆抗病毒
蛋白(pokeweed activiral protein, PAP)。2型
RIPs有A和B两条链, 相互间以二硫键相连, A
链是催化活性链, B链具有糖结合活性, 相当于
凝集素, 可识别细胞表面的糖肽或糖脂受体末端
的D-半乳糖, 协同A链进入细胞, 如蓖麻毒蛋
4572005 李洪艳等: 核糖体失活蛋白研究进展
图 1 3种类型的RIPs的基本结构
Fig.1 Alignment of RIPs showing a comparison of primary structures (Nielsen and Boston, 2001)
白(ricin)。3型RIPs也只有一条多肽链, 合成时
以无活性的蛋白前体形式出现, 当活性位点氨基
酸中间的二硫键以及C-末端和N-末端的扩展
序列被水解掉以后, 3型 RIPs才具有活性。
3型RIPs较少, 目前仅在玉米(Zea mays)和
大麦(Hordeum vulgare )中发现它的存在, 而且
它与1型RIPs有相似性, 因此也可以按有无B
链将RIPs分为两类, 即1型和2型(Stirpe, 2004)。
2型RIPs的A链和1型RIPs一般由210~270个
氨基酸组成, 同源性为17%~75%。虽然RIPs的
一级结构同源性不大, 但空间结构十分相似,
RNA N- 糖苷酶活性位点的位置也很相似
(Monzigo and Collins, 1993)。
目前, 定点突变和系统缺失是研究氨基酸
与蛋白质活性关系的有效手段。Xu等(1998)在
E.coli中表达商陆抗病毒蛋白(pokeweed antivi-
ral protein, PAP)的研究中发现, N端前7~107个
氨基酸去除后, PAP被激活, 对E.coli有致死性,
但氨基酸缺失的个数超过123个后, PAP活性丧
失, 因此PAP与靶嘌呤结合的活性位点可能不
是原来所确定的Tyr94和Val95, 而是在123个
氨基酸以后。Hudak等(2004)用同样的方法发
现, PAP在系统缺失过程中, 当突变体对细胞的
毒性已经消失的时候, 却仍然可以使核糖体脱嘌
呤。在酵母体内, PAP的 Tyr-123突变体使酵
母核糖体脱嘌呤, 但所有的蛋白质均可以正常翻
译, 说明PAP对细胞的毒性不单是核糖体被脱
嘌呤的缘故, 还有其他方面因素的影响。He 和
Liu (2004)在辛纳毒蛋白(cinnamomin)的研究中
发现, N端前52个和C端前51个氨基酸的去除
使其丧失了从rRNA和超螺旋DNA上脱嘌呤的
能力。Garci-Ortega等(2002)将帚曲霉毒(a-
sarcin )的N端b发夹结构缺失后, 发现其只能
对裸露的rRNA有RNase的活力, 却没有了从完
整的核糖体上降解rRNA的能力, 说明b发夹结
构是a-sarcin和核糖体作用所必需的。Garcia-
Mayoral 等(2004)用核磁共振的方法测定 a-
sarcin缺失突变体Delta(7-22)的立体结构, 验证
蛋白质的外周环的天然构相对其活性的重要
性。这些实验结果说明RIPs与核糖体的作用,
以及它对细胞的毒性机理都是非常复杂的。
2 RIPs的酶学特性
RIPs的主要酶学性质是具有RNA N-糖苷
酶活力, 可特异地水解生物的核糖体大亚基
rRNA 3′端颈环结构的腺嘌呤残基, 干扰核糖体
与延伸因子的结合, 从而抑制靶细胞中蛋白质的
合成(Barbieri et al., 1993)。
RIPs与底物相互作用的敏感性有差异, 蓖
麻毒蛋白(ricin)与低聚寡核苷酸以及小麦核糖体
作用时所需的蛋白量分别比杀死哺乳动物细胞
所需的量高 104和 103倍; 从紫茉莉(Mirabilis
e x p a n s a )根中分离出的 R I P 对畸雌腐霉
(Pythium irregulare)敏感, 而对大豆腐霉
458 22(4)
(Pythium ultimum)不敏感; 从小麦(Triticum
aestivum)叶片和种子中分别分离出的RIPs, 它
们对植物核糖体敏感性不同。核糖体对 RIPs
的敏感性是一个动态过程, 对核糖体进行不同的
处理, 其对RIPs的敏感性也随着变化, 当叶片被
脱水处理36小时或经茉莉酮酸甲酯诱导24小
时后制备核糖体, 大麦中3型RIP可使其从多聚
核糖体水解成单核糖体, 而对用水浸泡过的叶片
组织所制备的核糖体无作用(Nie l sen and
Boston, 2001)。
分析敏感性差异的原因有两个: 1) RIPs起
作用需要的辅助成分不同。天花粉蛋白
(trichosanthin,TCS)需要Ca2+(Li et al., 1991), 多
花白树毒蛋白(gelonin)的作用受Mg2+和ATP
的影响; 另外 tRNA对RIPs的活性也有调控作
用, 不同的 RIPs需要不同的 tRNA来调控
(Nielsen and Boston, 2001)。2) 核糖体蛋白以
及它们所维持的核糖体的构象的差异。Hudak
等(1999)发现酵母核糖体中大亚基的L3蛋白是
PAP与酵母核糖体作用所必需的, L3蛋白基因的
突变可使PAP对酵母的毒性消失。Rajamohan
等(2001)发现PAP本身活性中心的裂口对其通
过 L3蛋白与核糖体结合是很重要的。
众多的实验表明, RIPs具有失活自身的核
糖体及杀死自身细胞的可能性, 因此在正常情况
下, 植物必然会采取措施防止这种自杀行为的发
生(Barbieri L et al., 1993): 1)核糖体对自身的RIPs
具有抗性。例如谷类的RIPs缺乏信号肽, 存在
于胞质溶胶中, 但它对宿主的核糖体几乎不起作
用。 2)以不具活性的核糖体失活蛋白前体形式
存在。如带有 C末端扩展序列的 TCS是无活
性的, 只有信号肽及扩展序列被切除之后才有活
性, 而在未到达相应的细胞储存器之前这种加工
不会发生(Nielsen and Boston, 2001)。
RIPs除了能作用于核糖体大亚基rRNA外,
研究发现, 一些 RIPs的作用底物还可以是
DNA、Poly(A)和mRNA等(Hudak et al., 2000;
Parikh et al., 2002)。一些 RIPs还可以脱鸟嘌
呤(Parikh et al., 2002)。目前对于RIPs N-糖苷
酶以外的活性, 如几丁质酶活性、RNase活性
及超氧化物歧化酶活性等还存在一些争论
(Girbes et al., 2004)。
3 RIPs的毒性
RIPs的毒性是人们所熟知的, 一般来说, 2
型 RIPs比 1型 RIPs的毒性高。原因可能是 1
型RIPs缺少B链, 进入细胞很难, 而 2型RIPs
的 B链可与细胞表面半乳糖残基结合, 便于A
链进入细胞。2型RIPs之间毒性大小也存在差
异, 这可能与 RIPs在细胞表面的受体多少、
RIPs与细胞表面的亲和力强弱及RIPs进入细
胞到达的目的地有关 (Stirpe, 2004)。
RIPs作用后的哺乳动物细胞均表现出细胞
凋亡的特征。蓖麻毒蛋白(ricin)和相思子毒蛋
白(abrin)可使兔子和荷兰猪的肝脏等实质性器
官受到损伤。1型RIPs剂量较高时也可以造成
肝脏坏死, 无毒的 2型 RIPs接骨木(Sambucus
nigra)毒蛋白(nigrin b)高剂量使用可以使小鼠消
化道紊乱。人服用 ricin后也会导致脾脏及淋
巴组织等的损伤和出血现象(Stirpe, 2004)。Ri-
cin的毒性之大, 又容易大量获得, 因此成为一种
很有潜力的生物武器, 与此同时ricin疫苗研究
工作也蓬勃展开(Olson et al., 2004; Smith et al.,
2004)。
过去, 人们认为RIPs引起的细胞凋亡是靶
细胞核糖体受到损伤, 进而抑制了蛋白合成的缘
故。Hu等(2001)发现细胞凋亡过程中有蛋白质
的合成。蓖麻毒蛋白(ricin)造成的细胞凋亡与
半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)、
丝氨酸蛋白酶等的参与密切相关 ( S t i r p e ,
2004)。相思子毒蛋白(abrin)诱导的细胞凋亡,
必须有caspase 3的存在, 同时线粒体膜出现潜
在的损伤, 并且产生活性氧。B细胞淋巴瘤-白
血病基因2(Bcl- 2)的过量表达可以阻碍这一凋
亡途径(Narayanan et al., 2004)。从众多的实验
结果看, 蛋白合成的抑制可能不是造成细胞凋亡
4592005 李洪艳等: 核糖体失活蛋白研究进展
的唯一原因, 只是细胞凋亡的一个触发物, 细胞
凋亡是 RIPs对细胞多方面影响的结果。
4 RIPs对病原体的抗性
RIPs对病毒有抗性。人们猜测RIPs作用
于被侵染的植物细胞的核糖体, 导致该细胞死
亡, 从而阻止病毒扩散, 为植物体提供一种防御
功能。也有实验证明 RIPs的抗病毒活性与脱
嘌呤作用是无关的, Tumer等(1997)将缺失突变
的PAP的基因转入烟草, 尽管突变的PAP丧失
了脱嘌呤的能力, 但转基因烟草仍然对马铃薯X
病毒有抗性。Hudak等(2000)发现PAP的一个
新活性, 它会使5′端有帽子结构的mRNA脱嘌
呤。用高浓度的PAP处理有帽子的mRNA时,
可以使其降解, 浓度较低时则可以使它多位点脱
嘌呤。PAP突变后, 丧失了脱嘌呤能力, 但仍
然能有选择性的抑制有帽子结构的mRNA的翻
译。这些发现让人们把 RIPs的抗病毒和失活
核糖体两个活性分开考虑, 并且形成了RIPs直
接作用病毒的理论。
人们利用RIPs抗病毒的特性, 对其是否能
成为人免疫缺陷病毒(HIV)的有效治剂作了大量
的研究。感染HIV的雄兔精子用PAP预处理,
然后人工受精, 研究后代的HIV感染情况, 实验表
明PAP是安全的、可以预防子代感染HIV的抗
病毒剂(D’Cruz and Uckun, 2001)。感染了HIV 的
病人服用TCS可以改善身体状况(Stirpe, 2004)。
可见RIPs有望在HIV的防治方面有所突破。
体外实验中, TCS及大麦和玉米的RIPs对
多数真菌有抵抗作用。RIPs对细菌有杀伤能
力, 从紫茉莉根中提出的1型RIP, 其毫克量水
平即能抑制几种土壤细菌的生长。RIPs对昆
虫的毒性也有差异, 这与昆虫的种类、昆虫的
宿主以及昆虫肠道分泌液对RIPs的水解能力有
关(Nielsen and Boston, 2001)。
5 RIPs在转基因植物中的研究
随着转基因技术的出现与发展, 基因的异
位表达成为研究基因功能、提高植物体抗性
的有效手段。
Logemann等(1992)将大麦RIP的cDNA导
入烟草, 获得能抗立枯菌(Rhizoctonia solani)的
重组植株。随后, 其他的RIPs也被相继的转入
植物中。Chen等(2002a)将接骨木中编码 2型
RIP(SNA-I′ )的cDNA转入烟草, 转基因烟草对
病毒产生抗性, 并且SNA-I′的表达不影响植株
的生长和育性, 表达没有使病程相关蛋白的表达
增加, 其抗病机制与 PAP是有差别的。Chen
等(2002b)从接骨木的果实中分离出果实特异性
复合2型RIP(SNA-If)基因, 该基因在烟草中能
够正确表达、加工和组装, 不改变烟草表型, 转
基因烟草对病毒没有抗性, 说明该复合物在体内
没有抗病毒的作用。Kim等(2003)将玉米的RIP
与水稻的几丁质酶基因联合转入水稻中, 转基因
水稻对立枯菌抗性增强。 Dowd等(2003)将玉米
的 R I P 转入烟草, 转基因烟草对玉米夜蛾
(Helicoverpa zea)的抗性增强。Krishnan等
(2002)将TCS基因转入烟草, 获得抗黄瓜花叶病
毒(cocumber mosaic virus, CMV)和烟草花叶病
毒(tobauo mosaic virus, TMV)的植株。Cho等
(2001)从石竹(Dianthus sinensis)中分离出的RIP,
在烟草中表达可致雄性不育。Zoubenko 等
(2000)将PAP的Gly-75突变, 由于突变体丧失了
与核糖体结合的能力, 所以在烟草中能够表达且
无毒性。转基因烟草对病毒和真菌有抗性, 表
达过程中没有引起酸性病程相关蛋白表达的提
高, 而伤诱导蛋白激酶、蛋白酶抑制因子Ⅱ被
诱导, 说明突变体激活了一个不依赖水杨酸的、
与胁迫有关的信号转导途径, 从而使植物获得对
病原体的抗性。Lodge等(1993)发现, PAP在
烟草中适当的表达保护了其受病毒的侵害, 高
水平表达对烟草本身有毒害, 这一现象在苇草
植物中也有发现(Stirpe, 2004)。
6 RIPs在医学上的应用
RIPs所具有的翻译抑制活性对受体细胞是
460 22(4)
有毒的, 因此在医学领域它被看作是一个非常有
潜力的具有选择性的细胞杀伤剂。科学家们
用各种方法将 RIPs与单克隆抗体、激素及细
胞因子等连接起来构成免疫毒素达到选择性杀
伤的目的。
免疫毒素在恶性肿瘤、病毒病等研究领
域应用十分广泛。从南瓜(Cucurbita mosch-
ata)种子中分离出的单链RIP被成功的制备成
免疫毒素, 可以选择性杀伤人的黑素瘤细胞(Xia
et al., 2004), saporin-S6、gelonin等制备成的
免疫毒素也被用于何杰金氏病、淋巴瘤、横
纹肌肉瘤、痉挛、疼痛、斜视、皮肤与滑
液炎症的治疗研究(Bolognesi et al., 2000; Ricci
et al., 2002; Polito et al., 2004; Stirpe, 2004)。
体外实验中免疫毒素效果较好, 在合适的
浓度下它可以清除掉靶细胞而对正常细胞无太
多损伤。癌细胞团块越小作用效果越好, 而且
与固体瘤相比, 它对血癌疗效更高(Pasqualucci
et al., 1995), 这说明免疫毒素与靶细胞相互接近
的效率影响作用效果。
7 结语
人们对RIPs虽然进行了多年的研究探索,
但仍然有很多问题没有确切的解释。例如, 1
型和3型RIPs缺乏B链, 它们是如何与靶细胞
膜结合从而进入靶细胞的呢？蓖麻毒蛋白(ricin)
有A和B两条链, 但有时进入靶细胞并不是通
过B链完成的, 而是A-链上的甘露糖寡糖与靶
细胞膜上的甘露糖受体结合, 从而进入细胞。
虽然多花白树毒蛋白(gelonin)是糖基化的, 肥皂
草素(saporin)是非糖基化的, 但在动物细胞的
实验中两者并没有表现出毒性与糖的存在有
明显相关性(Nielsen and Boston, 2001)。这
些说明 RIPs的作用或者说它的一个活性与
N-糖基化可能是无关的。RIPs具有多种酶
活性, 以及它对生物和非生物信号所做出的
动态反应, 促使我们去探索RIPs在生物体内
所扮演的角色。
如何提高RIPs在植物体中的表达活性, 如
何使转基因植物拥有产生RIPs的天然植物所具
有的自身保护机制, 如何克服 RIPs作为免疫毒
素所产生的血管渗漏综合征等副作用, 这些是在
应用中需要我们解决的问题。
随着新的科学方法的发明及应用, 我们对
RIPs会有更深的理解, RIPs在应用中存在的问题也
将有相应的解决对策, RIPs的应用潜力将更大。
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