全 文 ：植物学通报 2005, 22 (2): 163~168
Chinese Bulletin of Botany
①福建省科技厅重点项目(99-Z-193)和福建省教育厅项目(K04037)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: xielh@fjau.edu.cn
收稿日期：2003-10-16 接受日期：2004-06-28 责任编辑：白羽红
实 验 简 报
绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的 5个
cDNA及其下游非编码区①
林 毅 谢荔岩 陈国强 吴祖建 谢联辉② 林奇英
(福建农林大学植物病毒研究所，生物农药与化学生物学教育部重点实验室 福州 350002)
摘要 通过3RACE克隆策略获得绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)核糖体失活蛋白(ribosome-inac-
tivating protein,RIP) Gynostemmin的5个cDNA序列gynostemminⅠ~Ⅴ及其下游非编码区(3 untranslated
region, 3UTR)。它们的编码区长度除gynostemminⅡ为825 bp外，其余均为831 bp。其下游非编码区
的长度分别为279、174、170、161和171 bp。在3UTR中，gynostemminⅠ比另外4个多了两个小的茎
环结构和一富含AU的不稳定子元件，其mRNA的稳定性可能因此受到影响。
关键词 绞股蓝，核糖体失活蛋白，3RACE，3UTR
Five cDNA Sequences and Their 3Untranslated Region
Encoded Ribosome-Inactivating Protein from
Gynostemma pentaphyllum
LIN Yi XIE Li-Yan CHEN Guo-Qiang WU Zu-Jian XIE Lian-Hui② LIN Qi-Ying
(Institute of Plant Virology, Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education,
Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)
Abstract Five cDNA sequences and their 3 untranslated regions (3 UTR) of ribosome-inacti-
vating protein from Gynostemma pentaphyllum were isolated and analyzed. The coding region
of gynostemminⅡ is 825 bp in length, and those of the other four are 831 bp long. Their 3 UTRs
are 279, 174, 170, 161 and 171 bp in length, respectively. Two small stem-loop and one AU-rich
element were found only in the 3 UTR of gynostemmin I.
Key words Gynostemma pentaphyllum, Ribosome-inactivating protein, 3 RACE, 3 UTR
核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating
protein, RIP)是一大类能抑制蛋白质生物合成
的蛋白质超家族，广泛分布于高等植物中。
根据结构的不同可分为Ⅰ型单链和Ⅱ型双链
两种，其中对Ⅰ型RIP的研究最为深入。RIP
具有非常广谱的植物病毒抗性，还能抵抗多
种植物病原真菌以及农业害虫，具有很好的
植物保护前景(Wang and Tumer, 2000；Zhou
et al., 2000；Peumans et al., 2001)。此外，RIP
及其单链免疫毒素对肿瘤、骨髓移植、自身
164 22(2)
免疫及艾滋病(AIDS)等疾病的治疗有着潜在
的应用前景，有的已在临床应用试验中取得
了令人瞩目的进展(McGrath, 1989；Shaw et
al., 1994；Au et al., 2000；Witte, 2001)。
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)是葫
芦科多年生草质落叶藤本植物，是目前除人
参属外含人参总甙类似物的唯一植物(叶能干
等，1996)。我们首次从绞股蓝中分离到核糖
体失活蛋白，并克隆了其编码基因片段，对
应的203个氨基酸与其他葫芦科RIP对应区段的
同源性为37% ~ 42%(林毅等，2003)。在此基
础上，本研究利用3 RACE技术获得5个cDNA
序列及其下游非编码区序列。
1 材料和方法
1.1 供试材料
1 .1 .1 植物 绞股蓝(Gynos temma
pentaphyllum)采自福建农林大学校园。
1.1.2 菌株和质粒 克隆载体 pMD18-T购
自 TaKaRa公司。E. coli DH5α为福建农林
大学植物病毒研究所保存。
1.1.3 试剂 SMARTTM RACE cDNA Ampli-
fication Kit试剂盒购自 Clontech公司。总
RNA提取试剂盒、λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ
marker、氨苄青霉素(Amp)、IPTG、X-Gal
和核酸内切酶购自上海博亚公司。其他试剂
均为分析纯。
1.2 方法过程
1.2.1 绞股蓝总RNA的提取 取绞股蓝幼
嫩叶片 0.5 g，冰冻 2~3小时后研磨，然后
按试剂盒的操作说明提取总 RNA。
1.2.2 3 RACE模板的制备 利用试剂盒中
的3-CDS primer制备3-RACE-Ready cDNA。
1.2.3 3RACE扩增 根据已知序列设计正
向特异引物609A(CGGGATCCGACATTAAC-
TTTAGCCTGGCGGGT)和3GSP(GACATTAA-
CTTTAGCCTGGCGGG)，均对应成熟蛋白N
端第一个氨基酸的密码子，不同的是609A的
5端引入BamHⅠ酶切位点，3GSP的5端不
含修饰碱基。以 3-RACE-Ready cDNA为模
板，用609A和试剂盒中的UPM进行PCR扩
增，进一步以 3GSP和试剂盒中的NUP对前
一扩增产物进行半嵌套扩增。扩增反应在T3
Thermocycler(BiometraR)基因扩增仪上进行，
反应程序为：94 ℃变性 50秒，68~60 ℃退
火 50秒(每 2个循环降 2 ℃，60 ℃时 17个循
环)，72 ℃延伸 2分钟。RACE扩增采用试
剂盒中的Advantage2 Polymerase Mix，其中
含有少量具有校正功能的聚合酶，因此扩增
序列的保真性较好。
1.2.4 克隆和序列测定 PCR产物回收后与
pMD18-T载体连接，转化E.coli DH5α，以
5GSP2为测序引物对阳性重组克隆子进行序列
测定。
1.2.5 生物信息学分析 核酸或氨基酸序列
比较与同源性分析在 www.ncbi.nlm.nih.gov/
blast和 www.ebi.ac.uk/tools/clustal上进行。
基因及蛋白质理化性质分析在DNATOOLS生
物学软件上进行。亚细胞定位在 http://psort.
nibb.ac.jp上进行。5UTR二级结构的预测用
RNAdraw生物学软件分析。信号肽剪切位置
和穿膜螺旋的预测通过 www.cbs.dtu.dk/ser-
vices上的相应软件进行。
2 结果分析
2.1 3RACE扩增和序列测定
以 3-RACE-Ready cDNA为模板，用
609A/UPM进行 PCR扩增，产生约 1 100 bp
和 1 000 bp 2种不同大小的产物。进一步以
3GSP/NUP对前一扩增产物进行半嵌套PCR，
产物中除上述 2个条带外，还有 2个非常微
弱的条带，约 900 bp和 850 bp(图 1)。分别
将其克隆到pMD18-T 载体上进行序列测定。
获得了 5 个 R I P 序列，分别命名为
gynostemminⅠ (AY134616)、gynostemmin
Ⅱ ( A Y 1 3 4 6 1 7 )、g y n o s t e m m i n Ⅲ
1652005 林 毅等: 绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的 5个 cDNA及其下游非编码区
(AY160767)、gynostemmin Ⅳ (AY160768)和
gynostemminⅤ (AY160769)。它们的编码区
长度除 gynostemmin Ⅱ为 825 bp外，其余均
为831 bp。其3UTR的长度分别为279、174、
170、161和 171 bp。
2.2 5个 cDNA及其编码区的比较
根据序列中缺失的情况，将绞股蓝 RIP
的 5个 cDNA分为 2组。组 1，发生 6 bp缺
失(535 GAAAAC 540，与574~579间的序列
完全一样)，包含 gynostemmin Ⅱ，编码 275
aa，它与组 2各成员的同源性为 93%~94%；
组 2，包含 gynos temmin Ⅰ、Ⅲ ~ Ⅴ，不
发生 6 bp缺失，编码 277 aa，成员间的氨
基酸水平同源性为 98%~99%。
gynostemminⅠ~Ⅴ共有41个碱基变异。
其中32个发生在gynostemminⅡ上(含6 bp缺
失)，4 个在 g y n o s t e m m i n Ⅳ上，2 个在
gynostemminⅠ上，2个在 gynostemminⅤ
上，还有 1个发生在 gynostemminⅢ。41个
变异中，除 A-G729外，其余 40个均只发生
在 gynostemminⅠ ~Ⅴ中的一个成员上。
gynostemminⅠ~Ⅴ编码蛋白之间发生23
个氨基酸残基变异(图 2)。其中 18个发生在
GynostemminⅡ上(包含6 bp缺失编码的E和
N 2个残基)，3个在 GynostemminⅣ上，1
个在 G y n o s t e m m i n Ⅰ上，另有 1 个在
GynostemminⅤ上。GynostemminⅣ发生独
一无二的变异：17(r-F)，而其他植物 RIP的
相应位点处均为 F。G y n o s t e m m i n Ⅲ与
GynostemminⅠ有2个氨基酸发生差异：154
(m-V)和 1 8 4 ( p - T )。Gynos temmin Ⅴ与
GynostemminⅠ之间只有 1个氨基酸不同：
184(p-T)。
2.3 绞股蓝 RIP 5个 cDNA的下游非编码
区的比较
就3UTR而言, C%为9.94~11.49, (G+C)%
为 24.37~26.71，符合 3UTR的一般特征。
gynostemminⅠ的长度为279 bp，而其余4个
仅 1 6 1 ~ 1 7 4 b p，其差别主要是因为
gynostemminⅠ的poly(A)信号与poly(A)之间
的距离长达 123 bp，而其余的仅为 14~24
bp。与 a-luffin、b-luffin和 trichoanguin一
样，绞股蓝RIP基因家族采用TGA为终止密
码子，而 TCS、a-momorcharin和 BD1的终
止密码子则为TAG。绞股蓝RIP基因家族的
poly (A)信号为“AATAAATAAA”，不同
于常见的“A A T A A A”。
gynostemminⅡ~Ⅴ的3UTR其二级结构
基本相似(图 3A)，而 gynostemminⅠ则多了
两个小的茎环结构(图 3B)。gynostemminⅠ
的 3UTR 中还含有不稳定子元件 ARE(AU-
rich element)。两个小的茎环结构和ARE可能
对其mRNA的稳定性有所影响，绞股蓝可能
因此对 RIP基因家族实施不同的调控策略。
2.4 分析
绞股蓝RIP前体的加工，除了发生N-末
端信号肽切除外，还可能在转运到目的地之
后发生C-末端延伸序列切除。目前已证实发
生C-末端延伸序列切除的RIP至少有TCS(19
aa )、Sech iumin(15 aa )、PAP(29 aa )、
Bouganin(29 aa)和 Saporin-6(22 aa)(Chow et
al., 1990；Benatti et al., 1991；Tumer et al.,
1997；Wu et al., 1998；den Hartog et al.,
图 1 3RACE扩增产物
Fig.1 The amplified products of 3RACE
M. λDNA cleaved with HindⅢ and EcoRⅠ; lane 1.
The PCR products (M, MW marker)
166 22(2)
2002)。迫切的任务是确定绞股蓝RIP的C-末
端延伸序列的氨基酸个数，可通过测定
Gynostemmin的C-末端氨基酸序列确认延伸
序列的位置，或者应用相关的分析软件预测
出大致的切除位置，并据此寻找合适的切除
物质。
单碱基变异也可能造成重大影响。绞股
蓝RIP基因家族成员间存在的天然变异，可能
包含了大部分重要的变异位点，为今后利用点
突变技术研究RIP的结构与功能指明了方向。
3UTR对mRNA表达的调控作用极其重
要，它更多地决定特定 mRNA的个性，调
图 2 推导的GynostemminⅠ ~Ⅴ氨基酸序列的比较
Fig.2 Comparison of the deduced amino acid sequences of GynostemminⅠ ~Ⅴ
The sequence alignment was carried out with CLUSTAL W (1.81). Dashes denote gaps introduced to obtain maximal
homology. The identical amino acid residues are marked by asterisks (*).
1672005 林 毅等: 绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的 5个 cDNA及其下游非编码区
控特定mRNA在特定条件下能否正常表达或
表达的效率。绞股蓝RIP基因家族中，3UTR
的 poly(A)尾的长度、ARE不稳定子元件以
及二级结构等对mRNA稳定性的影响有待考
察。可将其 3UTR与 GUS基因融合，导入
烟草原生质体，研究不同 3UTR对翻译的调
控作用。
图 3 GynostemminⅠ ~Ⅴ的下游非编码区的二级结构比较
Fig.3 Comparision of secondary structure of 3UTR of GynostemminⅠ ~Ⅴ
A. GynostemminⅡ ~Ⅴ; B. GynostemminⅠ
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本研究还获得了一个 R I P 基因相关序
列，长 881 bp，与 gynostemmin Ⅰ ~Ⅴ的
碱基序列高度同源(大于 90%)。但因为 6次
“二碱基插入”造成移码变异，导致翻译过
早终止。这种异常RIP基因的mRNA可能很
快就被降解，以避免异常产物的积累。
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