全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
基因工程与蛋白质工程研究中常常用到基因突变技术制备突变体,用于研究基因调控、表达和蛋白质的
结构与功能。传统的用于研究蛋白质结构与功能关系的方法有两种:(1)对蛋白质一级结构的氨基酸残基侧
链进行修改;(2)蛋白质晶体结构的 X射线衍射。虽然这些方法能提供一定量的信息,但受很多条件的制约,
用途有限。如果采用定点突变技术在克隆 DNA的预定位点导入突变,然后在适当的宿主细胞-载体系统中表
达经改造的基因突变体,则可通过比较突变体蛋白与野生型蛋白的性质,鉴定出对蛋白质的结构和/或生物
学功能至关重要的结构阈或个别氨基酸残基。由于定点突变及克隆化基因的表达两方面的发展,使得突变体
研究成为生物化学家和分子生物学家分析蛋白质的结构与功能的首选方案。
寡聚核苷酸引物与靶 DNA杂合分子中间位置的单个碱基的错配并不影响扩增效率,这些错配能够转换
为 PCR产物中引物区域的定点突变,这就是突变引物介导 PCR定点突变的原理。PCR定点突变方法中以重
组 PCR法、重叠延伸法、u模板法和大引物突变等方法用得较多[1],特别是重叠延伸突变法和大引物突变法,
但均需多轮PCR和多对引物[2],导致非目标突变率高,且操作复杂,步骤繁琐。
近年来,产生了一种快速 PCR定点突变方法[3],该方法是把要突变的基因克隆到质粒载体上,用两个突变
引物同时对质粒 DNA扩增,然后加入限制性内切酶消化掉模板 DNA,用 Pfu补平,T4DNA连接酶连接,经乙
一种改进的快速PCR定点突变技术
高川 韩维涛 宋云扬 张靖 王惠芳
(北京防化研究院第四研究室,北京 102205)
摘 要: 在基因工程与蛋白质工程研究中常常用到基因突变技术制备突变体,用于研究基因调控、蛋白质的结构
与功能。本项研究在快速PCR定点突变技术的基础上,改进实验方法,简化实验步骤,以适用蛋白质结构改造研究的需
要。建立的突变技术仅需一次PCR反应即可完成基因的定点突变,突变效率为79.6%左右。该法对1～3个连续碱基的突
变和对间隔4个甚至多达15个碱基的数个密码子突变效果都很好。
关键词: PCR反应 突变引物 基因 定点突变
ATechniqueofImprovedRapidSite-directedMutagenesis
GaoChuan HanWeitao SongYunyang ZhangJiang WangHuifang
(Thefourthdepartmentofresearchinstituteofdefencechemistry,Beijing102205)
Abstract: Mutantspreparedbymutagenesismethodsareusualyusedtostudygeneregulations,geneexpresions
andthestructure-functionrelationshipsofproteinsingeneengineeringandproteinengineering.Inthisstudy,wefocus
onestablishinganew genemutationtechnique,improvingtheexperimentalconditionsandexpandingthepractical
extentsformeetingthedemandsofengineeredproteinstructures.Thetargetgeneswereinsertedintothecloning
vectors—plasmids.ThemutationwascompletedonlybyonestepPCR reactionusingadouble-strandedDNAtemplate
anddouble-mutationprimerscatalyzedbyTaqplusDNA polymerase.AftertheDNA templatewasdigestedbya
restrictionendonuclease,thevectorswereintroducedintohostcelsandthetargetgeneswithmutationswereexpresed
byusinghostcels’transcriptionandtranslationmechanism.Themutationratewas79.6%.Thismethodwasefectivefor
themutationof1~3continuousbasesandofafewcodonsspacedbyseveralbases.
Keywords:PCRreaction Mutationprimer Gene Site-directedmutagenesis
收稿日期:2006-02-14
作者简介:高川(1968-),女,博士研究生,助理研究员
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
醇沉淀后直接转入大肠杆菌,筛选阳性克隆株,该法仅需一次 PCR反应,降低了 PCR反应中因碱基错配引入
的非特异突变率,目标突变效率高,但实验中还需 DNA的未端补平和连接两步,操作依然较繁琐。本文在此方
法的基础上进行了改进,并研究了改进后方法的突变效率。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、细胞和质粒 大肠杆菌 Top10,购自天为时代公司;大肠杆菌表达质粒 pET-22b(+),本室保存。
1.1.2 寡聚核苷酸引物 (1)突变引物,其中小写字母为突变的碱基
白喉杆菌核糖体失活蛋白毒素基因的突变引物 1(CRIT1)(154E→R,GAA→CGT):
上游:5-GAATATATTAATAACTGGcgtCAGGCGAAAGCGTTAAGC-3
下游:5-GCTTAACGCTTTCGCCTGacgCCAGTTATTAATATATTC-3
白喉杆菌核糖体失活蛋白毒素基因的突变引物 2(CRIT2)(154E→D,GAA→GAT):
上游:5-GAATATATTAATAACTGGGAtCAGGCGAAAGCGTTAAGC-3
下游:5-GCTTAACGCTTTCGCCTGaTCCCAGTTATTAATATATTC-3
CRIT3(154E→D,156A→V,GAA→GAT,GCG→ GTG):
上游:5-GAATATATTAATAACTGGGAtCAGGtGAAAGCGTTAAGC-3
下游:5-GCTTAACGCTTTCaCCTGaTCCCAGTTATTAATATATTC-3
白喉毒素基因的突变引物(DT)(149Y→F,154E→D,TAT→TTT,GAA→GAT):
上游:5-GGG AGTTCTAGC GTTGAA TtTATTAATAAC TGG GAtCAG GCG AAA GCG TTA
AGC-3
下游:5-GCTTAACGCTTTCGCCTGaTCCCAGTTATTAATAaATTCAACGCTAGAACTCCC
-3
葡萄球菌食物中毒性毒素?基因的突变引物(SFβ)(22E→K,GAA→AAA)
上游:5-ACTGGTTTGATGaAAAATATGAAAGTTTTG-3
下游:5-AACTTTCATATTTTtCATCAAACCAGTGAA-3
(2)测序引物
T7promoterprimer:5-TAATACGACTCACTATAGGG-3
T7terminalprimer:5-CTAGTTATTGCTCAGCGGT-3
以上引物均由赛百盛公司合成。
1.1.3 工具酶 限制性内切酶 DpnⅠ为 Promega公司产品;TaqplusDNA聚合酶为天为时代公司产品。
1.1.4 试剂盒 PCR产物纯化试剂盒为 Promega公司产品;小量质粒提取试剂盒为北京天为时代公司产品。
1.1.5 主要试剂 氨苄青霉素为 Sigma公司产品;蛋白胨、酵母提取物为 Oxoid公司产品;DNAMarker购自
天为时代公司,其它为市售进口或国产生化试剂。
1.1.6 主要仪器 PCR仪,Eppendorf公司;DNA自动测序,373AABI公司。
1.2 方法
1.2.1 基因的定点突变 直接以已构建的含目的基因的质粒为模板,通过 PCR反应实现基因的定点突变:
50μlPCR反应体系中含:Tris-HCl10mmol/L,模板 DNA10ng,dNTP0.2mmol/L,MgCl21.5mmol/L,上、
下游引物各 50ng,以上反应液混合均匀后,95℃变性 5min,再加入 TaqplusDNA聚合酶 1.5U。循环反应参
数:94℃30秒,55℃30s,72℃10min,共 16个循环,反应完成后 72℃延伸反应 7min。
1.2.2 模板的酶切和质粒的纯化 在 50μl反应体系中加入模板内切酶 1μl,约 2.5U,37℃过夜。而后,在反应
体系中加入 2倍体积的无水乙醇沉淀 DNA,70%乙醇洗涤一次,室温干燥 10～20min,溶于 5μl水中。
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图1 基因定点突变载体构建策略
图2 白喉杆菌核糖体失活蛋白毒素基因测序图 图3 突变体CRIT2测序图(1个碱基)
⋯ACTGGTTTGATGAAAAATATGAAAGTTTT⋯
图4 葡萄球菌食物中毒性毒素 ! 基因突变序列
1.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 电转化法大肠杆菌感受态细胞和 CaCl2法大肠杆菌感受态细胞的制备
按实验室常规方法制备。
1.2.4 质粒 DNA电转化大肠杆菌 Top10细胞 取出 1管 E.coli感受态细胞,于冰上熔化感受态细胞,加入
2μl质粒 DNA混匀,转移到预冷的电转杯中。将电转杯放入电激槽中,电脉冲激一下,取出电转杯立即加入
1mlLB培养基。把细胞液转移到 1.5mlEppendorf管中,37℃摇床 250r/min培养 45min,离心,把细胞涂布于含
相应抗性标记的 LB培养皿中。
1.2.5 DNA序列分析 提取质粒 DNA,用 373A型 DNA自动测序仪
测序。
2 结果
2.1 基因定点突变的构建策略
通过基因的定点突变研究蛋白质结构与功能的关系、载体各顺式
作用元件与基因表达的关系等,是一种非常有效的方法。运用 PCR进
行定点突变的方法较多,本实验改进了快速 PCR引物定点突变法,图
1为在质粒中实现基因突变的载体的构建策略图。
2.2 基因的定点突变
2.2.1 单碱基位点突变 对白喉杆菌核糖体失活蛋白毒素单碱基位
点的突变试验,共进行了两次重复,每次随机挑选 6个克隆测序,发生
突变的克隆分别为 4个和 6个。图 2为原始基因的测序图,图 3为突
变体 CRIT2测序图(单点突变)。
另外,据报道引物 AT含量影响 PCR的扩增效率,
AT含量越高扩增难度越大。试验中,在葡萄球菌食物中
毒性毒素 ! 基因中选取了 AT含量高达 70%的序列设计
突变引物,对相应基因进行了 3次突变,每次挑取 6个克
隆测序,突变数分别为 4个、5个和 6个。结果显示此方
法对 AT含量较高的 DNA同样能有效地实现突变,如图
4所示。
2.2.2 连续碱基的定点突变 对白喉杆菌核糖体失活
蛋白毒素基因进行连续 3个碱基的突变,共进行了 3次
突变试验,每次随机选取 6个单菌落在试管中培养、提取
质粒、进行序列分析,分别得到 4、4、5个突变体。实验结
果表明,该基因序列在实验设计的部位实现了基因突变,
且突变效率很高,突变位点用方框标出。图 5为突变体
CRIT1的序列分析图。
高川等:一种改进的快速PCR定点突变技术 101
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
2.3 突变效率
运用传统的随机突变和化学诱变不能实现 DNA的定点突变,对多碱基突变更是一难点,但定点突变对于
研究蛋白质与多肽毒素的结构与功能常常是必需的。在 1个碱基突变取得较好效果的基础上,扩大突变范围,
对连续 3个碱基、间隔数个碱基的两个碱基进行突变,实验可知,连续 3个碱基的平均突变效率约为 72%,对
AT含量较高的基因片段中的碱基的突变,也取得了很好的效果,突变效率为 83%左右;对中间隔开多达 15个
碱基的数个碱基的突变效果依然很好。
2.2.3 间隔多个碱基的两个位点的基因突变 为了
考查此方法对间隔数个碱基的两个位点的突变效率,
设计了间隔 4个和间隔 15个碱基的突变引物:CRIT3
引物和白喉毒素突变体引物。用 CRIT3引物对 CRIT
基因进行了 2次突变,每次随机挑选 6个细菌单克
隆,提取质粒进行 DNA序列测定,其突变数分别为 4
个和 3个;用白喉毒素突变体引物对白喉毒素基因进
行了一次突变试验,随机挑选的 6个单克隆全部发生
了所期望的突变,图 6和图 7分别为此两种突变体的部分测序图。
表1 快速PCR定点突变法的突变效率
图5 突变体CRIT1测序图(连续3个碱基)
图7 白喉毒素基因突变体测序图(相隔15个碱基)图6 突变体CRIT3测序图(相隔4个碱基)
用快速PCR定点突变方法先后对几种不同毒素和蛋白质的基因进行了定点突变,该法的突变效率列于表1。
由上表可知,快速PCR定点突变法的突变效率高达79.6%,重复性较好,突变效果明显优于其它突变方法。
3 讨论
在蛋白质工程研究中,蛋白质突变技术是常用技术。通过基因的定点突变研究蛋白质的结构与功能的关

   
/ 

 
/

CRIT1 3/0 3 4/64/65/6 728
CRIT2 1 2 4/66/6 8417
CRIT3 1+1/4 2 4/63/6 599
 1+1/15 1 6/6 1000
 !"#$%&’ß 1 3 4/65/66/6 8313
()* 79.615.2

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2006年第3期
参 考 文 献
1 HirabayashiJ,KasaiK.Glycobiology,1993,3(4):297~304.
2 Vacelet.JMicroscBiolCel,1975,23(3):271~288.
3 MμlerWEG,BrummerF,BatelR,etal.Naturwissenschaften,2003,90(3):103~120.
4 WildJ,HradecnaZ,SzybalskiW.GenomicResearch,2002,12(9):1434~1440.
5 LiZY,HeLM,WuJ,etal.JournalofExperimentalMarineBiologyandEcology,2006:75~85.
6 李志勇,秦恩昊,蒋群,等.水产学报,2005,29(1):38~42.
7 黄艳琴,李志勇,蒋群,等.微生物学通报,2005,32(4):5~10.
8 沈颖,李志勇,蒋群,等.微生物学通报,2005,32(4):15~19.
9 何丽明,李志勇,蒋群,等.微生物学通报,2005,32(3):51~56.
10 胡叶,李志勇.生物技术通报,2005(6):56~61.
11 李志勇,吴杰.大片段海绵宏基因组 DNA快速提取方法.中国发明专利,申请号:200610024278.8.
12 TzeTingC,JenLeihW,ThomasTC,etal.MarineBiotechnology,2005,37(6):119～127.
系、载体各顺式作用元件与基因表达的关系等,是一种非常有效的方法。蛋白质突变技术在生物化学与分子
生物学研究中常用的方法是 PCR突变法。运用 PCR进行定点突变本身又有很多方法,如重组 PCR法、重叠延
伸法、u模板法等等[3~4]。这些方法有的所需引物较多,有的操作步骤较繁琐。近些年来国外发展了一种的快速
PCR定点突变法。本实验在这一方法的基础上加以改进,新的方法只需一次 PCR反应和酶切,无需 DNA的其
它操作,简单快速,有效率约达 79.6%。
目前,实验室所用的 E.coli宿主菌多为甲基化细菌[5],它可在细胞内对一些特定的 DNA碱基序列进行甲
基化修饰。模板限制性内切酶的识别位点为甲基化和半甲基化位点。由于只有亲代 DNA经过细胞内甲基化修
饰,体外 PCR扩增的 DNA因没有被甲基化,对模板限制性内切酶不敏感,故模板限制性内切酶不能消化体外
PCR扩增的DNA,由细胞内提取的DNA经模板限制性内切酶酶切后切为多个片段,体外合成的带有缺口的单链
或双链DNA保留下来,在转化感受态细菌后,大肠杆菌自身修复系统可将此缺口连接,形成环状闭合质粒。
用模板限制性内切酶酶切质粒和纯化的 PCR产物,同时转化感受态细胞,结果为 PCR产物转化长出较
多菌落,而酶切质粒只长出少许菌落。从理论上讲,来自于细菌的质粒 DNA含有甲基化位点,经模板限制性
内切酶酶切后不能转化成功,后者之所以长出少数菌落,估计是酶切不彻底所致。
此外,该项研究最好的聚合酶为 KlenTaqTM LADNA聚合酶,该酶反应速度快,保真性能好,催化片段
长,但该酶目前国内还没有商品供应。实验中研究了 TaqDNA聚合酶、TaqplusDNA聚合酶、pfu聚合酶,综
合考虑反应速度、保真效果和催化长度等因素,以 TaqplusDNA聚合酶效果较好。TaqplusDNA聚合酶的纠
错率为 TaqDNA聚合酶的 100倍[6~8],保真性能较强,但即使这样也不能确保合成的 DNA序列准确无误,故
需对 PCR聚合反应的结果进行序列分析,以保障合成的突变体基因序列与实验设计的一致。
实验结果表明,该实验方法阳性率高,重复性好,操作简便,明显优于其它定点突变方法。
参 考 文 献
1 AiyarA,XiangY,LeisJ.MethodsMolBiol,1996,57:177～191.
2 LingMM,RobinsonBH.AnalBiochem,1997,254:157～178.
3 CW.迪芬巴赫,GS.德维克斯勒,《PCR技术实验指南》(第一版),北京:科学出版社.1998.
4 TaylorJW,EcksteinF.NucleicAcidsRes,1985,13:8765～8785.
5 McClelandM,NelsonM,RaschkeE,etal.NuclAcidsRe1994,22:3640～365.
6 KongHM,KuceraRB,JackWE.JBiolChem,1993,268:1965～1975.
7 MatilaP,KorpelaJ,TenkanenT,etal.NuclAcidsRes,1991,19:4967～4973.
8 KeohavongP,WangCC,ChaRS.Gene,1988,71:211～216.
高川等:一种改进的快速PCR定点突变技术
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