全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
降落PCR法快速检测高羊茅转基因植株
田路明 1,2 黄丛林 1 张秀海 1 张潞生 2 吴忠义 1
(1北京农业生物技术研究中心,北京 100089;2中国农业大学农学与生物技术学院,北京 100094)
摘 要: 通过CTAB微量提取高羊茅(Festucaarundinacea)转基因再生植株基因组DNA。用9600型PCR仪器设
计降落PCR反应程序,对高羊茅转基因植株两个片段OSISAP1(495bp)和GFP-nos(1000bp)进行扩增;同时进行了PCR扩
增的初步检测。结果表明降落PCR法能快速准确检测转基因植株;而且更适合多个基因片段同时检测,从而提高 PCR
分子检测的效率,以提高转基因植株鉴定效率。
关键词: CTAB 降落PCR 转基因植株
ApplicationofTouchDownPCRinIdentifyingTalFescue
TransgenicPlants
TianLuming1,2 HuangConglin1 ZhangXiuhai1 ZhangLusheng2 WuZhongyi1
(1BeijingAgro-BiotechnologyResearchCenter,Beijing100089;2ColegeofAgronomyandBiotechnology,ChinaAgricultural
University,Beijing100094)
Abstract:GenomicDNAoftransgenicplantsofFestucaarundinaceawereextractedlitlebyCTAB.Theprogram
oftouchdownPCR wasdesignedin9600-typePCR machine.TwofragmentsofOSISAP1 (495bp)andGFP-nos(1
000bp)wereamplifiedwiththeprogram designedatthesametimeandelectrophoresisofagargelsshowstheproducts
ofamplificationoftwofragments.TheresultsindicatedthattouchdownPCR iseficientinidentifyingthetalfescue
transgenicplantscorectlyandquicklyanditisfittoamplificationofseveralgenefragmentssothatitimprovestheefi-
ciencyofdetectioninnextexperiments.
Keywords:CTAB TouchdownPCR Transgenicplants
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是转基因植株分子检测常用的一种方法[1]。多聚酶链
式反应(PCR)是在模板 DNA、引物和 4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖 DNA聚合酶的酶促反应[2]。几
种常用特殊 PCR技术:逆转录 PCR(RT-PCR),多重 PCR(MultiplePCR),巢式 PCR(nestedPCR),非对称 PCR
(asymmetricPCR)和降落 PCR(TouchdownPCR)等。主要是利用降落 PCR手段进行研究。降落 PCR主要是
针对退火温度不确定的基因扩增,从而设计多循环以使相连循环逐渐降低退火温度以扩增出目的片断,并
且可对多个目的片断同时扩增。
由于转基因技术的成熟,大量的植物被用来转基因研究,许多植物已经建立良好的转基因体系,得到转
基因植株已不是什么难事,面临大量的转基因再生株系,初步的快速分子检测成为转基因植株鉴定的重要
环节,为下一步有效地进行分子检测奠定基础。以高羊茅为转基因材料,探讨降落 PCR法快速检测转基因
植株的应用以提高检测效率,降落 PCR法成功用于本实验的检测。
1 材料和方法
1.1 实验材料
收稿日期:2005-12-14
基金项目:北京市科委新星计划项目(H020821330130)资助
作者简介:田路明(1978-),男,硕士,研究方向:逆境分子生物学
通讯作者:吴忠义,张潞生,Authorforcorespondence.E-mail:zwa22@hotmail.com;Lusheng@cau.eud.cn
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
质粒和菌株:pUC18-GFP, pGreen0229质粒和 DH5α
菌株由北京农业生物技术研究中心逆境分子生物学研究
室提供。基因枪法介导的转 OSISAP1(AY137590)[3]基因的
高羊茅再生植株。(图 1)
1.2 试剂与仪器
主要试剂,DNAMarkerDL2000+15000、Taq聚合酶等
酶购自大连宝生物工程公司(TaKaRa);RNase酶购自上海
生物工程公司。主要仪器有电泳仪 DYY-6B稳压稳流电泳仪,凝胶成像仪 UVP,9600型 PCR仪。
1.3 实验方法
1.3.1 微量快速提取 DNA 2%CTAB法快速提取高羊茅基因组 DNA:(1)取 0.1g植物组织(叶片),放入灭
过菌的 1.5mlEppendorf离心管中,加入液氮研磨成粉末。(注:1ml枪头火烧尖端,用以研磨,避免株系间
DNA污染)。(2)加入 1000μl新配制的提取液,在涡悬器上振荡摇匀。(3)64℃金属浴 30min,期间不断颠
倒混匀。(4)各加入 1/2等体积的酚:氯仿/异戊醇,混匀。(5)12000rpm离心 5min,将上清液移至离心
管中,加入等体积的氯仿/异戊醇,12000rpm离心 5min。(6)将上清转入另一灭过菌的 1.5mlEppendorf
离心管中,加入 2/3体积的异丙醇,混匀后-20℃静置 10min。(7)12000rpm离心 10min,弃上清。(8)加入
70%的乙醇冲洗两次,再用无水乙醇冲洗一次。(9)吹干或自然风干后(不可太干,否则影响溶解),溶于 50μl
无菌水(可加入 RNase100mg/ml),在 37℃放置 1h以除去 RNA。
1.3.2 引物设计与合成 引物设计软件:Oligo6.0,引物由北京三博远志生物技术公司合成。OSISAP1上游
引物序列:5GCAGGATCCATGGCGCAGCGCGAC3,下游引物序列:5TGCAGGCCTGAACCT
AACGATCTTGGCCGC3。GFP-nos上游引物序列:5TATGGA TCCATG GTG AGCAAG GGC
GAG3,下游引物序列:5GGCGAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCG3。
1.3.3 降落 PCR程序优化 PCR反应体系(25μl)如下:植物基因组 DNA(模板)1μl,上游引物 1μl,下游引
物 1μl,Bufer(含 MgCl2)2.5μl,dNTP2μl,TaqDNApolymerase0.15μl,ddH2O17.35μl。PCR扩增程序为:
105℃热盖,94℃预变性 3min,然后进入 PCR扩增程序
图 2,58~54℃每降一度循环 4次,53℃,52℃循环 5次,
共 30个循环,最后再延伸 10min。
PCR按照设计好的反应体系,两对引物分别加样
配好反应体系;热盖后,同时放入设定好的反应程序的
PCR仪中。PCR扩增结束,扩增产物于 1g/L琼脂糖凝
胶电泳分析。
2 结果与分析
2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳
提取的 DNA经 UV7501紫外分光光度计检测,
D260nm/280nm介于 1.8~2.0,表明 DNA纯度符合质量
标准。高羊茅基因组 DNA琼脂糖凝胶电泳图 3,1~8号
泳道的 DNA没有杂带,蛋白几乎没有,RNA基本去处,
DNA质量较高。
2.2 降落 PCR检测转基因植株
对于获得转基因的再生高羊茅植株,必须对其进
行初步的 PCR检测,我们考虑对其转 OSISAP1基因目的片段(495bp)和标记基因 GFP-nos片段(1000bp)同
图2 PCR反应程序
图3 琼脂糖凝胶电泳
MDNA分子量标准,1~8部分转化植株的基因组DNA
图1 质粒pUC18-GFP和pGreen0229
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时 PCR检测,这样应该能从转基因阳性植株中同时扩增出两个片段,从而提高鉴定阳性植株的效率。对部
分植株 PCR扩增结果电泳,OSISAP1基因琼脂糖凝胶电泳图 4,2泳道为转基因高羊茅阴性对照未有条带,
3,4,5,6,8,9,10,11泳道扩增出与质粒阳性对照同样大小的 OSISAP1基因片段。GFP-nos基因片段琼脂糖
凝胶电泳图 5,2泳道为转基因高羊茅阴性对照未有条带,3,4,7,8,9,10,11,12泳道扩增出与质粒阳性对照同
样大小的 GFP-nos基因片段。3,4,8,9,10,11植株两个片段的扩增都得到相应大小的片段,初步肯定是转基
因阳性植株,5,6,7,12植株假阳性的可能性较大;均需进一步分子检测确定是否为转基因植株。
3 讨论
链式聚合酶反应 PCR是极为灵敏的反应,极为少量的 DNA模板就能扩增数以百万倍。由于获得大量
的转基因再生植株,需要对其进行转基因检测,PCR反应是较为常用的检测,但是普通 PCR反应检测的假
阳性结果较多,对于更进一步的分子检测造成麻烦,如何提高 PCR检测的质量成了关键,将为进一步的分
子检测减少麻烦。降落 PCR反应,在克隆基因上有着较强的优势,对于不确定退火温度的基因的 PCR扩增
为首选,从而获得较理想的扩增产物[4]。
通常的降落 PCR程序的退火温度范围可跨越 15℃左右,甚至从 65~45℃左右[5]。在每个温度上循环 2
个周期,然后在较低的复性温度上循环 3~5个周期。DonR.H.等人认为,PCR过程中的前几个循环对于扩
增产物的纯度非常重要,因此前几个循环较高的退火温度,会增加引物与模板结合的特异性,降落 PCR方
法可以阻止非特异性产物的形成[6]。在本实验中,由于软件预测的两个退火温度较接近,将退火温度范围设
定为 58℃至 52℃,前几个循环复性温度上增加至 4个循环周期,提高特异产物与非特异产物的比率。但在
我们的实验中发现,由于最低的退火温度较低,而这一温度又是循环周期最多的退火温度,较低的退火温度
下,形成少量非特异性配对,已经达到理想的检测目的。
本实验的结果发现,对同一个转基因植株的两个片段的降落 PCR电泳,一个检测为阳性,而另一个检
测为阴性,这样的转基因植株假阳性的几率较高,两个片段同时检测为阳性的转基因植株初步认定为阳性
转基因植株,从而选定这样的植株进行下一步的分子检测如 Southern杂交和 Western杂交等,提高检测效
率。本实验只是进行一个转基因的降落 PCR反应,可以同时进行 2个或更多转基因植株的降落 PCR反应,
在一个反应程序下,多个不同 PCR反应同时进行,设定较大退火温度范围,从而扩增出所要的产物以鉴定
转基因植株,省时省力提高了检测效率。
参 考 文 献
1 王关林,方宏筠.植物基因工程(第二版),北京:科学出版社,2002,189~194.
2 卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术(第二版),北京:中国协和医科大学出版杜,1999,388.
3 ArnabMukhopadhyay,ShubhaVij,AkhileshK.ProceedingsofNationalAcademySciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004,101(16):6309~6314.
4 RebeccaSDevon,KathrynLEvans,JohnC.NeuropsychiatricGenetics,1997,74:82~90.
5 萨姆布鲁克 J,弗里奇 EF,曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南(第二版).金冬雁,黎孟枫,侯云德等.北京:科学出版社,1988,604~605.
6 DonRH,CoxPT,WainwrightBJ.NucleicAcidsResearch,1991,19:4008.
图4 DSISAP1基因琼脂糖凝胶电泳
MDNA分子量标准 1质粒阳性对照
2非转基因阴性对照 3~13部分转化植株
图5GFP-nos基因片段琼脂糖凝胶电泳
MDNA分子量标准 1质粒阳性对照
2非转基因阴性对照 3~12部分转化植株
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