全 文 ：第 １４卷第 ４期
２０１６年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ． ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０４􀆰 ０１３
收稿日期：２０１６－０２－１６
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１３ＣＢ７３３５０４）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２１２０３）
作者简介：夏　 明（１９９１—），女，安徽合肥人，研究方向：仪器分析；刘晓宁（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｉａｏｎｉｎｇｌｉｕ＠ １６３．ｃｏｍ
高聚物高效液相色谱柱分离分析嘧啶和核苷
夏　 明１，黄　 艳１，刘晓宁１，魏荣卿１，郑　 涛２
（１􀆰 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００；
２􀆰 中国科学院 广州能源研究所，广东 广州 ５１０６４０）
摘　 要：建立了使用高聚物型色谱柱，反相高效液相色谱法（ＲＰ ＨＰＬＣ）测定 ５ 种嘧啶和核苷的方法，样品经甲醇
溶解，以 ｐＨ为 ４􀆰 ４的 ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４缓冲盐溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱，流速 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，温度 ２０ ℃，
紫外检测波长 ２５１ ｎｍ。 考察了流动相中不同因素对分离分析的影响，实现了 ５种嘧啶和核苷混合物的有效分离。
柱效可达 ３７ ４００ Ｎ ／ ｍ，优于常规的 Ｃ１８ 硅胶色谱柱（柱效为 ２１ ４００ Ｎ ／ ｍ），为该高聚物填料在嘧啶和核苷化合物
检测方面的广泛应用提供了有关依据。
关键词：反相高效液相色谱法；嘧啶；核苷；高聚物型色谱柱
中图分类号：ＴＱ２５； Ｏ６２６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０４－００６５－０５
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｌｕｍｎ ｂｙ ＨＰＬＣ
ＸＩＡ Ｍｉｎｇ１，ＨＵＡＮＧ Ｙａｎ１，ＬＩＵ Ｘｉａｏｎｉｎｇ１，ＷＥＩ Ｒｏｎｇｑｉｎｇ１，ＺＨＥＮＧ Ｔａｏ２
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｌｕｍｎ ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ⁃ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
（ＲＰ⁃ＨＰＬＣ） ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｆｉｖｅ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ
ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
ｗｅｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ （ＫＨ２ＰＯ４）ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ４􀆰 ４） ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ
ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ，ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ａｔ １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ａｔ ２５１ ｎｍ ａｎｄ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｔ ２０
℃ ．Ｗｉｔｈ ｃｏｌｕｍｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｖｅｒ ３７ ４００ Ｎ ／ ｍ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｃｏｍｍｏｎ Ｃ１８⁃ｓｉｌｉｃａ ｃｏｌｕｍｎ（ｐｌａｔｅｓ：
２１ ４００ Ｎ ／ ｍ），ｏｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｉｌｌｅｒ ｉｎ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲＰ⁃ＨＰＬＣ；ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ；ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ；ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｌｕｍｎ
　 　 嘧啶和核苷主要存在于生物体的遗传物质核
苷酸中，在生物代谢中有着重要的作用［１］ 。 在生
命科学、临床医学［２］ 、药物机理和食品科学［３］等领
域的研究中，核苷酸是一重要的研究对象。 目前，
测定嘧啶和核苷的方法主要有毛细管电泳法［４－５］ 、
荧光法［６］ 、反相高效液相色谱法［７］等。 高效液相
色谱法是利用被分离物质在色谱柱中固定相与流
动相之间的分配系数差异而实现有效分离的。 目
前，文献中报道较多的固定相是采用硅胶基质为
填料分离、分析嘧啶和核苷［７－９］ ，但该基质填料不
耐酸碱，易对样品造成不可逆吸附［１０］ 、易拖尾，且
嘧啶化合物（尿嘧啶、胸腺嘧啶）和核苷化合物（胸
苷、鸟苷和腺苷）均具有较强的极性，在常规反相
色谱柱上保留较弱，因此嘧啶和核苷化合物在使
用常规的 Ｃ１８ 硅胶基质的分离柱分离与分析时，
存在分辨率低、损伤柱效等负面因素［１０］ 。 而高聚
物型色谱填料化学性质稳定，耐水、耐酸碱性好，
无不可逆吸附［１１－１３］ ，且因其含有苯环结构，可对含
有 π电子的环状结构的嘧啶和核苷化合物有望获
得较强的相互作用力，而提高其保留时间，改善其
分离效果。
为此，笔者欲以该高聚物型色谱填料为分离色
谱柱介质对 ５种嘧啶和核苷（尿嘧啶、胸腺嘧啶、胸
苷、鸟苷和腺苷）进行分离条件的优化，确定最佳色
谱条件，以达到用较为简单的流动相洗脱条件实现
较高的柱效和较好的分离效果。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 仪器与试剂
配备 Ｐ６８０ ＨＰＬＣ泵、ＵＶＤ １７０Ｕ型可变波长紫
外检测器，ＡＴ ３３０型柱温箱、８１２５型进样装置的高
效液相色谱仪，美国 Ｄｉｏｎｅｘ 公司；以聚苯乙烯二乙烯
基苯（ＰＳ ＤＶＢ）为基质的高聚物色谱柱 ＭＫＦ ＲＰ
ＨＨ，南京麦科菲高效分离载体有限公司；５种嘧啶和
核苷标准品：尿嘧啶（ｕｒａｃｉｌ）、胸腺嘧啶（ｔｈｙｍｉｎｅ）、胸
腺嘧啶核苷（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、鸟嘌呤核苷（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、腺
嘌呤核苷（ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ），Ｓｉｇｍａ⁃Ａｌｄｒｉｃｈ 公司；分析纯
ＫＨ２ＰＯ４，国药集团化学试剂有限公司；色谱纯甲醇，
美国 ＴＥＤＩＡ公司；超纯水（自制）。
１􀆰 ２　 液相色谱检测条件
色谱柱：ＭＫＦ ＲＰ ＨＨ（３００ ｍｍ×７􀆰 ８ ｍｍ，８
μｍ）；流动相：Ａ 为 ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＫＨ２ ＰＯ４水溶液
（ｐＨ ４􀆰 ４），Ｂ 为甲醇；检测波长：２５１ ｎｍ；流速：１􀆰 ０
ｍＬ ／ ｍｉｎ；进样量：２０ μＬ；柱温：２０ ℃。 样品用甲醇溶
解后用 ０􀆰 ４５ μｍ的尼龙膜过滤。
１􀆰 ３　 标准溶液的配制
１􀆰 ３􀆰 １　 嘧啶和核苷高效液相色谱标准品溶液
精密称取 ５种嘧啶和核苷标准品各 ５􀆰 ０ ｍｇ 分
别置于 ５个 １０ ｍＬ的容量瓶中，以甲醇溶解并定容，
得到 ５个浓度均为 ０􀆰 ５０ ｍｇ ／ ｍＬ 的嘧啶和核苷的标
准品溶液。
１􀆰 ３􀆰 ２　 核苷紫外全波长扫描标准品溶液
精密量取嘧啶和核苷高效液相色谱标准品溶
液 １ ｍＬ，用甲醇稀释为原浓度的 １ ／ ５，得到质量浓度
为 ０􀆰 １０ ｍｇ ／ ｍＬ的嘧啶和核苷的标准品溶液。
１􀆰 ３􀆰 ３　 流动相 Ａ的配制
精密称取 ０􀆰 ６８ ｇ 的 ＫＨ２ＰＯ４，用水溶解并定容
至 ５００ ｍＬ，配制成浓度为 ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ 缓冲盐溶液，
测得其 ｐＨ为 ４􀆰 ４。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ５种嘧啶和核苷标准品紫外全波长扫描结果
及波长的优化
　 　 取质量浓度均为 ０􀆰 １０ ｍｇ ／ ｍＬ的 ５种嘧啶和核
苷标准品溶液进行紫外全波长扫描，结果见图 １。
图 １　 ５种嘧啶和核苷标准品的全波长扫描图谱
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｆｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｏｆ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ
ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｆｕｌｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ
由图 １ 可知：在相同检测浓度（０􀆰 １０ ｍｇ ／ ｍＬ）
下，５ 种嘧啶和核苷标准品的最大紫外吸收波长在
２５１～２６７ ｎｍ范围内，与文献［１４］报道的各嘧啶和
核苷的最大波长一致；但在该范围内，５ 种嘧啶和核
苷的灵敏度相差较大，即由高到低依次为尿嘧啶、
胸苷、胸腺嘧啶、腺苷和鸟苷。 此说明，鸟苷相较于
其他嘧啶和核苷其灵敏度较差，而不易被检测到。
为了兼顾鸟苷的检测灵敏度，本实验采用鸟苷的最
大紫外吸收 ２５１ ｎｍ 为混合样品的分析检测波长。
虽然在文献［１－３，１４－１５］中采用较多的 ２ 个波长为
２５４ ｎｍ和 ２６０ ｎｍ，但在这两个波长条件下，鸟苷的
灵敏度都偏低，都不利于含有鸟苷的混合物的分离
检测。 在文献［９］中，鸟苷的浓度为尿嘧啶浓度的
１０倍。 虽然通过增大鸟苷浓度可弥补鸟苷吸光度
弱的劣势，但在许多含嘧啶和核苷的天然化合物
中，鸟苷的含量并不大，甚至于是微量的，且由图 １
可知，鸟苷的最大检测波长为 ２５１ ｎｍ，故本文采用
２５１ ｎｍ作为检测波长取代文献的 ２５４ ｎｍ，使其不因
检测波长不适而影响鸟苷的灵敏度。 下文首先改
变流动相为甲醇，并优化流动相中甲醇含量对 ５ 种
嘧啶和核苷分离的影响。
６６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
２􀆰 ２　 流动相中甲醇含量对嘧啶和核苷分离的影响
　 　 考察甲醇含量（梯度洗脱系列 Ｉ）对 ５ 种嘧啶和
核苷分离的影响，结果见图 ２。 由图 ２中条件 １ 和 ２
结果可知：这两个条件下的分离度都很差，如果降
低甲醇浓度，出峰时间略有后移。 降低起始甲醇浓
度（条件 ３），即在 ５ ～ ６ ｍｉｎ 前，降低甲醇浓度，与条
件 １和 ２相比，出峰时间推迟了 ５～６ ｍｉｎ，且分离度
有所改善，这说明降低洗脱液中有机相的浓度，则
出峰时间推迟，且低于 ４０％的有机相浓度能改善分
离度，而有机相浓度高于 ４０％则影响不大。
图 ２　 ５种嘧啶和核苷混合样品的高效液相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｆｉｖｅ ｍｉｘｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｉ⁃１
　 　 进一步细化研究低浓度有机相的影响，结果见
图 ３和表 ２。 综合图 ３和表 ２分析可知：进一步降低
甲醇浓度，分离度、柱效显著提高（条件 ３ 与条件
４）；再降低甲醇浓度（条件 ５），峰 １、２、３出峰时间相
差不大，但峰 ４、５出峰时间有所延迟，峰 １柱效变化
不大，但其他各峰柱效下降 （特别是峰 ２ 下降明
显）。 由条件 ６ 的分离结果可知：继续降低甲醇浓
度，除峰 １柱效有所提高，但其他各峰柱效仍继续降
低。 如此，继续降低甲醇浓度无益，条件 ４较好。 接
着，在条件 ４的基础上提高甲醇起点浓度（条件 ７）
此时发现，出峰时间比条件 ４的情况有所提前，但分
离度和柱效仍不及条件 ４。
图 ３　 嘧啶和核苷混合样品的高效液相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｆ ＨＰＬＣ ａｎｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ
表 ２　 嘧啶和核苷混合样品的色谱峰数据
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｅａｋ ｄａｔａ ｏｆ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ
峰
号
出峰时间 ／ ｍｉｎ 分离度 柱效 ／ ｍ
条件 ３ 条件 ４ 条件 ５ 条件 ６ 条件 ７ 条件 ３ 条件 ４ 条件 ５ 条件 ６ 条件 ７ 条件 ３ 条件 ４ 条件 ５ 条件 ６ 条件 ７
１ １４􀆰 ０ １５􀆰 ４ １４􀆰 ９ １５􀆰 ０ １３􀆰 ５ １􀆰 ２ ７􀆰 ４ ４􀆰 ７ ４􀆰 ０ ４􀆰 ２ － ２６ ４２０ ２７ ４７７ ６３ ６３０ １３ ６５０
２ １４􀆰 ３ ２１􀆰 １ ２１􀆰 １ ２１􀆰 ０ １７􀆰 ５ １􀆰 ５ ３􀆰 １ ３􀆰 ０ ２􀆰 ６ ３􀆰 ３ － ３１ ５６３ １４ ６６７ １０ ４２３ １３ ８６７
３ １４􀆰 ８ ２３􀆰 ８ ２３􀆰 ７ ２４􀆰 ３ ２１􀆰 １ １􀆰 ６ ２􀆰 ６ ３􀆰 １ ３􀆰 ３ ２􀆰 ０ － ４４ ９３３ ４０ ７２３ ２２ ５５０ ２４ ５８３
４ １５􀆰 ６ ２６􀆰 １ ２６􀆰 ９ ２９􀆰 １ ２３􀆰 ４ １􀆰 ９ １􀆰 ８ １􀆰 ７ ２􀆰 ２ １􀆰 ７ － ３４ ３００ ２８ ５６７ １７ ０４３ ２０ ０１０
５ １７􀆰 ４ ２８􀆰 ０ ２８􀆰 ９ ３２􀆰 ８ ２６􀆰 ７ － － － － － － ３５ ０１０ ２７ ２１０ ２０ ２５３ １９ ８０３
７６　 第 ４期 夏　 明等：高聚物高效液相色谱柱分离分析嘧啶和核苷
　 　 综上可得，条件 ４ 的分离结果较好，分离度好、
柱效高，各物质的分离度均大于 １􀆰 ８，且平均柱效可
达３５ ０００ Ｎ ／ ｍ，比文献［９］报道的效果更优。 但从
峰型上看，峰型均有一定程度的拖尾，且 １号峰的峰
旁有个小包杂质（记为“１’”）尚未达到有效分离
（分离度达到 １􀆰 ５及以上称为有效分离）。 因此，需
进一步对分离条件进行优化（梯度洗脱系列 ＩＩ），其
优化条件及结果见图 ４和表 ３。
图 ４　 嘧啶和核苷混合样品的高效液相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｔｈｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｆ ＨＰＬＣ ａｎｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ
　 　 由图 ４和表 ３可知：在条件 ４的基础上，降低甲
醇浓度且改进洗脱方式（条件 ８），分离度相当，但柱
效进一步上升。 与条件 ８相比，降低 ５ ｍｉｎ 以后的甲
醇浓度（条件 ９），虽峰 １、２ 和 ３ 的出峰时间相差不
大，且峰 ４ 和 ５ 略有延迟，但分离度及柱效皆升高。
提高 ０～５ ｍｉｎ 时的甲醇浓度（条件 １０），峰 １ 出峰时
间提前，且峰 ２、３、４和 ５ 略有延迟，但柱效降低（４、５
号峰分别降低 ３２％、２４％）。 综合图 ３（表 ２）和图 ４
（表 ３）结果可知，经条件 ９分段洗脱后，５种核苷混合
物分离度的平均值大于 ２􀆰 ７８，即均已超过基线分离所
要求的 １􀆰 ５；平均柱效大于 ３７ ４００ Ｎ ／ ｍ，比使用常规
硅胶色谱柱的柱效（２１ ４００ Ｎ ／ ｍ） ［９］约高出 ５８％。 与
文献［９］方法比较可知，本文流动相组成中不含盐类
物质、洗脱梯度简单、且灵敏度高，可用于今后嘧啶和
核苷等碱性化合物的分离与分析。 此外，本实验采用
的高聚物型色谱柱材料具有耐酸碱等结构及性能稳
定的特点［１１－１３］，有益于检测结果的可重复性，分离嘧
啶和核苷等碱性物质优于硅胶型色谱填料。
表 ３　 嘧啶和核苷混合样品的色谱峰数据
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｅａｋ ｄａｔａ ｏｆ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ
峰
号
出峰时间 ／ ｍｉｎ 分离度 柱效 ／ ｍ 对称性
条件 ４ 条件 ８ 条件 ９ 条件 １０ 条件 ４条件 ８条件 ９条件 １０条件 ４ 条件 ８ 条件 ９ 条件 １０ 条件 ４条件 ８条件 ９条件 １０
１ １５􀆰 ４ １６􀆰 ４５ １６􀆰 ４５ １４􀆰 ５０ ２􀆰 ６ ２􀆰 ４５ ２􀆰 ５４ ２􀆰 ３６ ２６ ４２０ １９ ８９０ ２０ ９３０ １３ ２４３ ２􀆰 ０９ １􀆰 ７９ １􀆰 ７５ １􀆰 ７６
１’ １７􀆰 ３ １８􀆰 ９１ １８􀆰 ６０ １７􀆰 １３ ４􀆰 ８ ４􀆰 ３９ ４􀆰 ６９ ５􀆰 ７９ ８ ４４７ １４ １８０ １５ ６８０ ８ ９３０ １􀆰 ６１ ２􀆰 ３２ １􀆰 ５７ １􀆰 ５２
２ ２１􀆰 １ ２３􀆰 ３６ ２３􀆰 ５２ ２４􀆰 ００ ３􀆰 １ ２􀆰 ４９ ２􀆰 ５５ １􀆰 ９８ ３１ ５６３ ３８ ２８０ ３８ ５７７ ２７ ５６３ ２􀆰 ５１ １􀆰 ９１ １􀆰 ９０ １􀆰 ８９
３ ２３􀆰 ８ ２５􀆰 ５５ ２５􀆰 ７７ ２６􀆰 ０９ ２􀆰 ６ ２􀆰 ２５ ２􀆰 ４２ ３􀆰 ０３ ４４ ９３３ ４３ ３２０ ４３ ６４０ ３２ ６５３ ２􀆰 ２１ １􀆰 ８８ １􀆰 ７３ １􀆰 ９０
４ ２６􀆰 １ ２７􀆰 ７２ ２８􀆰 ０８ ２９􀆰 ６４ １􀆰 ８ １􀆰 ６１ １􀆰 ７２ ２􀆰 ０２ ３４ ３００ ３８ ３６３ ４１ ３６３ ２７ ７９７ １􀆰 ９０ １􀆰 ８２ １􀆰 ６７ １􀆰 ７６
５ ２８􀆰 ０ ２９􀆰 ４２ ２９􀆰 ８５ ３２􀆰 ２６ — — — — ３５ ０１０ ４０ ２７３ ４２ ８６７ ３２ ５１３ １􀆰 ９９ １􀆰 ７６ １􀆰 ８１ １􀆰 ７８
２􀆰 ３　 ５种嘧啶和核苷的定性分析
采用条件 ９对 ５种嘧啶和核苷标准品的混合样
和质量浓度均为 ０􀆰 ０５ ｍｇ ／ ｍＬ 的 ５ 种嘧啶和核苷高
效液相色谱标准品进行梯度洗脱，定性分析 ５ 种嘧
啶和核苷混合物，结果见图 ５。
由图 ５ 可知，在相同的色谱条件下，可推断出
混合样品中 １至 ５号峰物质依次为尿嘧啶、鸟苷、胸
腺嘧啶、胸苷和腺苷。 此外，１ 号峰旁的小包（１’）
与腺苷标准品中第一个小峰的出峰时间一致，说明
混合样中的 １’小峰实为腺苷标准品的杂质。
３　 结论
采用化学结构稳定、耐酸碱的高聚物型色谱柱
ＭＫＦ ＲＰ ＨＨ（３００ ｍｍ×７􀆰 ８ ｍｍ，８ μｍ）对 ５种混合
嘧啶和核苷进行了分离条件的探索。 经优化后得到
最佳的色谱条件：流动相为 ＫＨ２ＰＯ４水溶液（Ａ）和甲
８６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
图 ５　 ５种嘧啶和核苷标准品与其混合样的高效液相色谱对比图
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｉｖｅ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｉｘｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ＨＰＬＣ
醇（Ｂ），梯度洗脱（０～５ ｍｉｎ ０～５％Ｂ；５～２５ ｍｉｎ ５％～
４０％Ｂ）；流速为 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ；柱温为 ２０ ℃；检测波长
为 ２５１ ｎｍ。 经最佳梯度条件洗脱后，５种嘧啶和核苷
实现了有效分离，峰型良好且柱效均达到 ３７ ４００
Ｎ ／ ｍ，较文献中柱效高出约 ５８％，灵敏度高，且流动相
洗脱条件也较为简单，说明高聚物型色谱填料分离效
能高，更有利于嘧啶和核苷的分离与分析。
参考文献：
［ １ ］　 ＧＡＮＤＨＩ Ｖ，ＳＡＭＵＥＬＳ Ｄ Ｃ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ
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（责任编辑　 荀志金）
９６　 第 ４期 夏　 明等：高聚物高效液相色谱柱分离分析嘧啶和核苷