全 文 ：第９卷第５期
２０１１年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０５．０１２
收稿日期：２０１１－０３－２５
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）资助项目（２００９ＣＢ７２４７００）
作者简介：魏 淼（１９８４—），男，江苏徐州人，硕士研究生，研究方向：生物化工；李 艳（联系人），讲师，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｙａｎ＠ｎｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
共表达甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶
对大肠杆菌生长及甘油代谢的影响
魏 淼，刘 欢，李 艳，严 明，许 琳
（南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１０００９）
摘 要：考察共表达甘油脱氢酶（ＧｌｄＡ）和二羟丙酮激酶（ＤｈａＫＬＭ）对大肠杆菌生长及甘油代谢的影响。结果表
明：在好氧条件下，共表达甘油脱氢酶及二羟丙酮激酶可以提高大肠杆菌利用甘油合成菌体的效率，利用等量的
甘油，重组菌最高菌密度比对照菌提高了７０％，细胞干质量为３５４ｇ（以每升发酵液计）。在厌氧条件下，仅共
表达甘油脱氢酶并不能促进大肠杆菌的甘油代谢，而同时共表达甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶可以明显提高大肠
杆菌代谢甘油的能力，每克菌体消耗的甘油量提高了４２％，每克干细胞中达１１０８ｇ，代谢产物组成也发生显著
变化，乙酸成为主要产物。这说明共表达ｇｌｄＡ及ｄｈａＫＬＭ基因能有效促进大肠杆菌好氧利用甘油生长及厌氧甘
油代谢的能力。
关键词：二羟丙酮激酶；大肠杆菌；甘油脱氢酶
中图分类号：Ｑ７８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０５－００５９－０６
ＥｆｅｃｔｓｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｇｌｙｃｅｒｏｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎＥ．ｃｏｌｉｂｙｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎＧｌｄＡａｎｄＤｈａＫＬＭ
ＷＥＩＭｉａｏ，ＬＩＵＨｕａｎ，ＬＩＹａｎ，ＹＡＮＭｉｎｇ，ＸＵＬｉｎ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｅｆｅｃｔｓｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｇｌｙｃｅｒｏｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎＥ．ｃｏｌｉｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅａｎｄｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅｋｉｎａｓｅｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅｋｉｎａｓｅｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｃｅｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙ７０％ ｕｎｄｅｒ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥ．ｃｏｌｉｕｎｄｅｒａｎａｅｒｏｂｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｄｒｙｃｅｌｗｅｉｇｈｔ（ＤＣＮ）ｒｅａｃｈｅｄ３５４ｇ／Ｌ．Ｕｎｄｅｒ
ａｎａｅｒｏｂｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｏｎｌｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｗｉｔｈｏｕｔｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅｋｉｎａｓｅｃｏｕｌｄ
ｎｏｔｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｗａｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄｂｙｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅｋｉｎａｓｅｉｎｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔＥ．ｃｏｌｉｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ４２％ ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｗｉｌｄｓｔｒａｉｎ，ａｎｄ１１０８ｇ／ｇＤＣＷｇｌｙｃｅｒｏｌｗａｓｒｅａｃｈｅｄ．
Ｐｒｏｄｕｃｔｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｈａｎｇｅｄｂｙｕｓｉｎｇａｃｅｔａｔｅａｓｔｈｅｍａｊｏｒｐｒｏｄｕｃｔ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅｋｉｎａｓｅ；Ｅ．ｃｏｌｉ；ｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
甘油是生物柴油生产过程中不可避免的副产
物［１－２］。由于生物柴油产业成长快、生产规模增大，
造成甘油的大量积累，对传统甘油产业产生冲击，也
严重影响了生物柴油产业的经济效益［３］。甘油可以
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通过微生物发酵生产１，３ 丙二醇、丁二酸、二羟基丙
酮、Ｈ２和１，２丙二醇等高附加值化学品
［４－６］。
与传统的发酵 Ｃ源如葡萄糖（ｋ＝４）或木糖
（ｋ＝４）相比，甘油中的碳（ｋ＝４６７）具有更高的还
原性［７］，因此利于厌氧发酵生产丁二酸、醇类等还
原性产品。大肠杆菌具有遗传背景清晰、基因操作
简单、生产条件易于控制等优点，可用其构建甘油
厌氧发酵平台。
本研究通过构建表达大肠杆菌厌氧甘油代谢
途径上的甘油脱氢酶基因（ｇｌｄＡ）的重组大肠杆菌
Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ），和共表达甘油脱氢酶基因及二
羟丙酮激酶基因（ｄｈａＫＬＭ）的重组大肠杆菌 Ｗ３１１０
（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ），考察过表达这２个关键酶对大
肠杆菌在厌氧条件下以甘油为 Ｃ源的培养基中生
长及甘油代谢的影响，为利用大肠杆菌厌氧发酵生
产有机酸等高附加值化学品奠定初步基础。
１ 材料与方法
１１ 菌株和质粒
大肠杆菌 ＤＨ５α、Ｗ３１１０和质粒 ｐＴｒｃ９９Ａ由笔
者所在实验室保藏，克隆载体 ｐＭＤ１８Ｔ购自 ＴａＫａ
Ｒａ公司。
１２ 培养基
种子液采用 ＬＢ培养基（ｇ／Ｌ）：胰蛋白胨１０、酵
母粉 ５、ＮａＣｌ１０。
好氧发酵培养基（ｇ／Ｌ）：胰蛋白胨 １０、酵母粉
５、ＮａＣｌ１０、甘油２０。
厌氧发酵培养基（ｇ／Ｌ）：ＮＨ４Ｃｌ０５、ＭｇＣｌ２
００５、Ｋ２ＳＯ４００５、ＦｅＳＯ４０００３、ＮａＣｌ３、ＭＯＰＳ８３７、
Ｔｒｉｃｉｎｅ０７２、微量元素溶液、Ｎａ２ＨＰＯ４０３、ＣａＣＯ３
１５、酵母粉 ２、葡萄糖 ０５、乳糖 ２、甘油 ２０。
１０００倍微量元素溶液（ｇ／Ｌ）中含（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２·
２４Ｈ２Ｏ０００４、Ｈ２ＢＯ３００２５、ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ０００７、ＣｕＳＯ４·
５Ｈ２Ｏ０００２、ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ００１６、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０００３。
用ＫＯＨ调ｐＨ至７４。加氨苄青霉素的终质量
浓度为１００ｍｇ／Ｌ［８］。
１３ 主要试剂和仪器
限制性内切酶、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自ＴａＫａＲａ公司。
ＬＡｐｒｏＴａｑＤＮＡ聚合酶购自南京金斯瑞生物科技有
限公司。ＴａｑＤＮＡ聚合酶、质粒小量抽提试剂盒购
自上海申能博彩生物技术有限公司。胶回收试剂
盒购自 Ｂｉｏｍｉｇａ公司。氨苄青霉素、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ
购自ＢＢＩ公司。乙腈购自 ＲＯＥ公司。其他试剂均
为国产试剂纯。高效液相色谱系统购自戴安公司。
１４ 甘油脱氢酶基因 ｇｌｄＡ和二羟丙酮激酶基因
ｄｈａＫＬＭ在Ｅｃｏｌｉ中的克隆与表达
１４１ 重组质粒ｐＴｒｃｇｌｄＡ的构建
根据 ＮＣＢＩ中大肠杆菌 Ｗ３１１０基因组中的 ｇｌ
ｄＡ基因序列设计甘油脱氢酶基因的 ＰＣＲ扩增引
物。上游引物 Ｐ１：５′ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴ
ＧＧＡＣＣＧＣＡ３′；下游引物 Ｐ２：５′ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴ
ＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＧＣＡＧＧＡ３′。
在上下游分别设计了ＸｂａＩ和ＰｓｔＩ酶切位点用
于连接到表达载体 ｐＴｒｃ９９Ａ。以 Ｗ３１１０基因组
ＤＮＡ为模板，用设计的引物 ＰＣＲ扩增 ｇｌｄＡ基因。
所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
扩增条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，
５４℃退火４５ｓ，７２℃延伸９０ｓ，３０个循环；７２℃延
伸１０ｍｉｎ。
所得片段胶回收后与克隆载体 ｐＭＤ１８Ｔ载体
连接，转化入大肠杆菌 ＤＨ５α，挑取阳性转化子。提
取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为ＴｇｌｄＡ，并经测
序验证。测序由上海美吉生物科技有限公司完成。
将ＴｇｌｄＡ用ＸｂａＩ和ＰｓｔＩ进行双酶切，胶回收
ｇｌｄＡ片段，将其与经相同酶切线性化的 ｐＴｒｃ９９Ａ载
体连接，将得到的重组表达载体命名为 ｐＴｒｃｇｌｄＡ。
并将其转化到大肠杆菌 Ｗ３１１０中，筛选出阳性转
化子。
１４２ 重组质粒ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ的构建
根据ＮＣＢＩ中Ｗ３１１０基因组中的ｄｈａＫＬＭ基因
序列设计二羟丙酮激酶基因的 ＰＣＲ扩增引物。上
游引物 Ｐ３：５′ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＣＡ
ＡＴＧＡＴＧ３′；下游引物 Ｐ４：５′ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＣＣ
ＣＴＧＡＣＧＧＴＴＧＡ３′。
在上下游引物上分别设计了ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶
切位点。ＰＣＲ扩增目的基因的延伸时间为 ４５
ｍｉｎ。重组质粒构建和鉴定过程同 １４１。获得的
重组表达载体命名为ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ。
１４３ ＳＤＳＰＡＧＥ电泳
采用５％的浓缩胶及１２％分离胶的不连续垂直平
板电泳进行蛋白分离，考马斯亮蓝 Ｒ ２５０染色［９］。
１４４ 蛋白质含量测定
蛋白质含量的测定采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法［１０］，以牛血
清白蛋白为标准蛋白质。
１４５ 酶活力的测定
甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的活力均采用初
０６ 生 物 加 工 过 程 第９卷
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速度法测定。甘油脱氢酶活力测定体系含有 ０１
ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ甘油、２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２、
１ｍｍｏｌ／ＬＮＡＤ，加入适量粗酶液，在３０℃下反应，
测定３４０ｎｍ处吸光值的变化。甘油脱氢酶活力单
位定义为每分钟还原１μｍｏｌＮＡＤ＋生成 ＮＡＤＨ所
需的酶量为１个单位（Ｕ）。
二羟丙酮激酶活力的测定参照 Ｋｏｒｎｂｅｒｇ的方
法［１１］。二羟丙酮激酶活力单位定义为每分钟氧化
１μｍｏｌＮＡＤＨ生成ＮＡＤ＋所需的酶量为１个单位（Ｕ）。
１５ 重组菌生长特性的初步研究
１５１ 种子液的制备
分别挑取对照菌株 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃ９９Ａ）、重组菌
株Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）和 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）
的单菌落在ＬＢ平板上划线 ３７℃培养１２ｈ，然后接
入装有１００ｍＬＬＢ培养基的５００ｍＬ三角瓶中，在摇
床中３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养过夜。
１５２ 重组菌的好氧培养
分别测量对照菌株 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃ９９Ａ）、重组菌
株Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）和 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）
种子液的菌密度 ＯＤ６００，按发酵初始菌密度 ＯＤ６００＝
００５取相应体积的种子液接入装有１００ｍＬ好氧发
酵培养基的５００ｍＬ三角瓶中，在摇床中３７℃、２００
ｒ／ｍｉｎ培养至ＯＤ６００在０４～０６之间，加入终浓度为
０２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导并转入 ３０℃、２００ｒ／ｍｉｎ培
养，定时测定菌密度。
１５３ 重组菌的厌氧培养
分别测量对照菌株 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃ９９Ａ）、重组菌
株Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）和 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）
种子液的菌密度 ＯＤ６００，按发酵初始菌密度 ＯＤ６００＝
０２取相应体积的种子液收集菌体后接入装有
１００ｍＬ厌氧发酵培养基的１００ｍＬ血清瓶中，在摇
床中３０℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养９６ｈ，定时测定菌密度。
１６ 测定方法
甘油含量测定：采用戴安 Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００高效液
相色谱系统，汉邦ＮＨ２色谱柱，检测器为示差折光检
测器，流动相为Ｖ（乙腈）∶Ｖ（水）＝８０∶２０［１２］。
有机酸含量测定：采用戴安 Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００高效
液相色谱系统，戴安有机酸色谱柱，检测器为示紫
外检测器，检测波长 ２１０ｎｍ，流动相为 ２５ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎａ２ＳＯ４溶液。
生物量测定：取适量发酵液稀释至一定浓度
后，测定ＯＤ６００值。菌体干质量（ＤＣＷ）与 ＯＤ６００之
间的关系为每 ＯＤ６００对应的菌体干质量浓度为
０３７３ｇ／Ｌ［１３］。
２ 结果与讨论
２１ 含甘油脱氢酶基因ｇｌｄＡ重组质粒的构建
以大肠杆菌基因组为模板，利用合成的引物Ｐ１
和Ｐ２进行ＰＣＲ扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩
增片段，扩增的ＤＮＡ片段长约１１ｋｂ。将该片段纯
化和酶切后，插入载体 ｐＴｒｃ９９Ａ的 ＸｂａＩ和 ＰｓｔＩ酶
切位点间。用所构建的重组质粒转化大肠杆菌
ＤＨ５α，转化子涂布于含１００μｇ／ｍＬ氨苄青霉素的
ＬＢ平板，提取阳性重组子质粒。重组质粒经酶切验
证，结果如图１所示，该质粒命名为ｐＴｒｃｇｌｄＡ。
１为ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ１５０００；２为对照质粒ｐＴｒｃ９９Ａ；
３、４为重组质粒ｐＴｒｃｇｌｄＡ；５为ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００
图１ 重组质粒ｐＴｒｃｇｌｄＡ酶切鉴定
Ｆｉｇ．１ ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｌａｓｍｉｄｐＴｒｃｇｌｄＡ
将重组质粒 ｐＴｒｃｇｌｄＡ转化进入大肠杆菌
Ｗ３１１０中，挑取单菌落接入 ＬＢ液体培养基培养，
ＩＰＴＧ诱导后的菌液经超声破碎细胞后，上清液经
ＳＤＳＰＡＧＥ蛋白质电泳分析，结果如图 ２所示。由
图２可知：重组菌的破碎上清液中出现 １条约为
３９×１０４的特异性条带，与理论值３８７×１０４一致。
同时测得重组菌破碎上清液中甘油脱氢酶活性为
１５Ｕ／ｍＬ，而对照菌的破碎上清液中并没有检测到
甘油脱氢酶的活性，说明甘油脱氢酶基因ｇｌｄＡ在重
组菌中已获得成功表达。
２２ 含甘油脱氢酶基因ｇｌｄＡ和二羟丙酮激酶基因
ｄｈａＫＬＭ重组质粒的构建
以大肠杆菌基因组为模板，利用合成的引物Ｐ３
和 Ｐ４进行 ＰＣＲ扩增，通过琼脂糖电泳检测扩增片
段，扩增的ＤＮＡ片段长度约为３２ｋｂ，片段插入载
体ｐＴｒｃｇｌｄＡ并转化入大肠杆菌 ＤＨ５α，转化子涂布
１６ 第５期 魏 淼等：共表达甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶对大肠杆菌生长及甘油代谢的影响
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Ｍ为标准蛋白；１为对照菌Ｗ３１１０；２为重组菌Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）
图２ 重组大肠杆菌Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）细胞的
ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析
Ｆｉｇ．２ ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＧｌｄＡ
于含１００μｇ／ｍＬ氨苄青霉素的 ＬＢ平板，提取阳性
重组子质粒。重组质粒经酶切鉴定，结果如图３所
示，重组质粒命名为ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ。
１为ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ１５０００；２为重组质粒ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ
图３ 重组质粒ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ酶切鉴定
Ｆｉｇ．３ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｌａｓｍｉｄ
ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ
将重组质粒 ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ转化进入大肠杆
菌Ｗ３１１０中，挑取单菌落接入ＬＢ液体培养基培养，
ＩＰＴＧ诱导后的菌液经超声破碎细胞后，上清液经
ＳＤＳＰＡＧＥ蛋白质电泳分析，结果见图４。由图４可
知：重组菌的破碎上清液中出现 ２３×１０４、３９×
１０４、５１×１０４的特异性条带，与理论值２２６４×１０４
（ＤｈａＬ）、３８２２×１０４（ＤｈａＫ）、３８７２×１０４（ＧｌｄＡ）、
５１４６×１０４（ＤｈａＭ）一致，说明 ｇｌｄＡ基因和 ｄｈａＫＬＭ
基因在重组菌中均能过量表达。检测到重组菌的
破碎上清液中甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的活力
分别为 ０３１和 ０３６Ｕ／ｍＬ，酶蛋白的比活力达到
４１７和４８４Ｕ／ｍｇ。而在对照菌的破碎上清液中没
有检测到明显的甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶活力。
Ｍ为标准蛋白；１为Ｗ３１１０（ｐＴｒｃ９９Ａ）；
２为Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）
图４ 重组大肠杆菌Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）细胞的
ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析
Ｆｉｇ．４ ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎＤｈａｋＬＭ ＧｌｄＡ
２３ 重组菌生长及甘油代谢特性
２３１ 好氧生长及甘油代谢特性
图５ ｇｌｄＡ及ｄｈａＫＬＭ基因的表达对
大肠杆菌好氧生长的影响
Ｆｉｇ．５ ＥｆｅｃｔｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｌｄＡａｎｄｄｈａＫＬＭｏｎ
ｇｒｏｗｔｈｏｆＥ．ｃｏｌｉｕｎｄｅｒａｅｒｏｂｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
对重组菌进行好氧发酵实验，以考察共表达甘
油脱氢酶及共表达二羟丙酮激酶对大肠杆菌好氧
生长及甘油代谢的影响，结果如图５和图６所示。
由图５可以看出：仅表达甘油脱氢酶对大肠杆菌好
氧生长没有明显的促进作用，重组菌 Ｗ３１１０
（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）的最高菌密度与对照菌株相差不大；而
共表达甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶可以明显促进
大肠杆菌的生长，重组菌 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）
２６ 生 物 加 工 过 程 第９卷
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的最高菌密度比对照菌株提高接近１倍，ＯＤ６００达到
了９５。
由图 ６可以看出：重组菌 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫ
ＬＭｇｌｄＡ）利用甘油最多，达到２９ｇ／Ｌ，比对照菌株
提高了１７％；而重组菌Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）的甘油利
用量最少，仅为１９ｇ／Ｌ，比对照菌株降低了２０％。
综合图５和图６结果分析，共表达甘油脱氢酶和二
羟丙酮激酶在好氧条件下提高了重组菌利用甘油
合成菌体的效率，在利用等量甘油的情况下，重组
菌Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）的最高菌密度比对照
菌株提高了７０％。
图６ ｇｌｄＡ及ｄｈａＫＬＭ基因的表达对大肠杆菌
好氧甘油利用的影响
Ｆｉｇ．６ ＥｆｅｃｔｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｌｄＡａｎｄｄｈａＫＬＭ
ｏｎｇｌｙｃｅｒｏｌｍｅｔａｂｏｌｉｃｏｆＥ．ｃｏｌｉ
ｕｎｄｅｒａｅｒｏｂｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
２３２ 厌氧生长及甘油代谢特性
对重组菌进行厌氧发酵实验，以考察共表达甘
油脱氢酶及共表达二羟丙酮激酶对大肠杆菌厌氧
生长及甘油代谢的影响，结果见图７～图９。
图７ 基因ｇｌｄＡ和ｄｈａＫＬＭ的表达对
大肠杆菌厌氧生长的影响
Ｆｉｇ．７ ＥｆｅｃｔｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｌｄＡａｎｄｄｈａＫＬＭｏｎｇｒｏｗｔｈ
ｏｆＥ．ｃｏｌｉｂｙｕｎｄｅｒａｎａｅｒｏｂｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
由图７可以看出：在厌氧发酵过程中，共表达甘
油脱氢酶及表达二羟丙酮激酶对于大肠杆菌的生
长均有一定的影响。重组菌Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌ
ｄＡ）的最高菌密度最低，仅为对照菌株的５０％，在厌
氧条件下其生长并没有表现出优势。这一现象可
能存在两方面的原因：其一是由于 ｇｌｄＡ基因和
ｄｈａＫＬＭ基因的共表达消耗了大量的氨基酸和能量
供体，而影响重组菌的菌体合成；其二，甘油经甘油
脱氢酶和二羟丙酮激酶催化生成磷酸二羟丙酮的
速率过快，导致胞内积累的磷酸二羟丙酮进入丙酮
醛代谢途径生成可以显著抑制大肠杆菌生长的
乳醛［１４］。
图８ ｇｌｄＡ及ｄｈａＫＬＭ基因的表达对大肠杆菌
厌氧甘油代谢的影响
Ｆｉｇ．８ ＥｆｅｃｔｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｌｄＡａｎｄｄｈａＫＬＭｏｎｇｌｙｃｅｒｏｌ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃｏｆＥ．ｃｏｌｉｕｎｄｅｒａｎａｅｒｏｂｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
图９ 基因ｇｌｄＡ及ｄｈａＫＬＭ的表达对大肠杆菌
厌氧代谢的影响
Ｆｉｇ．９ ＥｆｅｃｔｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｌｄＡａｎｄｄｈａＫＬＭ
ｏｎｍｅｔａｂｏｌｉｃｏｆＥ．ｃｏｌｉｕｎｄｅｒ
ａｎａｅｒｏｂｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
由图８可以看出：在厌氧条件下，仅共表达甘油
脱氢酶并没有提高大肠杆菌利用甘油的能力，重组菌
Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）利用甘油的能力较弱，每克干菌体
消耗甘油４５４ｇ，仅为对照菌株的５８％；共表达甘油
脱氢酶及二羟丙酮激酶可以明显提高大肠杆菌利用
甘油的能力，重组菌 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）每克
３６ 第５期 魏 淼等：共表达甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶对大肠杆菌生长及甘油代谢的影响
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菌体消耗甘油１１０８ｇ，比对照菌株提高了４２％。在
好氧及厌氧发酵过程中，重组菌Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）的
甘油利用能力均没有得到加强反而有所减弱，原因可
能是重组菌Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）的二羟丙酮激酶活性
不高，导致具有细胞毒性的二羟丙酮被甘油脱氢酶通
过其逆反应被转化成为甘油，从而影响重组菌对甘油
的利用［１５］。
由图９可以看出：厌氧发酵９６ｈ时，对照菌株
的代谢产物中乳酸、乙酸和丁二酸的量分别为
１６１、３８４和０５ｇ／Ｌ；重组菌 Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）和
Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）的代谢产物中乳酸量明
显降低，代谢产物以乙酸为主，其中重组菌 Ｗ３１１０
（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）产酸最多，乳酸、乙酸和丁二酸的量分别
为０１１、６９７和 ０２ｇ／Ｌ，乙酸约占 ９５％；重组菌
Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｄｈａＫＬＭｇｌｄＡ）产酸最少，乳酸、乙酸和
丁二酸的量分别为０２３、１６５和０３５ｇ／Ｌ，乙酸约
占７５％。这可能是由于在厌氧条件下，重组菌需要
通过乙酸合成途径生成更多的 ＡＴＰ以满足蛋白过
量表达和菌体生存的能量需求，从而致使其代谢产
物中乙酸的含量明显增加。进一步分析发现重组
菌Ｗ３１１０（ｐＴｒｃｇｌｄＡ）的产酸量高于甘油消耗量是因
为采用的自诱导培养基中除甘油作为主要 Ｃ源外，
还含有少量乳糖和葡萄糖。
３ 结论
仅共表达甘油脱氢酶并不能促进大肠杆菌在
厌氧条件下代谢甘油的能力。共表达甘油脱氢酶
及二羟丙酮激酶在好氧条件下能明显提高大肠杆
菌利用甘油合成菌体的效率；在厌氧条件下，能提
高大肠杆菌代谢甘油的能力。
在后期工作中可以采用好氧 厌氧两阶段发酵，
提高重组菌的甘油利用效率，并对大肠杆菌的代谢
途径进一步改造，以实现高附加值代谢产物的有效
积累。
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４６ 生 物 加 工 过 程 第９卷
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